Name: Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung neuronaler Stammzellen durch Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen. Diese effiziente 13-Tage-Methode ermöglicht die Bewertung von NSC-Markern.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung (A * STAR), Singapur, diese Forschung für die Finanzierung.

Die Behandlung von Tieren wurde in Übereinstimmung mit den IACUC und NACLAR Richtlinien und genehmigt durch das Tier - Abteilung ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11) durchgeführt. HINWEIS: Neurosphäre Kulturen wurden aus dem Vorderhirn von embryonalen (e14) C57BL / 6 - Mäusen hergestellt , wie es zuvor 5 beschrieben. 1. Kultur der klonalen Probe Neurosphären (Tag 1) <ol><li> Bereiten Sie NSC Wachstumsmedium von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium / Nährstoff-F-12 (DMEM / F12) mit B27 Ergänzung (Endkonzentration: 1x) kombiniert, EGF (Endkonzentration: 20 ng / ml), bFGF (Endkonzentration: 10 ng / ml) und Penicillin / Streptomycin (Endkonzentration: 1x). </li><li> E14.5 Maus Neurosphären in 1 ml NSC Wachstumsmedium und 1 ml 0,05 N Natriumhydroxid für 7 min bei RT Dissociate. Pipette Zellen nach oben und unten gelegentlich Zellen in Suspension zu halten. 1 ml 0,05 N Salzsäure neutralize die Alkali. HINWEIS: Neurosphäre Zellen bei 20.000 Zellen / ml in einer 10 cm Kulturschale ausgesät und kultiviert werden für 5 d bei 37 ° C, 5% CO 2. Die erwartete Rendite nach ca. 10 Millionen Zellen pro 10 cm Schale. Diese Zellen werden dann dissoziiert und bei klonaler Dichte ausgesät wie in den Schritten 1.2 und 1.3 beschrieben sind. <ol><li> Führen Zellzahl Trypan-Blau-Färbung und unter Verwendung eines Hämozytometers. </li></ol></li><li> Seed E14.5 Maus Neurosphäre Zellen bei einer Dichte von 50 Zellen / ml oder weniger in 100 &amp; mgr; l NSC Wachstumsmedium in einer 96-Well Schale. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 1 w klonalen Neurosphären zu erzeugen. HINWEIS: Klonalität wird während Neurosphärenbildung bei dieser Dichte gewährleistet, da die Zellen nicht in Kontakt miteinander. </li></ol> 2. Kultur von Neurosphären für konditionierte Medium (Tag 3) <ol><li> Distanzieren Neurosphären E14.5 Maus als 1.2 in Schritt beschrieben. </li><li> Seed einzelne Zellen von E14.5 Maus Neurosphären in einer Dichte von 20.000 Zellen / ml in einem 10 ml NSC Wachstumsmedium in einer 10 cm Kulturschale. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 d bulk kultivierten Neurosphären zu erzeugen. </li></ol> 3. Herstellung von Neurosphäre konditioniertem Medium (Tag 8) <ol><li> Bereiten Beschichtungslösung durch Mischen von 700 &amp; mgr; l von 0,01% Poly-L-Lysin (PLL), 70 ul 1 mg / mL Laminin und 6.230 &amp; mgr; l Phosphat-gepufferter Saline (PBS). </li><li> Mantel eine 10 cm Kulturschale mit 7 ml PLL / Laminin-Lösung für 2 h bei 37 ° C. </li><li> Unter Verwendung einer 10 ml serologische Pipette alle bulk kultivierten Neurosphären in ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Neurosphären bei 171 × g für 1 min bei RT und entfernen Sie den Überstand vollständig. </li><li> Bereiten Sie NSC Differenzierungsmedium durch DMEM / F12-Medium kombiniert mit B27 (Endkonzentration: 1x) und fötales Rinderserum (FBS) (Endkonzentration: 0,5%) Add 10 ml NSC Differenzierungsmedium zu Neurosphären. Pipette nach oben und unten ein paar Mal die Neurosphären zu resuspendieren. </li><li> Absaugen PLL / Laminin aus der 10 cm Kulturschale und waschen Sie einmal mit 10 ml PBS. Übertragen alle Neurosphären an die PLL / Laminin-beschichtete 10 cm Kulturschale. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 für die Neurosphären an der Schale haften. </li></ol> 4. Bestimmung der NFU der Probe Neurosphären (Tag 8) <ol><li> Zählen Sie die Anzahl der Neurosphären (an Tag 1 ausgesäten; Abschnitt 1) ​​in jedem gebildeten gut unter dem Mikroskop. HINWEIS: Bestimmen Sie die Anzahl der Neurosphären pro 100 Zellen gebildet zogen, die die NFU gibt. </li></ol> 5. Übertragung der Probe Neurosphären auf 50-Well-Chambered Coverslip (Tag 8) <ol><li> Coat jede Vertiefung einer 50-Well-Kammerdeckglas mit 10 &amp; mgr; l PLL / Laminin Beschichtungslösung für 2 h bei 37 ° C. HINWEIS: Bereiten Beschichtungslösung wie beschrieben inSchritt 3.1. </li><li> Vorbereitung 3 x 50 mL konischen Zentrifugenröhrchen mit 30 ml PBS jeder. Mit einer sterilen Pinzette, entfernen Sie die beschichteten 50-Well-Kammerdeckglas. Tauchen Sie die gekammert Deckglas in das erste Rohr aus PBS, gefolgt von der zweiten und der dritten Röhre PBS zu waschen um die Beschichtungslösung ab. </li><li> Aspirieren alle verbleibenden Flüssigkeit aus den Vertiefungen der gekammert Deckglas. </li><li> Pipette vorsichtig alle Medium und Neurosphären aus jeder Vertiefung der Schale mit 96 Vertiefungen und übertragen sie auf eine einzige 10 cm Kulturschale. </li><li> Unter einem Mikroskop, um eine Probe Neurosphere wählen Sie ein P10 Mikropipette mit einer 10 &amp; mgr; l-Pipettenspitze angebracht werden. Stellen Sie sicher, dass nur ein einziger Neurosphere wird jedes Mal, aufgenommen durch die Pipette Spalte auf 2 &amp; mgr; l zu setzen. Verwenden Sie für jede Neurosphere einer neuen Pipettenspitze. </li><li> Übertragen Sie die Neurosphere auf die Mitte eine Vertiefung der beschichteten 50-Well-Kammerdeckglas. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.5 und 5.6 bis jede Vertiefung der chambered Deck contaIns A Neurosphere. HINWEIS: Die Neurosphären unter einem Mikroskop werden in einer laminaren Strömungshaube oder auf einer Benchtop platziert kommissioniert. </li><li> Fügen Sie 10 &amp; mgr; l NSC Differenzierungsmedium zu jeder Vertiefung der gekammerten Deckglas. Platzieren Sie die gekammert Deckglas in eine 10 cm Kulturschale und Pipette PBS entlang der Ränder der Schale Trocknung des NSC Differenzierungsmedium zu verhindern. Legen Sie bis zu zwei Kammern Deckgläser in einer 10 cm Kulturschale. Inkubieren der gekammert Deckglas (in 10 cm Kulturschale enthalten ist ) über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 6. Differenzierung der Probe Neurosphären (Tag 9) <ol><li> Übertragen Sie das Differenzierungsmedium von den Massen kultivierten Neurosphären (aus dem Abschnitt 3) zu einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Sicherzustellen, dass 2-3 ml Differenzierungsmedium in der Kulturschale bleibt adhärierten Zellen zu verhindern, gelöst wird. Unter Verwendung einer 20 ml sterile Spritze, vorbei an der Differenzierungsmedium durch ein 0,2 μm Filter alle Zellen oder Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie die gefilterten Differenzierungsmedium zurück in die 10 cm Kulturschale der anhaftenden Zellen enthält. