Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

Das übergeordnete Ziel der Verwendung von künstlich hergestellten Mikrogefäßen besteht darin, die Struktur und Funktion von Gefäßen im Körper zu replizieren, um die Gefäßphysiologie in normalen und kranken Zuständen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Gefäßbiologie zu beantworten, z. B. wie verschiedene Anathemenzellen auf die Strömung reagieren, wie sie die Gewebefunktion beeinflussen und wie Gefäßerkrankungen im Laufe der Zeit entstehen und fortschreiten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie leicht modifiziert werden kann, um verschiedene Organsysteme und Krankheitszustände nachzuahmen.

Dies kann durch Ändern der Zelltypen, der Matrix- und Medienzusammensetzung und anderer Variablen erfolgen. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, bevor sie sich häufiger Fehler bewusst werden, die zu einer schlechten Schiffsqualität führen können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es mehrere Tricks für eine erfolgreiche Fertigung während der Spritzguss- und Montageschritte gibt.

Lassen Sie für dieses Verfahren die flachen und mikrostrukturierten PDMS-Formen sowie die PMMA-Gehäuseteile vorab vorbereiten. Eine Beschreibung, wie diese Teile hergestellt werden, ist im Textprotokoll enthalten. Autoklavieren Sie die PDMS-Formen zusammen mit den Schrauben, Stiften, Pinzetten und einem Spatel.

Autoklavieren Sie die PMMA-Teile nicht. Sie müssen in Bleichmittel unter einer Haube sterilisiert werden. Nachdem Sie die PMMA-Stücke mindestens eine Stunde lang in Bleichmittel eingeweicht haben, spülen Sie das Bleichmittel zweimal mit autoklaviertem Wasser ab.

Legen Sie die Stücke dann in sterile Schalen. Überschüssiges Wasser absaugen und an der Luft trocknen lassen. Wenn alles gereinigt ist, beginnen Sie das Protokoll, indem Sie die inneren Vertiefungen sowohl der oberen als auch der unteren PMMA-Stücke mit einem tragbaren Plasmabehandler etwa eine Minute lang behandeln.

Schalten Sie das Licht aus, um die Abdeckung der Plasmabehandlung zu visualisieren. Geben Sie anschließend 1 % PEI auf die inneren Vertiefungen. Wenn sich das PEI nicht leicht ausbreitet, verlängern Sie die Plasmabehandlungszeit.

Nachdem Sie das PEI 10 Minuten einwirken lassen, entfernen Sie die Lösung und spülen Sie die Geräte anschließend mit sterilem Wasser ab und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen 0,1%ige Glutaraldehyd auf die behandelten Oberflächen auftragen und das Glutaraldehyd eine halbe Stunde einwirken lassen. Spülen Sie die Stücke dann zweimal mit sterilem Wasser ab und lassen Sie sie an der Luft trocknen.

Bereiten Sie nun frisches, 0,75% neutralisiertes Kollagen für die Gefäßherstellung vor, indem Sie das vorab zugewiesene Stammkollagenvolumen mit der Neutralisationslösung aus Medium und Natriumhydroxid kombinieren. Rühren Sie langsam und vorsichtig mit einem Spatel um, bis die Lösung homogen und orange ist. Fügen Sie dann bei Bedarf Zellen in der gewünschten Konzentration hinzu und rühren Sie die Lösung weiter, bis die Zellen gleichmäßig verteilt sind.

Zur Vorbereitung des Montageprozesses legen Sie die mikrostrukturierte PDMS-Form in eine 100 x 20 Millimeter große Schale und behandeln Sie die Form eine Minute lang mit Plasma. Richten Sie als Nächstes das obere PMMA-Stück auf dem PDMS aus, sodass die quadratischen Behälter mit den Einlass- und Auslassbehältern ausgerichtet sind. Stecken Sie dann Passstifte aus Edelstahl in die Einlass- und Auslasslöcher des Reservoirs, damit sie nach der Kollageninjektion offen bleiben.

Laden Sie nun die Kollagenzellmischung in eine Ein-Milliliter-Spritze, ohne Luftblasen einzuführen. Drücken Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig auf das obere PMMA-Stück, um es an der PDMS-Form zu befestigen, und injizieren Sie langsam etwa einen halben Milliliter Kollagenzellmischung in die Injektionsöffnung. Das Kollagen muss den 20 mal 20 Millimeter großen Bereich über dem Muster ausfüllen und darf nicht austreten.

