Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

Das primäre Ziel der in diesem Videoartikel vorgestellten Methode ist die schnelle Generierung räumlich definierter Zellmuster, um eine räumlich-zeitliche In-situ-Analyse von Zell-zu-Zell-Interaktionen zu ermöglichen. Die vorgestellte Strategie nutzt die mikrofluidische Sondentechnologie. Der mikrofabrizierte Sondenkopf lokalisiert Nanolitervolumina von Biochemikalien auf biologischen Substraten, um Zellmonoschichten zu strukturieren.

Der Hauptvorteil einer MFP-basierten Strukturierungstechnik besteht darin, dass sie aufgrund der lokalen Lyse nahezu augenblicklich erfolgt und eine Echtzeit-Modifikation der zu erzeugenden Muster ermöglicht. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass andere Methoden zur Erzeugung von Zellmustern lange, mehrstufige Protokolle erfordern, bevor sie tatsächlich den Erfolg der Zellmuster sehen. Um stabile Experimente mit einem hydrodynamischen Strömungseinschluss auf einer Zelloberfläche durchführen zu können, müssen die MFP-Parameter optimiert werden.

Zu diesem Zweck ist eine visuelle Demonstration von entscheidender Bedeutung. Aditya Kashyap und Julien Cors werden dieses Verfahren vorführen. Die Betriebsmodule der Plattform bestehen aus motorisierten Spritzen, motorisierten Tischen und einer Steuerung.

Der MFP ist mit einem motorisierten Z-Tisch verbunden, um den Spaltabstand zwischen dem Kopf und dem Substrat zu steuern, und der Substrathalter ist an den motorisierten X- und Y-Tischen befestigt, die das Scansystem bilden. Der MFP-Kopf verfügt über fluidische Durchkontaktierungen zum Anschluss an die Pumpstation, Befestigungslöcher zur Montage des Kopfes auf dem Z-Tisch und Kanäle, die aus dem polierten Scheitelpunkt austreten. Die Spitze ist koplanar zum Zellkultursubstrat gesetzt.

Zur Vorbereitung der Pumpstation und des Fluid-Handling-Geräts sind Spritzen und Spritzenkolben durch Beschallung und 0,5%ige Bleichlösung in Reinstwasser vor und nach Experimenten mit lebenden Zellen zu reinigen. Spülen Sie sie gründlich mit Wasser ab. Füllen Sie die Spritzen mit Wasser, indem Sie die Spitzen vollständig in ein Wasserbad tauchen und mit dem Kolben absaugen.

Spülen Sie die Flüssigkeit, während sie sich im Wasserbad befindet, wobei der Spritzenschaft die Dichtung am Ausgang der Spritze berührt. Saugen und spülen Sie weiter, bis keine Luftblasen mehr in den Spritzensäulen zu sehen sind. Verbinden Sie die gefüllten Spritzen mit den Spritzenpumpen über Lower-Lock-Anschlüsse.

Verwenden Sie das an den Pumpen montierte Schaltventil, um die Flüssigkeit von der Spritze in eine von zwei Kapillaren zu leiten, die entweder zum MFP-Kopf oder zu den Flüssigkeitsbehältern führen. Spülen Sie beide Kapillaren mit Wasser aus den Spritzen mit einer Durchflussrate von etwa 10 bis 50 Mikrolitern pro Minute, je nach Größe der Spritze, bis etwa 10 Mikroliter Wasser in den Spritzen verbleiben. Reinigen Sie den MFP-Kopf fünf Minuten lang durch Beschallung mit Glasreiniger für die Standardreinigung oder 0,5 % Bleiche für eine strenge Reinigung.

Spülen Sie die Kanäle mit Wasser, indem Sie die Spitze in Wasser tauchen und ein Vakuum an die Durchkontaktierungen anlegen. Untersuchen Sie die Kanäle unter einem Stereomikroskop auf mögliche Hindernisse und wiederholen Sie bei Bedarf den vorherigen Schritt. Montieren Sie anschließend den gereinigten Kopf auf die Kopfhalterung und schrauben Sie den Stecker auf den Kopf.

Führen Sie die gespülten Kapillaren in einen geeigneten mikrofluidischen Steckeradapter ein, der mit den Kanaldurchkontaktierungen im Kopf verbunden ist. Schrauben Sie den Kopfhalter an den Z-Tisch, der zur Kontrolle des Spaltabstands zwischen dem Kopf und der Zellmonoschicht verwendet wird, bevor Sie die Endpunktkalibrierung durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Erzielen Sie einen groben Nullspaltabstand, indem Sie den MFP-Kopf über einen Kammerobjektträger ohne Zellen bringen und langsam in Fünf-Mikron-Schritten absinken.