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie vorsichtig die chambered Deck auf das Differenzierungsmedium in einer umgekehrten Art und Weise, so dass die Probe Neurosphären nach unten zeigen. Inkubieren der gekammert Deck mit dem Differenzierungsmedium für 3 d bei 37 ° C, 5% CO 2. HINWEIS: Die Probe Neurosphären in Kontakt mit dem Differenzierungsmedium sind, aber nicht in Kontakt mit den differenzierenden Zellen unter. </li></ol> 7. Befestigung von Differentiated Neurosphären (Tag 12) <ol><li> Das Kammerdeckglas aus dem 10 cm Kulturschale mit einer sterilen Pinzette vorsichtig entfernen. Tauchen Sie vorsichtig das Deckglas in PBS das konditionierte Medium zu waschen. </li><li> Ziehen Sie die Silikondichtung aus dem Deckglas ab. Führen Sie diese vorsichtig und langsam zu brechen das Deckglas zu vermeiden. Beachten Sie die Seite, wo the differenzierten Neurosphären eingehalten werden. </li><li> Pipette 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) auf ein Stück eines Paraffinfilm geschnitten, um die Größe des Deckglases. Sanft legen Sie die Deck auf dem Paraffinfilm mit den nach unten in Kontakt mit dem PFA gegenüber Neurosphären. Befestigen Sie die Neurosphären für 20 min bei RT. Achtung: PFA ist giftig sowohl in flüssiger und Dampfform und ist brennbar. Vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen und Kontakt mit Haut und Augen. Fassen Sie PFA in einem gut belüfteten Abzug durchführen. </li><li> Pipette 1 ml PBS auf ein Stück Paraffinfilm. Waschen Sie die Neurosphären durch vorsichtiges das Deckglas mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit PBS für 10 min bei Raumtemperatur platziert. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 7.4 zwei weitere Male. </li></ol> 8. O4 Anfärbung von Differentiated Neurosphären (Tag 12) <ol><li> Vorbereitung 3% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. Pipette 1 ml 3% BSA auf ein Stück Paraffinfilm. Blockieren Sie die Neurosphären durch sanft Placing das Deckglas (mit den Neurosphären nach unten) für 30 min bei RT mit der BSA in Kontakt. </li><li> Pipette 1 ml Maus-anti-O4 IgM-Antikörper (1: 300 Verdünnung in 3% BSA) auf ein Stück eines Paraffinfilm und legen das Deckglas auf den Paraffinfilm mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit dem Antikörper. Erlauben O4 Färbung für 2 h bei RT auftreten. </li><li> Waschen Sie die Deck zweimal mit PBS, wie in Schritt 7.4 beschrieben. </li><li> Pipette 1 ml grün fluoreszierenden Farbstoff konjugiert-anti-Maus-IgM sekundärem Antikörper (1: 500-Verdünnung in 3% BSA) auf ein Stück eines Paraffinfilm und legen das Deckglas auf den Paraffinfilm mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit dem Antikörper . Lassen für 1 h bei RT im Dunkeln. HINWEIS: Führen Sie die Immunfärbung in einer dunklen Umgebung von diesem Schritt ab. </li><li> Waschen Sie die Deck zweimal mit PBS, wie in Schritt 7.4 beschrieben. </li></ol> 9. TuJ1 und sauren Gliafaserproteins (GFAP) Färbungvon Differentiated Neurosphären (Tag 12) <ol><li> Bereiten Lösung durchdringbar durch Zugabe von Triton-X 100 (Endkonzentration: 0,5%) auf das 3% BSA. Pipette 1 ml Lösung auf ein Stück Paraffinfilm durchdringbar. Deckglas auf den Paraffinfilm mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit der permeabilisierenden Lösung für 20 min bei RT. </li><li> Waschen Sie die Deck zweimal mit PBS, wie in Schritt 7.4 beschrieben. </li><li> Pipette 1 ml Maus - anti-TuJ1 IgG2a - Antikörper (1: 500 Verdünnung in 3% BSA) und Kaninchen - Anti-GFAP - IgG - Antikörper (1: 1000 Verdünnung in 3% BSA) auf ein Stück eines Paraffinfilms und Eindecken auf der Paraffinfilm mit den einander zugewandten Neurosphären nach unten mit den Antikörpern in Kontakt. Erlauben TuJ1 und GFAP-Färbung für 2 h bei RT auftreten. HINWEIS: Die beiden Antikörper können als eine einzige Lösung hergestellt werden. </li><li> Waschen Sie die Deck zweimal mit PBS, wie in Schritt 7.4 beschrieben. </li><li> Pipette 1 ml roten Fluoreszenzfarbstoffkonjugiert-anti-Maus - IgG 2a (1: 500 - Verdünnung in 3% BSA) und fern roten Fluoreszenzfarbstoff konjugiert-anti-Kaninchen - IgG (1: 500 Verdünnung in 3% BSA) Sekundärantikörper auf ein Stück Paraffinfilm und Ort Deckglas auf den Paraffinfilm mit den einander zugewandten Neurosphären nach unten mit den Antikörpern in Kontakt. Lassen für 1 h bei RT. HINWEIS: Die beiden Antikörper können als eine einzige Lösung hergestellt werden. </li><li> Waschen Sie die Deck zweimal mit PBS, wie in Schritt 7.4 beschrieben. </li><li> Verdünne 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Stammlösung zu 300 nM in PBS. Pipette 1 ml DAPI auf ein Stück Paraffinfilm und Eindecken auf dem Paraffinfilm mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit DAPI für 2 min bei RT für Kerne Färbung. </li><li> Waschen Sie die Deck einmal mit PBS und zweimal mit deionisiertem Wasser, wie in Schritt 7.4 beschrieben. Montieren Sie das Deckglas auf einem Glasträger eine geeignete Montagemedium verwendet und erlauben O / N bei RT trocknen. </li></ol> 10. Imaging von Differentiated Neurosphären (Tag 13) <ol><li> Bild Neurosphären unter einem konfokalen Mikroskop ein 40X verwenden. Verwenden Sie die Laser bei 488 nm, 594 nm und 647 nm zu Oligodendrozyten, Neuronen und Astrozyten erkennen sind. </li><li> Bestimmen Sie den Prozentsatz der unipotent, bipotent und tripotent Neurosphären. HINWEIS: Potency wird durch die Fähigkeit des Neurosphäre bestimmt , in die drei neuralen Abstammungslinien zu differenzieren - Oligodendrocyten, Neuronen und Astrozyten 5,14,15,26. Oligodendrozyten sind durch positive Färbung für O4 (§ 8) identifiziert. Neurone sind durch positive Färbung für TuJ1 (Abschnitt 9) identifiziert. Astrozyten sind durch positive Färbung für GFAP (Abschnitt 9) identifiziert. Ein unipotent Neurosphere differenziert sich in nur einer der Abstammung und positiv für entweder O4, GFAP oder TuJ1 Fleck sollte. Ein bipotent Neurosphere differenziert sich in zwei beliebigen Linien und sollte für O4 und GFAP oder O4 und TuJ1 oder GFAP und TuJ1 positiv färben. Ein tripotent Neurosphere verschiedeneiates in allen drei Linien und sollte positiv für O4, GFAP und TuJ1 färben. </li><li> Bestimmen Sie NSC Häufigkeit in der Bevölkerung von Interesse durch die folgende Formel: NSC-Frequenz = (NFU x% tripotent Neurosphären) / 100%. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The culture of neural stem cells.</a> J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).</li>