Verschließen Sie dann die Schüssel vorsichtig, ohne die Passstifte zu stoßen. Legen Sie dann in das untere PMMA-Stück ein 22 Quadratmillimeter großes Glasdeckglas in die innere Vertiefung. Geben Sie dann etwa 0,25 Milliliter Kollagen gleichmäßig auf das Glas.

Vervollständigen Sie die untere Hälfte, indem Sie das flache PDMS vorsichtig in das Kollagen absenken, so dass es flach gegen das PMMA anliegt und keine Luftblasen dazwischen liegen. Legen Sie nun beide Hälften des Geräts vorsichtig in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator und lassen Sie die Kollagenlösung 30 Minuten lang gelieren, bevor Sie fortfahren. Fügen Sie nach der Gelierung genügend PBS hinzu, um das PDMS auf dem unteren Teil zu umgeben.

Verwenden Sie dann eine Pinzette, um überschüssiges Kollagen an den Rändern zu entfernen, und schälen Sie das flache PDMS-Stück langsam ab, während das Kollagen mit PBS hydratisiert bleibt. Um das obere Stück vorzubereiten, heben Sie die PMMA- und PDMS-Baugruppe mit einer Pinzette an und drehen Sie sie um. Geben Sie dann ein paar Tropfen PBS auf die Innenseite und entfernen Sie die PDMS-Form vom oberen PMMA-Stück, indem Sie sie schnell und fest abziehen.

Entfernen Sie anschließend mit einer zweiten Pinzette vorsichtig die Stifte von der anderen Seite des PMMA-Gehäuses. Stellen Sie sicher, dass der Einlass und der Auslass frei von überschüssigem Kollagen sind, indem Sie die Stifte vor dem Entfernen auf und ab bewegen. Wenn die Stifte von selbst herausfallen, verwenden Sie einfach einen anderen sterilen Passstift, um sicherzustellen, dass der Ein- und Auslass frei ist.

Gib dann mehr PBS auf das mikrogemusterte Kollagen, drehe das Stück um und setze Schrauben in die vier Ecklöcher ein. Lege nun das obere Stück vorsichtig auf das untere Stück und richte die Schrauben in ihren Löchern aus. Lassen Sie die beiden Teile nicht gegeneinander gleiten.

Schrauben Sie dann die Teile vorsichtig mit einem Spachtel und einer sanften Berührung zusammen, damit sie nicht zu fest angezogen werden. Es ist entscheidend, bei der Montage sanft und präzise vorzugehen. Durch das Auftragen einer großen Menge PBS wird die Reibung zwischen der Innenseite reduziert.

Gehen Sie beim Befestigen der Schrauben langsam vor und stoppen Sie, sobald ein Widerstand erreicht ist. Aspirieren Sie anschließend das PBS, das die PMMA-Oberflächen umgibt, und legen Sie ein kleines Stück Watte unter eine Kante des Geräts. Saugen Sie dann PBS aus den Behältern an.

Füllen Sie nun die Reservoirs wieder mit Zellkulturmedium und inkubieren Sie das Gerät mindestens eine Stunde lang zur Gelierung. Sobald das Gerät zusammengebaut ist, verwenden Sie eine Endothelzellsuspension mit 10 Millionen Zellen pro Milliliter, um das Gerät zu säen. Entfernen Sie das Medium aus dem Einlass- und Auslassreservoir und geben Sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette mit Gelladespitzen 10 Mikroliter der Zellsuspension in die Mitte des Einlassreservoirs.

Die Zellen fließen sofort in das Netzwerk ein und beschichten es. Sobald die Zellen das Netzwerk gefüllt haben und sich der Durchfluss ausgeglichen hat, geben Sie 150 Mikroliter Medium in beide Reservoire. Inkubieren Sie das Gerät dann eine Stunde oder länger lang, damit sich die Zellen ausbreiten und anheften können.

