Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Häufigkeit neuraler Stammzellen in einer gegebenen Population mithilfe der Neurosphärenbildung und Differenzierung unter klonalen Bedingungen zu ermitteln. Diese Methode bietet wichtige Anwendungsmöglichkeiten im Bereich der neuralen Stammzellen, wie beispielsweise die Bewertung potenzieller Marker für neurale Stammzellen, die Reinigung neuraler Stammzellen sowie die Unterscheidung zwischen neuronalen Stammzellen und neuronalen Vorläuferzellen. Zu den Vorteilen dieser Methode zählt, dass sie 13 Tage in Anspruch nimmt, was kürzer ist als bei aktuellen Verfahren zur Bestimmung der Häufigkeit neuraler Stammzellen, und dass sie unter klonalen Bedingungen durchgeführt wird.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie am ersten Tag das NSC-Wachstumsmedium vor, indem Sie DMEM F12-Medium mit B27, EGF, BFGF und Penicillin-Streptomycin kombinieren. Danach lösen Sie E14,5-Maus-Neurosphären in einem Milliliter NSC-Wachstumsmedium und einem Milliliter 0,05 normaler Natronlauge sieben Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Pipettieren Sie die Zellen gelegentlich auf und ab, um sie in Suspension zu halten, und geben Sie anschließend einen Milliliter 0,05 normale Salzsäure hinzu, um die Lauge zu neutralisieren.

Danach eine Zellzählung mit Trypanblau-Färbung und einem Hämozytometer durchführen. Anschließend einzeln E14,5-Maus-Neurosphärenzellen mit einer Dichte von 50 Zellen pro Milliliter oder darunter in 100 Mikrolitern NSC-Wachstumsmedium in einer 96-Well-Platte aussäen. Die Zellen eine Woche lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren, um klonale Neurosphären zu erzeugen.

Zur Kultivierung von Neurosphären für das konditionierte Medium am Tag drei E14,5-Maus-Neurosphären dissociieren und die Einzelzellen mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Milliliter in 10 Milliliter NSC-Wachstumsmedium in einer 10-Zentimeter-Kulturschale ansäen. Anschließend die Zellen fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren, um massenhaft kultivierte Neurosphären zu erzeugen. Am Tag acht die Beschichtungslösung herstellen, indem 700 Mikroliter 0,01 % Poly-L-Lysin, 70 Mikroliter Laminin, ein Milligramm pro Milliliter und 6.230 Mikroliter PBS gemischt werden.

Als Nächstes beschichten Sie eine 10 cm große Kulturschale zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit sieben Millilitern Poly-L-Lysin-Laminin-Lösung. Überführen Sie mit einer 10-mL-Serologiepipette alle in Bulk kultivierten Neurosphären in ein 15-mL-konisches Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Neurosphären eine Minute lang bei 171 × g und Raumtemperatur und entfernen Sie das Überstandsgemisch vollständig.

Danach NSC-Differenzierungsmedium herstellen, indem DMEM F12-Medium mit B27 und FBS kombiniert wird. 10 Milliliter NSC-Differenzierungsmedium zu den Neurosphären geben und mehrmals auf- und abpipettieren, um die Neurosphären erneut in Suspension zu bringen. Anschließend das Poly-L-Lysin-Laminin aus der 10-Zentimeter-Kulturschale abziehen und einmal mit 10 Milliliter PBS waschen.

Überführen Sie alle Neurosphären in die mit Poly-L-Lysin-Laminin beschichtete 10 cm-Kulturschale und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2, damit die Neurosphären an der Schale haften können. Am achten Tag zählen Sie unter dem Mikroskop die Anzahl der in jedem Well gebildeten Neurosphären, anschließend beschichten Sie jeden Well einer 50-Well-Kammerobjektträger mit je 10 µL Poly-L-Lysin-Laminin-Beschichtungslösung für zwei Stunden bei 37 °C. Danach bereiten Sie drei kegelförmige Zentrifgenröhrchen mit je 30 mL PBS vor.

Entfernen Sie mit sterilen Pinzetten die beschichtete 50-Loch-Kammernobjektträger, tauchen Sie den Kammernobjektträger nacheinander in das erste, dann das zweite und schließlich das dritte Röhrchen mit PBS, um die Beschichtungslösung abzuwaschen. Danach saugen Sie jegliche verbleibende Flüssigkeit aus den Vertiefungen des Kammernobjektträgers ab. Überführen Sie vorsichtig das gesamte Medium und alle Neurosphären aus jedem Loch der 96-Loch-Platte in eine einzelne 10 cm große Kulturschale.