<li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+Population+Analyses+Demonstrate+That+an+EGF-Responsive+Mammalian+Embryonic+CNS+Precursor+Is+a+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell.</a> Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).</li>
<li>Narayanan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+mRNA+Profiling+Identifies+Progenitor+Subclasses+in+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres.</a> Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+human+central+nervous+system+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of human central nervous system stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).</li>
<li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LeX%2Fssea-1+Is+Expressed+by+Adult+Mouse+CNS+Stem+Cells%2C+Identifying+Them+as+Nonependymal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal.</a> Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).</li>
<li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LeX+is+expressed+by+principle+progenitor+cells+in+the+embryonic+nervous+system%2C+is+secreted+into+their+environment+and+binds+Wnt-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1.</a> Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).</li>
<li>Corti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+neural+stem%2Fprogenitor+cells+based+on+Prominin-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression.</a> Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).</li>
<li>Nagato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+characterization+of+neural+stem+cells+by+flow+cytometry+analysis+using+a+combination+of+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers.</a> J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).</li>
<li>Kim, M., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Populations+of+Forebrain+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+Can+Be+Isolated+Using+Side-Population+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis.</a> J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).</li>
<li>Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+neural+stem+cells+in+the+developing+and+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain.</a> J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).</li>
<li>Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+pluripotent+neural+stem+cell+from+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain.</a> Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).</li>
<li>Tham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSPG+Is+a+Secreted+Factor+that+Stimulates+Neural+Stem+Cell+Survival+Possibly+by+Enhanced+EGFR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling.</a> PLoS ONE. 5 (12), e15341(2010).</li>
<li>Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ApoE+as+an+autocrine%2Fparacrine+factor+that+stimulates+neural+stem+cell+survival+via+MAPK%2FERK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway.</a> J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).</li>
<li>Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+survival+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell survival factors.</a> Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).</li>
<li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+neural+stem+cell+self-renewal%2C+growth+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation.</a> Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Neural+Stem+Cells+Reside+into+the+Rostral+Extension+and+Olfactory+Bulb+of+Adult+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents.</a> J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+and+Fibroblast+Growth+Factors+Behave+as+Mitogenic+Regulators+for+a+Single+Multipotent+Stem+Cell-Like+Population+from+the+Subventricular+Region+of+the+Adult+Mouse+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).</li>
<li>Vescovi, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cloning+of+multipotential+stem+cells+from+the+embryonic+human+CNS+and+establishment+of+transplantable+human+neural+stem+cell+lines+by+epigenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation.</a> Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).</li>
<li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural-Colony+Forming+Cell+Assay%3A+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (49), e2639(2011).</li>
<li>Louis, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony-Forming+Cell+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observational+examination+of+aggregation+and+migration+during+early+phase+of+neurosphere+culture+of+mouse+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells.</a> J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li>
<li>Yu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+Visualization%2C+and+Molecular+Signature+of+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells.</a> Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).</li>
<li>Yu, Y. H. C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYu%2C+YH+%22Identification+of+mouse+embryonic+neural+stem+cell+surface+markers%22">Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers</a>. , Chapter 3.5, Figure 3.17 (2012).</li>
