Name: Neonatal Cardiac Scaffolds: Neuartige Matrices für Regenerative Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung neuartiger kardialer Scaffolds aus neonatalem murinem Gewebe für regenerative Kardiologieforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen und der einzigartigen Eigenschaften der neonatalen extrazellulären Matrix.

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Die Autoren danken Frau Cynthia DeKay für die Erstellung der Zahlen.

Alle Maus-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den US-Tierschutzgesetz durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Minnesota genehmigt. 1. Verfahren zur Maus Herz Isolation <ol><li> Euthanize eine Neugeborenen-Maus durch Enthauptung mit einem einzigen Einsatz Klinge. </li><li> Tupfer, um den Brustkorb mit 70% Ethanol. </li><li> Präparieren Sie die Haut von der Brust, indem sie es weg von der Brustwand mit Standard-Schere schneiden, während die Haut seitlich mit einem Paar # 5 Pinzette ziehen. </li><li> Perforieren den Bauch unmittelbar unterhalb des Brustbeins mit der Schere durch durch die Bauchwand zu schneiden. Greifen die Xiphoidbasis mit # 5 Pinzette ziehen sich die Brustbeins rostral aus dem Körper, während auf beiden Seiten der Brust mit der Schere obwohl die Rippen zu schneiden. Der Brustkorb wird reflektiert kranial mit der Zange, das Herz zu offenbaren. </li><li> Unverblümt sezieren die beiden Hauptkeulen des Thymus durch Ziehen seitlich mit # 5 Pinzette, Belichtender Bogen der Aorta sowie die Kava-und Lungenvenen. </li><li> TRANSECT die großen Arterien aus dem Aortenbogen und die Aorta selbst, mit den 10 cm Feder Schere. Bewahren Sie die Aorta zwischen der Basis des Herzens und der brachiocephalic Arterie. Fassen Sie die Enden der abgetrennten Gefäße mit der # 5 Pinzette das Herz nach vorn zu reflektieren, es aus der Luft- und Speiseröhre trennt. </li><li> TRANSECT den Lungengefäßen und anderen großen Venen, indem sie zwischen den Lungen Schneiden und das Herz auf beiden Seiten des Herzens mit den 10 cm Feder Schere. Die Venen offen bleiben Entwässerung zu sorgen. </li><li> Entfernen Sie das Herz aus dem Mediastinum mit den # 5 Zange, die abgeschlagenen Enden der großen Gefäße zu erfassen. Platzieren Sie die Herzen in eine 60 mm Kulturschale mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für die Katheterisierung. </li></ol> 2. Verfahren zur Dezellularisierung von Langendorff-Perfusion <ol><li> Bereiten Sie die Katheteranordnung im Voraus. Zeichnen Sie einen 4 cm langen Abschnittvon PE 50 Schläuchen in einem kleinen Spiritusflamme ein kleiner, dünner Katheter zu schaffen. Schneiden Sie die Enden mit einer Klinge , die Abmessungen zu erfüllen (ca. 300 &amp; mgr; m Außendurchmesser OD mit einem Flansch von rd. 500 &amp; mgr; m OD) in 1 gezeigt. Dies wird zwei symmetrische Katheter von jeder Seite des Zuges. </li><li> Zeigen das Schnittende der Rohrleitung in die Flamme kurz, einen Flansch auf der Öffnung an dem dünnen Ende zu schmelzen. </li><li> Füllen Sie die 12-ml-Spritze mit PBS und montieren Sie den Katheter durch ein 3-Wege-Hahn Platzierung auf der Spritze. Fügen Sie eine 22 G x 1 Nadel auf den Hahn und treiben die Nadel durch das Septum. Schieben des verstreckten Schlauch PE - Katheter auf die Nadel (Fig. 1). </li><li> Spülen Sie die zusammengebauten Teile mit PBS, sicherzustellen, dass alle Luftblasen entfernt wurden. </li><li> Setzen Sie den Katheter, hergestellt wie oben beschrieben, in die Aorta des isolierten Herzens, nicht über die Aortenklappe erstreckt und abzubinden mit einer Bindung von 7-0 Naht. Seien Sie den Flansch von ter Katheter proximal gegen die Krawatte, eine dichte Abdichtung zu machen und das Herz ablöst, den Katheter zu verhindern. </li><li> Beachten Sie die Katheterisierung unter Vergrößerung, während sanft das Herz mit der Spritze mit PBS Perfusion. Stellen