Bei Kontakt der Sonde mit dem Substrat sollten Newtonsche Ringe beobachtet werden. Dies ist eine grobe Schätzung. Eine genaue Position ist nach Anpassung der Koplanarität des Sondenscheitels an das Substrat zu erhalten.

Achten Sie bei der Formung darauf, dass die Newton-Ringe symmetrisch sind. Um die Koplanarität der Sondenspitze zu gewährleisten, stellen Sie die Neigung des Kopfes mit einem Goniometer an der Schnittstelle zwischen dem Kopf und dem Z-Tisch ein. Bewegen Sie den MFP-Kopf 20 Mikrometer vom Substrat weg und stellen Sie die Neigung mit dem Goniometer ein.

Wiederholen Sie den Abstieg, die Nullstellung und die Neigungseinstellung, bis die Newton-Ringe bei Kontakt symmetrisch sind. Wenn Sie die Neigung angepasst haben, stellen Sie die Z-Position, die symmetrische Newton-Ringe erzeugt, auf Null ein. Als nächstes bereiten Sie die Prozessflüssigkeit für den inneren Injektionskanal und die für die äußere Injektion erforderliche Extraktionspufferlösung vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Schließen Sie die Ablassleitung an die Spritzenpumpen an, spülen Sie das restliche Wasser und saugen Sie die entgasten Lösungen mit 40 Mikrolitern pro Minute in die Injektionsspritzen ab, bis die Spritzen voll sind. Dadurch wird eine blasenfreie Befüllung der Spritzen, Konnektoren und Kapillaren gewährleistet. Um die Zellmonoschichten auf Kammerobjektträgern vorzubereiten, werden die Zellen in T-Kolben unter Verwendung von Standard-Zellkulturprotokollen aufgewendet.

Bei Erreichen des Zellkonfluenzes in den Kulturkolben trypsinisieren und sammeln Sie die Zellen. Säen Sie 0,2 Millionen Zellen pro Quadratzentimeter in jeden der Zweikammer-Objektträger für die Strukturierung. Kultivieren Sie die Zellen über 48 Stunden, indem Sie die Zellen in einer der Kammern als Kontrolle für das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit verwenden.

Wenn die Zellkonfluenz auf den Objektträgern der Kammer erreicht ist, inkubieren Sie die Zellen 45 Minuten lang mit 500 Mikrolitern Cell-Tracker-Farbstofflösung in einer Konzentration von 10 Mikromolaren, die in serumfreiem Medium hergestellt wurde. Dies geschieht für die Zellvisualisierung während der Musterbildung. Waschen Sie die markierten Zellen mit PBS, indem Sie jede Kammer vorsichtig mit einer Pipette spülen.

Kultivieren Sie anschließend die Zellen in einem mit Serum angereicherten Medium für die Strukturierungsexperimente. Der hydrodynamische Strömungseinschluss lokalisiert Flüssigkeiten durch gleichzeitige Injektion und Aspiration einer Prozessflüssigkeit. In der hierarchischen Einschlussphase werden mehrere Prozessflüssigkeiten eingeschlossen, wobei das äußere HFC die Probe von dem inneren, das es verarbeitet, abschirmt.

Bewegen Sie den MFP über die Zell-Monoschicht in einem Abstand von 50 Mikrometern zum Objektträger. Dieser Spaltabstand stellt den Kontakt des hierarchischen HFKW sicher und berücksichtigt auch Schwankungen der Oberfläche und Dicke der Monoschicht. Injektion von Natriumhydroxid mit sechs oder acht Mikrolitern pro Minute durch I-two.

Werten Sie andere Durchflussraten anhand der Flussregeln im Textprotokoll aus. Modulieren Sie die Größe des inneren HFKW, indem Sie das Verhältnis der Injektionsflussraten QI-two und QI-one mit den Injektionsspritzen ändern. Verwenden Sie beispielsweise einen QI-one zwischen 1,3 Mikrolitern pro Minute und vier Mikrolitern pro Minute, wobei der QI-two auf acht Mikroliter pro Minute festgelegt ist, um einen Natriumhydroxid-Fußabdruck von 150 bis 300 Zellen zu erzielen.