<li>Tham, M. Neural colony-forming cell assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTham%2C+M+%22A+role+for+chondroitin+sulfate+proteoglycan+in+regulating+the+survival+and+growth+of+neural+stem+cells%22">A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells</a>. , Chapter 3.6.3, Figure 3.22A (2009).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Surface+Marker+Signatures+for+the+Isolation+of+Neural+Stem+Cells%2C+Glia+and+Neurons+Derived+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Are+Markers+of+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells.</a> Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Wir beschreiben hee die Aufzählung von NSCs unter klonalen Bedingungen. Kritische Schritte umfassen die Verwendung von frischen NSC Wachstums- und Differenzierungsmedium und auch die Verwendung von frisch hergestelltem PLL / Laminin-Lösung zur Beschichtung der gekammert Deckgläser sowie die Kulturschalen. Dies sorgt für eine optimale Wachstum und die Differenzierung Bedingungen der Neurosphären. Die Verwendung von guter Qualität Antikörper effektiv die Neuronen und Glia erkennen, sowie die selektive Kommissionieren von klonalen Neurosphären, die nicht in Kontakt mit anderen Neurosphären sind, sind kritisch. Darüber hinaus ist es wichtig, die gepflückt Neurosphären, um sicherzustellen, nicht austrocknen. Es wird empfohlen, nach der Ernte alle 10 Neurosphären in jede Vertiefung 10 &amp; mgr; l Differenzierungsmedium hinzuzufügen. Es ist wichtig, pro Probe ein chambered Deckglas in einem 10-cm-Schale zu verwenden, Übersprechen zwischen Neurosphären aus verschiedenen Proben zu vermeiden. Wenn zwei Deckgläser (mit jeweils Neurosphären aus unterschiedlichen Proben) sind in der platziertgleichen 10 cm Schüssel, Neurosphären aus einem Deckglas könnte Release Faktoren, die die Neigung der Neurosphären in der anderen Deck in bestimmte Abstammungslinien zu unterscheiden verändern können. Zwei Deckgläser in der gleichen 10-cm-Schale kann auch zwischen den Proben in Verwechslung führen. Im Fall erwartet die NFU oder die NSC Frequenz niedriger als sicher, dass niedrige Passage-Nummer Neurosphären verwendet werden. Es ist auch wichtig, dass gesunde niedrige Durchgang Neurosphären zur Erzeugung konditioniertem Medium verwendet werden. Als nächstes, wenn die Neurosphären in Brunnen mit kleinem Durchmesser kultiviert werden, wie zum Beispiel in 96-Well-Platte, dann wird es schwierig sein, Neurosphären mit einer Mikropipette zu manövrieren und pflücken. In diesem Fall übertragen die Neurosphären zu einem größeren Kulturschale, wie eine 6-Well-Platte vor der Kommissionierung. Einige der aufgenommenen Neurosphären können aus der Kammerdeckglas während der Kultur und Immunfärbung abheben. Die Minimierung der Bewegung des Kammerdeckglas während der Kultur und weniger intensive Waschwährend Immunfärbung ing, würde dazu beitragen, Ablösung von Neurosphären zu vermeiden. Erste Studien NSCs nur die NFA 7,11,13 mit quantifiziert. Allerdings überschätzt die NFA die NSC Frequenz als beide NSCs und frühen NPs Neurosphären 5 erzeugen. Louis et al. Eine andere Methode entwickelt NSCs zu quantifizieren als NCFCA 21,22 bekannt. Die NCFCA beinhaltet das Züchten einzelne Zellen in einer Kollagen-basierten Matrix Klonalität zu gewährleisten, und es war, dass nur durch NSCs gebildet Neurosphären oberhalb von 2 mm Durchmesser gezeigt. Ähnlich wie bei der NCFCA, Klonalität wird in diesem Protokoll gewährleistet. Dies wird erreicht durch Neurosphären bei klonaler Dichte und Differenzieren der Neurosphären in gekammert Deck erzeugen. Die Verwendung von gekammerten Deck verleiht eine Anzahl von Vorteilen. Das Kammerdeckglas erlaubt jede Probe Neurosphere ohne physischen Kontakt mit anderen Probe Neurosphären zu unterscheiden, wodurch Klonalität während der Differenzierung zu gewährleisten.Das Kammerdeckglas kann auf dem Differenzierungsmedium suspendiert platziert sein, die Probe Neurosphären zu erlauben, kontinuierlich und maximale Differenzierung zu konditionierenden sicherzustellen. In Abwesenheit von konditioniertem Medium und Serum während der Differenzierung, Überleben der Neurosphären abnimmt und die Neurosphären meist Astrozyten (Tham M und Ahmed S, nicht veröffentlicht) erzeugen. Darüber hinaus können die immunogefärbten Neurosphären bequem für längere Zeit und die gekammert Deck gespeichert werden können, direkt auf den Mikroskop-Objektträger aus Glas angebracht werden. Zusätzlich Abbildung der immunogefärbten Neurosphären leicht gemacht, wie man schnell die Neurosphären in dem kleinen gut chambered finden können, ein Bild aufzunehmen, und zum nächsten gut zu bewegen. Wir haben die NSC Frequenz in E14.5 Maus Neurosphere Kultur bestimmt sowohl das Protokoll in diesem Manuskript beschrieben unter Verwendung von 27 und 28 NCFCA. Die Frequenz NSC in E14.5 Maus sowohl von mir bestimmt Neurosphärenthoden sind vergleichbar. Die NCFCA aufzählt NSCs, die multi- und haben langfristige Selbsterneuerungsfähigkeit. Da die NSC Frequenz von unserem Verfahren, wie das von NCFCA vergleichbar ist, scheint das Auslesen von unserem Protokoll nicht die NSC Frequenz zu überschätzen. Die NCFCA erfordert drei Wochen abgeschlossen sein und in erster Linie beinhaltet Zelle Plattierung und mittlere Nachschub. Das hier beschriebene Protokoll erfordert 13 Tage durchzuführen und beinhaltet eine andere Reihe von Schritten, zum Beispiel Neurosphere Kommissionierung und Immunfärbung. Dieses Protokoll kann als alternative Methode dienen NSCs aufzuzählen. Die Forscher können sowohl NCFCA und dieses Protokoll verwenden NSC Frequenz in ihren Proben zu überprüfen. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist es, dass eine Reihe von wichtigen Schritte sind alle am Tag 8. Die Herstellung des konditionierten Mediums, Bestimmung der NFU Probenneurosphären durchgeführt werden, und die Übertragung von Probe Neurosphären bis zum 50-Well-Kammerdeckglas sein müssen auf da durchgeführty 8. Man könnte einige Zeit dauern, um diese Schritte auszuführen. Darüber hinaus erfordert es Praxis, diese Schritte in einer effizienten Weise durchzuführen. Neurosphären wurden zu untersuchen NSC Funktion und Verhalten weit verbreitet. Allerdings bestehen Neurosphären sowohl von NSCs und NPS. Daher ist es wichtig, NSCs von Neurosphären zu bereichern NSC Biologie zu studieren. Derzeit Zelloberflächenmarker, Farbstoffausschluss Eigentum sowie Zellgröße und Granularität verwendet wurden für NSCs 6,7,9-13,29,30 zu bereichern. Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um die Anreicherung von NSCs durch potentielle NSC Marker zu quantifizieren und die Suche nach einem endgültigen NSC Marker zu erleichtern. Vier neue Studien haben dieses Protokoll verwendet NSC Frequenz 5,14,15,26 aufzuzählen.