Stellen Sie sicher, dass jeweils nur eine Neurosphäre ausgewählt wird, indem Sie die Pipettensäule auf zwei Mikroliter einstellen und unter dem Mikroskop eine Beispiel-Neurosphäre mit einer P10-Mikropipette, die mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze ausgestattet ist, aufnehmen. Die Neurosphären können unter dem Mikroskop aufgenommen und entweder in einer laminaren Luftströmungshaube oder auf einer Laborbank platziert werden. Überführen Sie anschließend die Neurosphäre in die Mitte einer Vertiefung der beschichteten 50-Vertiefungen-Kammerobjektträger.

Wiederholen Sie die Schritte, bis jede Vertiefung der Kammerobjektträger eine Neurosphäre enthält. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter NSC-Differenzierungsmedium in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers. Stellen Sie den Kammerobjektträger in eine 10 cm große Kulturschale.

Es können bis zu zwei Kammerobjektträger in eine 10 cm-Dish gegeben werden. Pipettieren Sie PBS entlang der Ränder der Dish, um das Austrocknen des NSC-Differenzierungsmediums zu verhindern. Inkubieren Sie die Kammerobjektträger über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Am neunten Tag überführen Sie das konditionierte Medium von den in Bulk kultivierten Neurosphären in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Lassen Sie das konditionierte Medium mithilfe einer sterilen 20-Milliliter-Spritze durch einen 0,2-Mikrometer-Filter laufen, um eventuelle Zellen oder Partikel zu entfernen. Danach überführen Sie das filtrierte konditionierte Medium zurück in die 10-Zentimeter-Kulturschale.

Anschließend mit sterilen Pinzetten die Kammerobjektträger vorsichtig umgekehrt auf das konditionierte Medium legen, sodass die Probe-Neurosphären nach unten zeigen. Die Kammerobjektträger drei Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren. Am Tag 12 die Kammerobjektträger vorsichtig mit sterilen Pinzetten aus der 10 cm-Kulturschale entfernen.

Tauchen Sie die Deckglasunterlage vorsichtig in PBS, um das konditionierte Medium abzuwaschen. Dann lösen Sie die Silikon-Dichtung langsam und vorsichtig vom Deckglas, um zu vermeiden, dass das Deckglas bricht. Achten Sie darauf, welche Seite mit den differenzierten Neurosphären besiedelt ist.

Danach pipettieren Sie einen Millimeter 4 % Paraformaldehyd auf ein Stück Parafilm, das auf die Größe des Deckgläschens zugeschnitten ist. Legen Sie das Deckglas vorsichtig mit den Neurosphären nach unten in Kontakt mit dem Paraformaldehyd auf das Parafilm und fixieren Sie die Neurosphären 20 Minuten bei Raumtemperatur. Hier wurden einzelne Neurosphären ausgewählt und drei Tage lang in einer 50-Loch-Kammer mit Deckglas differenziert.

Dies ist ein repräsentatives Bild einer tripotenten Neurosphäre, die mit DAPI gefärbt und immunhistochemisch für GFAP, TUJ1 und O4 nachgewiesen wurde. Dieses Bild zeigt die Überlagerung von DAPI, GFAP, TUJ1 und O4. Dieses Protokoll dient dazu, die Fähigkeit von LeX, einem bekannten NSC-Marker, zu überprüfen, NSCs anzureichern. Dieses Diagramm zeigt den Prozentsatz unipotenter, bipotenter und tripotenter Neurosphären, die von LeX-positiven und LeX-negativen Zellen gebildet wurden. LeX-positive Zellen bilden signifikant mehr tripotente Neurosphären als LeX-negative Zellen.

Diese Tabelle zeigt, dass die NSC-Frequenz von LeX-positiven und LeX-negativen Zellen als Produkt aus NFU und dem Prozentsatz tripotenter Neurosphären berechnet wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Neurosphären unter klonalen Bedingungen kultiviert und differenziert werden können, um die Frequenz neuraler Stammzellen zu bestimmen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, frisch zubereitete Wachstums- und Differenzierungsmedien sowie frisch zubereitete Beschichtungslösung zu verwenden, um optimale Wachstums- und Differenzierungsbedingungen für die Neurosphären sicherzustellen.

Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von 13 Tagen durchgeführt werden, was eine kürzere Dauer im Vergleich zu den derzeitigen Methoden zur Bestimmung der Häufigkeit neuraler Stammzellen darstellt. Diese Methode könnte zusammen mit gängigen Verfahren wie dem Neural Colony Forming Cell Assay verwendet werden, um neuere Stammzellen anzureichern und einen definitiven Marker für neurale Stammzellen zu identifizieren.