Transplantation in die Maus Ovarian Fat Pad

Das übergeordnete Ziel dieses Assays zur Transplantation von Eierstockfettpolstern ist es, Untersuchungen von normalen und transformierten Epithelien des weiblichen Fortpflanzungstrakts in der günstigsten natürlichen Umgebung zu erleichtern. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in diesem Bereich zu beantworten, wie z.B. Differenzierung, regeneratives und neoplastisches Potenzial spezifischer Zellpopulationen des weiblichen Fortpflanzungstrakts. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Eierstockfettpolster der Maus die Transplantation von Zellen und großen Gewebefragmenten ermöglicht.

Es ist für Chirurgie und Bildgebung leicht zugänglich. Die Bauchhöhle und der Schleimbeutel der Eierstöcke werden häufig für die orthotope Transplantation von Epithelzellen des weiblichen Fortpflanzungstraktes verwendet. Diese Methoden weisen eine Reihe von Einschränkungen auf.

Nach der Euthanasation von roten Beta-Aktin-EGFP- oder Beta-Aktin-DS-Mäusen gemäß dem Textprotokoll wird eine einzelne Maus mit der Bauchseite nach oben auf ein saugfähiges Tuch gelegt. Öffnen Sie die Haut, indem Sie einen seitlichen Schnitt in der Mittellinie machen, und ziehen Sie die Haut mit den Fingerspitzen über und unter den Schnitt in Richtung Kopf und Schwanz der Maus. Halten Sie mit einer stumpfen Pinzette das Bauchfell fest und öffnen Sie mit einer feinen Schere die Körperhöhle.

Schieben Sie dann die Spirale des Darms vorsichtig zur Seite und lokalisieren Sie die Fortpflanzungsorgane. Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette ein Gebärmutterhorn und schneiden Sie 0,5 Zentimeter über dem Punkt, an dem sich die Gebärmutterhörner trennen. Während Sie dann das Gebärmutterhorn halten, präparieren Sie das Bindegewebe, das am Gebärmutterhorn, der Gebärmutterröhre, dem Eierstock und dem Eierstockfettpolster befestigt ist.

Legen Sie den präparierten Fortpflanzungstrakt in eine Schale mit sechs Millilitern sterilem PBS und fahren Sie mit dem zweiten Fortpflanzungstrakt fort, bevor Sie primäre Tubenepithelzellen (TE) gemäß dem Textprotokoll kultivieren. Nach dem Präparieren einzelner Uterustuben aus den Gebärmutterhörnern von sechs bis acht Wochen alten jungfräulichen Beta-Aktin-DS-Rotmäusen in PBS gemäß dem Textprotokoll unter einem Präpariermikroskop übertragen Sie einzelne Uterustuben in einen 200-Mikroliter-Tropfen PBS. Wickeln Sie die Eileiter mit einer Pinzette und 28-Gauge-Nadeln vorsichtig ab, indem Sie die Mesosalpinx entfernen, einen Teil des breiten Bandes, das die Segmente der Eileiter stützt.

Legen Sie einzelne, teilweise abgewickelte Uterusschläuche in einen 200-Mikroliter-Tropfen eiskaltes PBS, bis das Eierstockfettpolster der Empfängerin freigelegt und für die Aufnahme der Transplantation vorbereitet ist. Bringen Sie das Tier in eine Biosicherheitswerkstatt, um eine Fettpolstertransplantation durchzuführen. Nachdem Sie eine syngene Maus gemäß dem Textprotokoll anästhesiert haben, rasieren Sie mit der Haarschneidemaschine Nummer 40 einen Bereich, der doppelt so groß ist wie der chirurgische Bereich.

Verwenden Sie Povidon-Jod, gefolgt von 70% Ethanol, um drei chirurgische Peelings durchzuführen. Bewegen Sie das Tier anschließend unter ein Präpariermikroskop. Machen Sie dann mit einem Skalpell einen Schnitt in dorsomedialer Position direkt über dem Eierstockfettpolster und legen Sie den Fortpflanzungstrakt frei.

Decken Sie die Fläche anschließend mit einem sterilen Tuch ab. Ziehen Sie dann mit einer stumpfen, feinen Pinzette das Eierstockfettpolster vorsichtig durch den Einschnitt in Richtung Mittellinie, um die Schädigung der Nerven und der großen Blutgefäße zu minimieren. Um eine Wachstumsverzögerung von Transplantaten zu verhindern, sollte der Schnitt des Fettpolsters so präzise wie möglich erfolgen, da das Reißen oder Durchstechen des Fettpolsters ganz zu Blutungen führt.