Neurale Stammzellen (NSC) sind Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS), die selbst erneuern können und multipotent. NSC werden zunächst während der Entwicklung der embryonalen Vorderhirns spezifiziert und weiterhin im erwachsenen Gehirn an bestimmten Regionen wie die Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel und Gyrus dentatus (DG) des Hippocampus zu persistieren. Eine Reihe von NSC Linien werden in klinischen Studien zur Behandlung von Schlaganfall und anderen neurologischen Erkrankungen wie Batten-Krankheit 1 verwendet. NSCs und neuronale Vorläuferzellen (NPs) in Kultur als Floating-3-dimensionalen Sphäroid Strukturen genannt Neurosphären propagiert. Die Neurosphären Kultursystem wurde von Reynolds und Weiss in den frühen 1990er Jahren entwickelt, wenn sie festgestellt , dass embryonalen und adulten Rindenzellen in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und basischem Fibroblasten - Wachstumsfaktor (bFGF) 2-4 dividieren kann. Neurosphären bestehen aus einer heterogenen Mischung aus cells bestehend aus Unterklassen in verschiedenen Entwicklungsstadien 5. Es ist eine Herausforderung, speziell NSCs zu studieren unter Verwendung von Neurosphären erhaltenen Daten aufgrund der Anwesenheit von Nanopartikeln. Daher ist es von entscheidender Bedeutung NSCs von Neurosphären zu bereichern. Derzeit sind vier Hauptmethoden verwendet worden für NSCs in vitro zu bereichern. Erstens ist die Verwendung von Zelloberflächenmarkern. Lewis-X (lex) und CD133 (auch als Prominin1 bekannt) sind die prominentesten Zelloberfläche NSC 6-9 Marker. Syndecan-1, Notch-1 und Integrin-Beta1 sind andere Oberflächenproteine , die für die NSCs 10 bereichern. Zweitens ist der Farbstoff Ausgrenzung. Es hat sich gezeigt , daß die Seitenpopulation Zellen, die die einzigartige Fähigkeit , die fluoreszierende DNA-bindende Farbstoff Hoechst 33342, abzupumpen haben für NSC 11 angereichert. Drittens ist die Verwendung von morphologischen Selektion. Es wurde gezeigt , dass Zellen mit einem erhöhten Zellgröße und Granularität mehr NSC beherbergen als ihre Pendants 5,12,13. Viertens ist die Zugabe von NSC survival Faktoren zu dem Kulturmedium. Es wurde gefunden , dass Zugabe von Chondroitinsulfat - Proteoglykan gezeigt und Apolipoprotein E verbessert NSC Überleben und erhöht somit NSC Frequenz 14,15. Obwohl viele Markierungen einschließlich Transkriptionsfaktoren mit NSC 16,17 keiner dieser Marker sind in der Lage zu bereichern NSC Reinheit verbunden. Aufgrund der fehlenden endgültigen NSC Marker, bleibt es eine Herausforderung , NSCs zu quantifizieren und sie von NPs in vitro zu unterscheiden. Erste Untersuchungen verwendet , um die Neurosphärenbildungstest (NFA) NSCs 7,11,13 zu quantifizieren. In diesem Test werden dissoziierten Zellen kultiviert Neurosphären und die Anzahl der Neurosphären pro 100 Zellen erzeugt zu bilden bestimmt plattiert ist. Dieser Wert wird als der Neurosphäre Formation Unit (NFU) bezeichnet. Der NFU gleich der NSC Frequenz, wenn alle Neurosphären von NSCs entstehen. Es wurde jedoch gezeigt, dass der NFU die NSC Frequenz überschätzt als Neurosphären von beiden NS gebildet werdenCs und frühen NPs 5. Somit ist es ungenau NSCs aufzuzählen ausschließlich basierend auf Neurosphere Bildung. Es könnte möglich sein, NSC auf auf der Basis ihrer Fähigkeit zur Quantifizierung selbst zu erneuern, proliferieren und umfassend multiNeuroSphären zu erzeugen. NSCs, die EGF und bFGF ansprechbar sind in der Regel für mindestens zehn Passagen überleben und somit umfangreiche Selbsterneuerungsfähigkeit in Kultur 4,18-20 anzuzeigen. NPs, die auch EGF und bFGF ansprechen, könnten auch Neurosphären für einige Stellen erzeugen, aber nicht für einen längeren Zeitraum. Daher wurde es allgemein anerkannt , dass bona fide NSCs kann mit ziemlicher Genauigkeit basierend auf Neurosphere Bildung für mindestens zehn Passagen aufgezählt werden. In den meisten Studien wird jedoch die Selbsterneuerung in der Regel basierend auf gemessenen sekundären oder tertiären Neurosphärenbildung aufgrund der langen Versuchsdauer von zehn Passagen erforderlich. Daher kann die Sekundär NFA verwendet werden, um weitgehend die Selbsterneuerungsfähigkeit bet vergleichenween Populationen, aber nicht genau Frequenz NSC aufzuzählen verwendet werden. NSCs haben eine größere proliferative Fähigkeit im Vergleich zu NPs. Diese Eigenschaft von NSCs wurde von Louis et al. die neurale koloniebildenden Zellassay (NCFCA) 21,22 - einen Test zur NSC - Enumeration zu entwickeln. In diesem Test werden für 3 Wochen kultiviert einzelne Zellen in einer Kollagen enthaltenden halbfesten Matrix. Unter diesen Kulturbedingungen wurde gezeigt, dass Zellen, die Neurosphären über 2 mm im Durchmesser sind tripotent und kann selbst zu erneuern für langfristig bilden. Diese Zellen sind als NSC definiert. Daher werden die NSC effektiv von NPs aus. NSCs haben die Fähigkeit, in Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen zu differenzieren. Zur Differenzierung von Neurospheres sind, Wachstumsfaktoren entnommen und Serum wird zu dem Kulturmedium zugegeben. Wenn alle drei neuronalen Abstammungslinien werden in einer Neurosphären beobachtet, dann ist die Zelle, die diese Neurosphäre eingeleitet is ein NSC. Jedoch hat der Differenzierungsassay einige Einschränkungen. Zunächst werden die Kulturbedingungen für die Differenzierung verwendet werden, können nicht optimal für die Erzeugung aller drei neuronale Abstammungslinien. In der Tat kommt es in einem einzigen Neurosphere Differenzierungsprozess, signifikante Zelltod und meist Astrozyten Generation auftritt (Tham M und Ahmed S, nicht veröffentlicht). Zweitens gibt es die Frage der Klonalität. Für eine genaue Zählung von NSC, die Bildung und Differenzierung von Neurospheres haben unter klonalen Bedingungen durchgeführt werden, wobei jeder Neurosphäre aus einer einzigen Zelle entsteht. In der Masse Suspensionskulturen erfolgt die Aggregation an beiden zellulären und Neurosphere Ebenen 23-25. Daher ist es möglich, dass jeder Neurosphäre aus mehreren Zellen oder Neurosphären entstehen zu, die Neurosphären Zählen und Auswertung von Multipotenz erschwert. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass die Aggregation von Zellen tritt nicht bei niedrigen Plattierungsdichte von 0,5 Zellen / &amp; mgr; l oder weniger beträgt, und wenn Kulturplatten werden bei neu bewegtrosphere Bildung 15. So Kultivierung von Zellen bei so niedrigen Dichte Klonalität würde sicherstellen. Derzeit ist die NCFCA die am häufigsten verwendete Methode zur Unterscheidung von NSC NPs und NSC Frequenz aufzuzählen. Die NCFCA erfordert jedoch eine relativ lange Zeit von drei Wochen. Hier beschreiben wir ein Protokoll NSC Frequenz aufzuzählen basiert auf der Fähigkeit von NSC multiNeuroSphären zu bilden. Dieses Protokoll dauert nur 13 Tage durchzuführen. Die NCFCA sorgt für Klonalität als die Kollagenmatrix Bewegung der Neurosphären verhindert. Die Kulturbedingungen in diesem Protokoll verwendet ermöglicht auch Klonalität gesamten beibehalten werden. Zum Beispiel stellt die Verwendung von 50-Well-Kammerdeckgläser, dass die Neurosphären ohne einander zu berühren unterscheiden wird. Darüber hinaus verwenden wir konditioniertem Medium , die neurotrophen Faktoren während der Differenzierung liefert das Differenzierungspotential der Neurosphären (Abbildung 1) zu maximieren.