Für eine Langzeitkultur entfernen Sie das Medium alle 12 Stunden und geben Sie 150 Mikroliter frisches Medium in den Einlassbehälter und 50 Mikroliter in den Auslassbehälter zurück. Nach 24 Stunden Kultivierung kann eine Spritzenpumpe verwendet werden, um kontinuierliche Durchflussbedingungen herzustellen. Nachdem Sie die Materialien in die Biohaube gebracht haben, entfernen Sie die Schläuche aus den Autoklavenbeuteln und legen Sie sie in eine Schale.

Bereiten Sie dann eine sterile Durchflussschale vor, indem Sie die Seitenlöcher schmelzen und dann den Schlauch durchfädeln. Bereiten Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit Nährmedium vor, das 3,5 % Dextran enthält. Befestigen Sie als Nächstes die gefüllte Spritze an der Köderverriegelung am Ende des Einlaufschlauchs.

Befestigen Sie dann die Spritze an der Pumpe und gießen Sie reichlich Medium, bis alle eingeschlossenen Luftblasen aus dem Schlauch ausgetreten sind. Sobald der Schlauch mit Medium gefüllt und frei von Blasen ist, übertragen Sie das Gerät in eine neue Schale und setzen Sie die Einlassanschlussverbindung in den Gehäuseeinlass ein. Stellen Sie dann die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussrate ein und beginnen Sie mit der Infusion.

Bereiten Sie den Auslass vor, indem Sie den Schlauch mit einer 18-Gauge-Nadel und einer Ein-Milliliter-Spritze mit Zellkulturmedien füllen. Einspannen und Nadel entfernen. Schmelzen Sie dann mit einem Lötkolben ein Loch in der Kappe des Auslassauffangrohrs.

Geben Sie anschließend Medien in das Auffangrohr, führen Sie den Schlauch ein und befestigen Sie die Verbindungsverbindung in der Gehäuseauslasse. Während dieses Prozesses wird eine Klemme verwendet, um das Medium im Schlauch zu halten. Sobald Sie fertig sind, übertragen Sie das gesamte Setup in einen Inkubator.

Abhängig von den Versuchsbedingungen muss die Spritze möglicherweise nach 24 bis 36 Stunden nachgefüllt werden. Achten Sie beim Spritzenwechsel darauf, dass keine Blasen in den Schlauch gelangen. Menschliche Nabelvenen- und Ethelzellen wurden durch das in Kollagen eingebettete mikrofluidische Netzwerk reichlich durchdrungen, um ein Patentlumen und ein konfluentes Endothel zu bilden.

Es wurden verschiedene Behältergeometrien verwendet, um unterschiedliche Strömungsbedingungen zu etablieren. Unter kontinuierlichen Strömungskulturbedingungen wurde eine konstante Scherspannung auf das Endothel ausgeübt. Geräte, die unter schwerkraftgetriebenen Strömungsbedingungen kultiviert wurden, behielten auch die langfristige Lebensfähigkeit und Durchgängigkeit bei.

Ein entscheidendes Merkmal dieser Mikrogefäße ist ihre Fähigkeit, auf Entzündungsreize zu reagieren. Dies wurde untersucht, indem die Mikrogefäße mit Vollblut übergossen wurden. Nicht stimulierte Mikrogefäße enthielten nicht aktiviertes Endothel und blieben ruhig.

Stimulierte Mikrogefäße wurden aktiviert und ihre Reaktion initiierte die Thrombusbildung. Eine weitere interessante Anwendung für das System ist die Untersuchung phänotypischer Veränderungen im Gefäßsystem, die aus verschiedenen Endothelzellpopulationen gebildet werden. Zum Beispiel zeigten Mikrogefäße, die aus einzigartigen Populationen von Stammzellen gebildet wurden, unterschiedliche angiogene Keimfähigkeiten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mikrogefäße herstellt und sie zum Studium der Gefäßbiologie und zum Aufbau komplexer Modellorgansysteme verwendet. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass sich die Praxis mit der Geschwindigkeit der erfolgreichen Gefäßbildung verbessert und konsistentere Ergebnisse ermöglicht. Einmal gemeistert, können mehrere Geräte in drei bis vier Stunden hergestellt werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Reichlichkeit von Vollblut, Dextran oder pharmazeutische Behandlungen durchgeführt werden, um die endotheliale Ruhe, die Permeabilität, das Ansprechen auf das Arzneimittel und die allgemeine Morphologie von Zellen und Gefäßen zu beurteilen.