Bei Bedarf sollten Gerinnungsmittel verwendet werden, um Blutungen zu stoppen. Verwenden Sie eine abgeschrägte 28-Gauge-Nadel, um einen 2 bis 4 Millimeter tiefen Schnitt in das Fettpolster der Eierstöcke 3 bis 4 Millimeter über dem Eierstock zu machen, und stellen Sie sicher, dass die Nadel nur etwa zur Hälfte durch das Fettpolster geht. Füllen Sie für Zelltransplantationen eine Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel mit 10 bis 20 Mikrolitern des Zell-Basalmembran-Matrix-Gemisches und injizieren Sie es in den Fettpampenschnitt.

Nehmen Sie bei der Transplantation des Gebärmutterkanüls den Eileiter mit einer feinen Pinzette auf und legen Sie ihn in 10 bis 20 Mikroliter Basalmembranmatrix, die auf Eis aufbewahrt wird. Nehmen Sie dann mit einer 0,1 bis 10 bis 20 Mikroliter XL-Verlaufsfilterspitze das Gewebe und die Basalmembran-Matrix-Suspension auf und geben Sie sie in den Fettpolsterschnitt ab. Warten Sie fünf Minuten, bis sich die Basalmembranmatrix verfestigt hat, und platzieren Sie den Fortpflanzungstrakt wieder in das Peritoneum.

Mit zwei Stichen chirurgischer Naht verschließen Sie die Muskeln und verwenden Sie kleine Wundclips oder chirurgische Nähte, um die Haut zu schließen. Lassen Sie das Tier nach der Transplantation gemäß dem Textprotokoll genesen. Um Transplantate zu sammeln und zu konservieren, bereiten Sie eine 4%ige Paraformaldehyd- oder PFA-Lösung her, indem Sie 26 Milliliter doppelt destilliertes Wasser mit vier Millilitern 10X PBS und 10 Millilitern 16%iger PFA-Lösung mischen.

Nachdem Sie das transplantierte Eierstockfettpolster, den Eierstock, den Uteruskanleiter und die Gebärmutter in einem Block präpariert haben, legen Sie das Gewebe sofort in zwei Milliliter 4%iges PFA und fixieren Sie es zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Fixieren und verarbeiten Sie vom selben Tier auf ähnliche Weise das nicht transplantierte kontralaterale Ovarialfettpolster-Kontrolltransplantat. Waschen Sie nach der Fixierung die Tücher dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius in PBS.

Führen Sie die Bildgebung und Histologie des gesamten Mount gemäß dem Textprotokoll durch. In diesem Experiment wurde ein Uteruskanül von einer roten Beta-Aktin-DS-Maus transplantiert und in das Eierstockfettpolster transplantiert, wie in diesem Fluoreszenzbild zu sehen ist. Hier sind Auswüchse von primären Maus-Tubenepithelzellen von Beta-Aktin-EGFP-Mäusen und roten Beta-Aktin-DS-Mäusen acht Tage nach der Transplantation in eine syngene Maus zu sehen.

Dieses Bild zeigt Transplantationen von gemischten HI0118-Zellen, die 10 Tage nach der Transplantation in eine NSG-Maus entweder mit Lenti-eGFP oder Lenti-mCherry markiert wurden. In diesen Panels zeigen die Pfeile ein 43 Tage altes Transplantat aus der Transplantation von gemischten HI0118-Zellen in eine SCID-Maus. In diesem Fluoreszenzbild ist ein vollständiger Uteruskanülen einer roten Beta-Aktin-DS-Maus sechs Tage nach der Transplantation in das Eierstockfettpolster zu sehen.

Ein Gefrierschnitt aus dem fluoreszierenden Fettpolster wird in diesem Panel mit DAPI gegengefärbt. Dieses Transplantat des Uteruskanleiters 40 Tage nach der Transplantation in eine NSG-Empfängermaus zeigt eine vollständige Erhaltung der Bestandteile des Uterusschlauchs und einen Mangel an Fibrose und Entzündungen. Schließlich wurden Schnitte für die Tubenepithelmarker Pax8 und FOXJ1 gefärbt und mit Methylgrün gegengefärbt, um die Konservierung von Flimmerzellen bzw. sekretorischen Zellen zu demonstrieren.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, die chirurgischen Platten, Reagenzien und Instrumente im Voraus vorzubereiten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z. B. intravitale Bildgebung und Injektionen von Krebsmedikamenten, helfen, zusätzliche Fragen wie Krebsentstehung und Wirkung der Krebstherapie zu beantworten.

Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Reproduktionsbiologie und des Eierstockkrebses den Weg, um die normalen Stammzellfunktionen und die Krebsentwicklung im Gewebe des weiblichen Fortpflanzungstrakts zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen und Gebärmutterröhrengewebe isoliert und dann in das Fettpolster transplantiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tieren unter sterilen Bedingungen während der Überlebensoperation äußerst wichtig für ein erfolgreiches Ergebnis ist.

Die Bereitstellung eines Heizkissens, um Nagetiere warm zu halten, verbessert die Überlebensrate erheblich.