<table><tbody><tr><td>15 mL konische Zentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>konische Zentrifugenröhrchen mit 50 mL&nbsp;</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>20 mL sterile Spritze&nbsp; &nbsp;</td><td>BD</td><td>300141</td><td></td></tr><tr><td>50 mL sterile Spritze&nbsp;</td><td>BD</td><td>300144</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Tuj1 IgG2a Antikörper</td><td>Covance</td><td>MMS-435P-100</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-GFAP IgG Antikörper</td><td>Dako</td><td>Z033401</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer&nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop an Laminar-Flow-Haube</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Marienfeld-superior</td><td>1000200</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-O4 IgM Antikörper&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100-F</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td>NuAire</td><td>NU-543</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Kulturschalen</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>10-cm-Kulturschalen&nbsp;</td><td>NUNC</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinfolie</td><td>Parafilm</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) beim Menschen</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &Mikro; m Filter&nbsp;</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534-K</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro; m Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555-K</td><td></td></tr><tr><td>1,0 N Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>1,0 N Salzsäure (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blau&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin (PLL)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA) Pulver&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) Pulver&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>50-Well-Abdeckgläser mit Kammer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7735</td><td></td></tr><tr><td>Rührplatte mit Heizfunktion</td><td>Stuart</td><td>UC152</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>B27 Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+ und Mg2+ (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-IgM-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anti-Maus-IgG2a-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21135</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>4',6'-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific D3571</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturzentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; RT1 75002383</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 10006021</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belüfteter Abzugshaube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffpipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasbecher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enumeration neuraler stammzellen verwenden geklonte assays

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neurale Stammzellen (NSC) die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die drei Haupt neuralen Abstammungslinien erzeugen - Astrozyten, Neuronen und Oligodendrozyten. NSCs und neuronale Vorläuferzellen (NPs) sind in der Regel in vitro kultiviert als Neurosphären. Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie die NSC Frequenz in einer gegebenen Zellpopulation unter klonalen Bedingungen zu bestimmen. Das Protokoll beginnt mit dem Aussäen der Zellen in einer Dichte, die zur Erzeugung von klonalen Neurosphären ermöglicht. Die Neurosphären werden dann auf chambered Deckgläser übertragen und unter klonalen Bedingungen in konditionierten Medium differenziert, die das Differenzierungspotenzial der Neurosphären maximiert. Schließlich wird der NSC Frequenz berechnet basierend auf Neurosphärenbildung und Multipotenz Fähigkeiten. Dienstprogramme dieses Protokolls umfassen die Bewertung von Kandidatenmarkern NSC, Reinigung von NSC, und die Fähigkeit, NSC von NPs zu unterscheiden. Dieses Verfahren dauert 13 Tage, um auszuführen, was viel sHorter als die derzeitigen Methoden NSC Frequenz aufzuzählen.

Wir haben dieses Protokoll verwendet , um die Fähigkeit der lex, einer bekannten Zelloberfläche NSC Marker 7, für NSCs zu bereichern zu beurteilen. Die Daten aus dieser Studie werden verwendet, um darzustellen, wie NSCs aufgezählt werden, um die klonale Assays in dem Protokoll. E14.5 Maus Neurosphäre Zellen wurden mit anti-Lex Antikörper inkubiert. Anschließend Zellen , die LeX (LEX +) und Zellen exprimieren , die LeX (LEX -) nicht exprimieren wurden bei 50 Zellen / ml durch Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) ausgesät und links klonalen Neurosphären für 1 Woche zu erzeugen. Zeitraffer-Bildgebung zeigt , dass die Neurosphären bei 50 Zellen erzeugt / mL sind klonalen (Abbildung 2). Der NFU für LeX + und - LEX - Zellen wurde bestimmt. Es wird gezeigt , dass LeX + Zellen eine deutlich höhere Neurosphere Bildungsfähigkeit haben LEX im Vergleich - Zellen (Abbildung 3 g). Die Neurosphären erzeugt wurden dann differenziertunter Bedingungen klonalen anschließend immunhistochemisch und (3a-e) abgebildet. LeX + Zellen erzeugen deutlich mehr tripotent Neurosphären als - LEX - Zellen (3f). Der NSC Frequenz wurde dann basierend auf der NFU und% der tripotent Neurosphären (Figur 3g) berechnet. Die Auswahl basiert auf LEX bereichert NSC Frequenz um mehr als 14-fach lex als NSC Marker zu validieren. Wir haben festgestellt , auch die NSC Frequenz von E14.5 Maus Neurosphären mit diesem Protokoll 27 und NCFCA 28. Beide Verfahren berichten vergleichbar NSC Frequenz von etwa 2% in E14.5 Maus-Neurospheres. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig1.jpg" /> Abbildung 1. Das Protokoll für Neurosphäre Differenzierung unter Geklonte Bedingungen. Beispielneurosphären unter klonalen Bedingungen gezüchtet werden einzeln in jedem PLL / Laminin-c platziertoated Vertiefung einer 50-Well-Kammerdeckglas und erlaubt O / N zu halten. Am selben Tag, bulk kultivierten Neurosphären werden in Differenzierungsmedium in einer PLL / Laminin-beschichtete 10 cm-Schale plattiert und O / N anhaften. Am nächsten Tag konditionierte Medium aus den kultivierten bulk Neurosphären wird gefiltert und wieder in den 10-cm-Schale gegeben. Die Probe Neurosphären werden dann auf dem konditionierten Medium umgedreht und für 3-4 Tage 28 zu unterscheiden erlaubt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig2.jpg" /> Figur 2. Wachstum eines Clonal Neurosphäre. Zellen aus E14.5 Neurosphären abgeleitet wurden dissoziiert und beimpft mit 50 Zellen / ml in 96-Well - Platte. Einzelne Zellen wurden 6 d von Zeitraffer-Bildgebung verfolgt. Bilder von one solche Zelle in eine Neurosphere wachsenden gezeigt. Beachten Sie, dass der Neurosphäre Klonalität beibehält. (A) 0 Tagen; (B) 1.19.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; wobei die erste Zahl auf den Tag bezieht, bezieht sich zweite Zahl auf den Bruchteil des Tages, und dritte Zahl bezieht sich auf den Anteil der h. 10-facher Vergrößerung. Maßstabsbalken, 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig3.jpg" /> Abbildung 3. Differenzierung von Geklonte Neurosphären und Zählung von NSC Frequenz. Einzelneurosphären wurden in 50-Well - Kammerdeckglas für 3 d gepflückt und differenziert. Ein repräsentatives Bild eines tripotent Neurosphere stained mit (a) DAPI und immunhistochemisch für (b) GFAP, (c) TuJ1 und (d) O4. (E) zeigt die Überlagerung von (a) - (d). Maßstabsbalken, 65 &amp; mgr; m. (F) Die% der unipotent, bipotent und tripotent Neurosphären erzeugt LEX + und - LEX Zellen (Mittelwert ± SEM, n = 3). (G) NSC Frequenz in LeX + und - LEX. Berechnet Zellen als das Produkt von NFU und% der tripotent Neurosphären <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Neurale Stammzellen (NSCs) beziehen sich auf Zellen, die selbst zu erneuern und differenzieren sich in die drei neuronale Abstammungslinien. Hier beschreiben wir ein Protokoll NSC Frequenz in einer gegebenen Zellpopulation zu bestimmen, Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen.