Injizieren Sie das gesamte Medium aus den äußersten Öffnungen des MFP-Kopfes mit einer Durchflussrate von 20 Mikrolitern pro Minute, um die Verdampfung des Mediums und die Aspiration während des Betriebs des hHFC zu berücksichtigen. Um die Zell-Monolayer zu strukturieren, stellen Sie die Tischsoftware so ein, dass der Sondenkopf über die Zell-Monoschicht in benutzerdefinierten Mustern mit einer Scangeschwindigkeit von 10 Mikrometern pro Sekunde und einem Spaltabstand von 50 Mikrometern gescannt wird. Wenn das verschachtelte hHFC in Betrieb ist und mit der Monoschicht in Kontakt kommt, scannen Sie den MFP mit der Trajektorie des gewünschten Musters, um eine gemusterte Zellentfernung zu bewirken.

Für eine Kokultur nach der ersten Zelltypentnahme säen Sie wie zuvor eine andere Zelllinie, um die Lücken zu füllen. Bereiten Sie die Probenahmestation für die nachgelagerte Analyse des Lysats vor. Hier ist ein Beispiel für eine Probenahmestation zu sehen, die aus einem dreiD-gedruckten PCR-Halter mit acht Streifen besteht.

Wischen Sie den Röhrchenhalter mit 70 % Ethanol oder anderen Oberflächendekontaminationen ab, je nach der für die Anwendung gewünschten Stringenz. Befestigen Sie ihn mit einer magnetischen Klammer am Röhrchenhalter am Substrathalter. Positionieren Sie nach der Vorbereitung der Probenahmestation den MFP-Kopf 100 Mikrometer von der Monoschicht entfernt.

Beginnen Sie den Betrieb des hHFC mit 50 Millimolar Natronlauge als Verarbeitungsflüssigkeit für den inneren Injektionskanal mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Minute für QI-one, sechs Mikrolitern pro Minute für QI-two, minus sieben Mikrolitern pro Minute für QA-one und minus 17,5 Mikrolitern pro Minute für QA-two. Sobald sich der Strömungseinschluss stabilisiert hat, senken Sie den Sondenkopf auf einen Spaltabstand von 50 Mikrometern ab, um eine lokale Lyse auf Natriumhydroxidbasis an der ausgewählten Subpopulation von Zellen mit dem hHFC durchzuführen. Sobald die Lyse der Subpopulation abgeschlossen ist, richten Sie den Kopf auf die Röhrchen in der Probenahmestation.

Werfen Sie das gesammelte Lysat direkt in die PCR-Röhrchen aus. Laden Sie nach der Verarbeitung des Lysats, wie im Textprotokoll beschrieben, das Lysat in einen Standard-qPCR-Workflow, wie vom Lieferanten des Geräts festgelegt. Durch die Steuerung des Verhältnisses der Injektionsflüssigkeiten in der hierarchischen HFKW wird die Größe des Fußabdrucks in Kontakt mit der Zelloberfläche moduliert.

Die Flussraten wurden so gewählt, dass der chemische Effekt und nicht die Scherung der dominierende Mechanismus für die Zelllyse ist. Dies wurde durch die Bestimmung der Scherung mit Hilfe der numerischen Strömungsmechanik bestätigt. Hier ist die Erzeugung eines Gitters von Zellinseln durch Scannen der Trajektorienprogrammierung mit dem MFP dargestellt.

Die Modulation der Footprint-Größe unter Verwendung des Injektionsflüssigkeitsverhältnisses ermöglicht die Kontrolle der Auflösung der Zellentnahme. Diese Methode kann für die sequentielle Kokultur mehrerer Zellpopulationen verwendet werden, wodurch komplexe Muster von Zell-zu-Zell-Interaktionen erzeugt werden. Durch die Verwendung von Natriumhydroxid als Prozessflüssigkeit wird das Lysat mit der PCR-basierten Analyse der Zellen kompatibel.

Hierbei wurde der DNA-Gehalt aus fünf und einem Fußabdruck quantifiziert, lysiert mit der beschriebenen Methode. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 30 Minuten an Zellen durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Kanäle und die Kapillaren frei von Luftblasen sind, da dies das HFKW negativ beeinflussen kann.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumhydroxid, einer ätzenden chemischen Lösung, äußerst gefährlich sein kann und dass bei diesem Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie Schutzbrillen und Laborkittel getroffen werden sollten. Nach diesem Verfahren können wir Zellen lokal durch Immunfärbung oder DNA-RNA-Sequenzierung durch MFP-vermittelte Lyse analysieren, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Proteine aufgrund des geometrischen Einschlusses von Zellen überexprimiert werden. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Molekularbiologie den Weg ebnen, um inter- und extrazelluläre Signale während der Gewebebildung und -degeneration zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie in MFP eingerichtete Zellmonoschichten für die lokale Verarbeitung subtraktiv mustern und komplexe Geometrien von Kokulturen von Zellen herstellen können.