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Häufigkeit neuraler Stammzellen in einer gegebenen Population mithilfe der Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen zu ermitteln. Diese Methode bietet wichtige Anwendungsmöglichkeiten im Bereich der neuralen Stammzellen, wie beispielsweise die Bewertung potenzieller Marker für neurale Stammzellen, die Reinigung neuraler Stammzellen sowie die Unterscheidung zwischen neuronalen Stammzellen und neuronalen Vorläuferzellen. Zu den Vorteilen dieser Methode zählt, dass sie 13 Tage in Anspruch nimmt, was kürzer ist als bei aktuellen Verfahren zur Bestimmung der Häufigkeit neuraler Stammzellen, und dass sie unter klonalen Bedingungen durchgeführt wird.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie am ersten Tag das NSC-Wachstumsmedium vor, indem Sie DMEM F12-Medium mit B27, EGF, BFGF und Penicillin-Streptomycin kombinieren. Danach lösen Sie E14,5-Maus-Neurosphären in einem Milliliter NSC-Wachstumsmedium und einem Milliliter 0,05 normaler Natronlauge sieben Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Pipettieren Sie die Zellen gelegentlich auf und ab, um sie in Suspension zu halten, und geben Sie anschließend einen Milliliter 0,05 normale Salzsäure hinzu, um die Lauge zu neutralisieren.Danach eine Zellzählung mit Trypanblau-Färbung und einem Hämozytometer durchführen. Anschließend einzeln E14,5-Maus-Neurosphärenzellen mit einer Dichte von 50 Zellen pro Milliliter oder darunter in 100 Mikrolitern NSC-Wachstumsmedium in einer 96-Well-Platte aussäen. Die Zellen eine Woche lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren, um klonale Neurosphären zu erzeugen.Zur Kultivierung von Neurosphären für das konditionierte Medium am Tag drei E14,5-Maus-Neurosphären dissociieren und die Einzelzellen mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Milliliter in 10 Milliliter NSC-Wachstumsmedium in einer 10-Zentimeter-Kulturschale ansäen. Anschließend die Zellen fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren, um massenhaft kultivierte Neurosphären zu erzeugen. Am Tag acht die Beschichtungslösung herstellen, indem 700 Mikroliter 0,01 % Poly-L-Lysin, 70 Mikroliter Laminin, ein Milligramm pro Milliliter und 6.230 Mikroliter PBS gemischt werden.Als Nächstes beschichten Sie eine 10 cm große Kulturschale zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit sieben Millilitern Poly-L-Lysin-Laminin-Lösung. Überführen Sie mit einer 10-mL-Serologiepipette alle in Bulk kultivierten Neurosphären in ein 15-mL-konisches Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Neurosphären eine Minute lang bei 171 × g und Raumtemperatur und entfernen Sie das Überstandsgemisch vollständig.Danach NSC-Differenzierungsmedium herstellen, indem DMEM F12-Medium mit B27 und FBS kombiniert wird. 10 Milliliter NSC-Differenzierungsmedium zu den Neurosphären geben und mehrmals auf- und abpipettieren, um die Neurosphären erneut in Suspension zu bringen. Anschließend das Poly-L-Lysin-Laminin aus der 10-Zentimeter-Kulturschale abziehen und einmal mit 10 Milliliter PBS waschen.Überführen Sie alle Neurosphären in die mit Poly-L-Lysin-Laminin beschichtete 10 cm-Kulturschale und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2, damit die Neurosphären an der Schale haften können. Am achten Tag zählen Sie unter dem Mikroskop die Anzahl der in jedem Well gebildeten Neurosphären, anschließend beschichten Sie jeden Well einer 50-Well-Kammerobjektträger mit je 10 µL Poly-L-Lysin-Laminin-Beschichtungslösung für zwei Stunden bei 37 °C. Danach bereiten Sie drei kegelförmige Zentrifgenröhrchen mit je 30 mL PBS vor.Entfernen Sie mit sterilen Pinzetten die beschichtete 50-Loch-Kammernobjektträger, tauchen Sie den Kammernobjektträger nacheinander in das erste, dann das zweite und schließlich das dritte Röhrchen mit PBS, um die Beschichtungslösung abzuwaschen. Danach saugen Sie jegliche verbleibende Flüssigkeit aus den Vertiefungen des Kammernobjektträgers ab. Überführen Sie vorsichtig das gesamte Medium und alle Neurosphären aus jedem Loch der 96-Loch-Platte in eine einzelne 10 cm große Kulturschale.Stellen Sie sicher, dass jeweils nur eine Neurosphäre ausgewählt wird, indem Sie die Pipettensäule auf zwei Mikroliter einstellen und unter dem Mikroskop eine Beispiel-Neurosphäre mit einer P10-Mikropipette, die mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze ausgestattet ist, aufnehmen. Die Neurosphären können unter dem Mikroskop aufgenommen und entweder in einer laminaren Luftströmungshaube oder auf einer Laborbank platziert werden. Überführen Sie anschließend die Neurosphäre in die Mitte einer Vertiefung der beschichteten 50-Vertiefungen-Kammerobjektträger.Wiederholen Sie die Schritte, bis jede Vertiefung der Kammerobjektträger eine Neurosphäre enthält. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter NSC-Differenzierungsmedium in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers. Stellen Sie den Kammerobjektträger in eine 10 cm große Kulturschale.Es können bis zu zwei Kammerobjektträger in eine 10 cm-Dish gegeben werden. Pipettieren Sie PBS entlang der Ränder der Dish, um das Austrocknen des NSC-Differenzierungsmediums zu verhindern. Inkubieren Sie die Kammerobjektträger über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.Am neunten Tag überführen Sie das konditionierte Medium von den in Bulk kultivierten Neurosphären in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Lassen Sie das konditionierte Medium mithilfe einer sterilen 20-Milliliter-Spritze durch einen 0,2-Mikrometer-Filter laufen, um eventuelle Zellen oder Partikel zu entfernen. Danach überführen Sie das filtrierte konditionierte Medium zurück in die 10-Zentimeter-Kulturschale.Anschließend mit sterilen Pinzetten die Kammerobjektträger vorsichtig umgekehrt auf das konditionierte Medium legen, sodass die Probe-Neurosphären nach unten zeigen. Die Kammerobjektträger drei Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren. Am Tag 12 die Kammerobjektträger vorsichtig mit sterilen Pinzetten aus der 10 cm-Kulturschale entfernen.Tauchen Sie die Deckglasunterlage vorsichtig in PBS, um das konditionierte Medium abzuwaschen. Dann lösen Sie die Silikon-Dichtung langsam und vorsichtig vom Deckglas, um zu vermeiden, dass das Deckglas bricht. Achten Sie darauf, welche Seite mit den differenzierten Neurosphären besiedelt ist.Danach pipettieren Sie einen Millimeter 4 % Paraformaldehyd auf ein Stück Parafilm, das auf die Größe des Deckgläschens zugeschnitten ist. Legen Sie das Deckglas vorsichtig mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit dem Paraformaldehyd auf das Parafilm und fixieren Sie die Neurosphären 20 Minuten bei Raumtemperatur. Hier wurden einzelne Neurosphären ausgewählt und drei Tage lang in einer 50-Loch-Kammer mit Deckglas differenziert.Dies ist ein repräsentatives Bild einer tripotenten Neurosphäre, die mit DAPI gefärbt und immunhistochemisch für GFAP, TUJ1 und O4 nachgewiesen wurde. Dieses Bild zeigt die Überlagerung von DAPI, GFAP, TUJ1 und O4. Dieses Protokoll dient dazu, die Fähigkeit von LeX, einem bekannten NSC-Marker, zu überprüfen, NSCs anzureichern. Dieses Diagramm zeigt den Prozentsatz unipotenter, bipotenter und tripotenter Neurosphären, die von LeX-positiven und LeX-negativen Zellen gebildet wurden. LeX-positive Zellen bilden signifikant mehr tripotente Neurosphären als LeX-negative Zellen.Diese Tabelle zeigt, dass die NSC-Frequenz von LeX-positiven und LeX-negativen Zellen als Produkt aus NFU und dem Prozentsatz tripotenter Neurosphären berechnet wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Neurosphären unter klonalen Bedingungen kultiviert und differenziert werden können, um die Frequenz neuraler Stammzellen zu bestimmen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, frisch zubereitete Wachstums- und Differenzierungsmedien sowie frisch zubereitete Beschichtungslösung zu verwenden, um optimale Wachstums- und Differenzierungsbedingungen für die Neurosphären sicherzustellen.Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von 13 Tagen durchgeführt werden, was eine kürzere Dauer im Vergleich zu den derzeitigen Methoden zur Bestimmung der Häufigkeit neuraler Stammzellen darstellt. Diese Methode könnte zusammen mit gängigen Verfahren wie dem Neural Colony Forming Cell Assay verwendet werden, um neuere Stammzellen anzureichern und einen definitiven Marker für neurale Stammzellen zu identifizieren.

enumeration-of-neural-stem-cells-using-clonal-assays

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Kenntnis der genauen Anzahl der lebensfähigen Zellen ist für viele Gewebekultur Manipulationen erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden und zu quantifizieren Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Obwohl es das Zählen menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) beschreibt, kann es für andere Zelltypen verwendet werden.

Counting Nervenstammzellen

Dieses Video-Protokoll zeigt die Neurosphäre Assay-Methode zu generieren und zu erweitern neurale Stammzellen aus dem erwachsenen Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Dieses Video-Protokoll zeigt die Anwendung der Neurosphäre Assay für die Isolierung und Expansion von neuronalen Stammzellen, die aus den Ganglien-Eminenzen der embryonalen Tag 14-Maus-Gehirn.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

Dieses Video-Protokoll zeigt, wie zu diskriminieren und aufzählen bona fide neurale Stammzellen in einer gemischten Population von neuralen Vorläuferzellen über die neuronalen Kolonie-bildenden-Zell-Assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Das Rückenmark eines adulten Säugetieres enthält neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs), die in Kultur isoliert und erweitert werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Isolierung, Kultivierung und Passage von NSPCs, die aus der periventrikulären Region des adulten Rückenmarks von der Ratte und von menschlichen Organtransplantatspendern erzeugt wurden.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Eine effizientes Screening-Protokoll wird für die Identifikation von kleinen Molekülen präsentiert, die Astroglial Differenzierung in Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) zu fördern. Der Test basiert auf Stammzell-Differenzierung Reporter, wobei der Ausdruck der verbesserte GFP (eGFP) durch den menschlichen GFAP Projektträger angetrieben wird.

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Hier präsentieren wir Methodik zur klonalen Analyse von Hämatopoetischen Stammzellen Vorläufer während der murinen embryonalen Entwicklung. Wir kombinieren Index sortieren einzelner Zellen aus der embryonalen Aorta-Gonade-Wachstum-Region mit Endothelzellen Kokulturen und Transplantation der phänotypischen Eigenschaften und Engraftment Potenzial der einzelnen hämatopoetischen Vorläufer zu charakterisieren.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Lernen Sie die Quantifizierung neuronaler Stammzellen durch Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen. Diese effiziente 13-Tage-Methode ermöglicht die Bewertung von NSC-Markern.

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Weitere Videos entdecken