Sie sicher, dass es keine Lecks im System sind und das Gewebe blanches homogen als latente Blut entfernt wird. </li><li> Platzieren des Septums in den Hals des Einlassadapter und abdichten, indem die Seiten über das Glas zu falten. </li><li> Bringen Sie den Behälter gefüllt mit 60 ml 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in destilliertem Wasser (dH 2 O) über eine Leitung von ausreichender Länge , um eine Spalte zu erzeugen , die 20 mm Hg Druck erzeugt , wie in Fig. 1. Berechne den Druck von der Flüssigkeitssäulenhöhe basierend auf der Beziehung von 1 mm Hg ist gleich 1,3595 cm H 2 O. Achtung: SDS ist ein sehr flockiges Pulver mit reizenden Eigenschaften. Kontakt sollte vermieden werden. Behandeln Sie das Pulver geeignete Schutzkleidung verwenden. </li><li> Perfuse das Herz mit 1% SDS für 14 Stunden. Das Herz wird ohne beobachtbare verbleibende Gewebe in Erscheinung durchscheinend sein. </li><li> Spülen Sie das System bis zum Absperrhahn der verbleibenden SDS - Lösung und ersetzen Sie es mit 10 ml dH 2 O. Perfundieren das Herz mit 10 ml 1% Triton X-100 (in destilliertem Wasser verdünnt), gefolgt von 10 ml dH 2 O, gefolgt von 60 ml PBS 1x Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) enthält. </li><li> Lagern Sie das Herz in PBS mit 1x Pen-Strep bei 4 ° C. Falls die vorgesehene Beitrag Dezellularisierung Anwendung Perfusion erfordert dann sollte der Katheter in die Aorta eingehalten werden, schneiden sonst die Naht Krawatte und den Katheter zu entfernen. </li></ol> 3. DNA-Bestimmung <ol><li> Vorbereiten eines Digest des dezellularisierten ECM oder Kontroll Herzen unter Verwendung von 200 &amp; mgr; g / ml Proteinase K in 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl 2, 0,45% Tween 20 in 10 mM Tris (pH 8,3). </li><li> Inkubieren des Gewebes bei 55 ° C unter Rühren, bis das Gewebe gelöst,typischerweise 4-5 Stunden. </li><li> Quantifizieren der DNA - Gehalt des Homogenisats mit einem DNA - Bindungsassay 4,11. </li></ol> 4. Fixierung und Schnitt von Tissue <ol><li> Fix dezellularisiert, rezellularisiertes oder Kontroll P3 Herzen in 4% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie das Gewebe in PBS 3x. </li><li> Platzieren des Gewebes in einer Lösung von 7,5% Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer bei 4 ° C, bis es sinkt. </li><li> Ändern, um die Lösung zu 15% Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer bei 4 ° C, wieder, bis sie sinkt. </li><li> Wärmen Sie das Gewebe auf 37 ° C, ersetzen die Hälfte des Volumens mit Gelatine-Lösung in 15% Saccharose und 0,1 M Phosphatpuffer und Äquilibrieren über Nacht. Konzentrationen von Gelatine werden schrittweise erhöht bis 1%, 2,5%, 5% und schließlich 7,5% zweimal. </li><li> Legen Sie die Proben in cryomolds mit frischen 7,5% Gelatine. Um die Form der dezellularisierten Proben wiederherstellen, flüssige Gelatine können in die Kammern als t perfundiert werdener Herzen geformt sind. Frieren durch die cryomolds auf flüssigem Stickstoff schwimmen. Bei -80 ° C. </li><li> Schneiden (10 &amp; mgr; m dick) Abschnitte mit einem Kryostaten. Bringen Sie die Folie nahe an der Schnittfläche und beobachten den Abschnitt von dem Messer auf die Oberfläche auf den elektrostatisch behandelten Folien aufgrund der Ladung losfahren. Trocknen Sie die Dias über Nacht und bei -80 ° C für eine spätere Analyse. </li><li> Entfernen Sie die Folien aus der Gefriertruhe, ins Gleichgewicht auf Raumtemperatur und dann in einem Coplin Gefäß mit PBS für 20 min bei 37 ° C, um die Gelatine aufzulösen. </li><li> Stain die geschnittenen Abschnitte aus Schritt 4.7 mit Hematoxylin und Eosin. Die Objektträger in einem Glas Coplin. Setzen Sie die hydratisiert Dias in Schritt 4,8 bis Hämatoxylin für 45 sec, Leitungswasser für 1,5 min, Puffer für 3 min, Leitungswasser für 1 min, Bläuungsmittel für 1,5 min, 80% Ethanol für 1 min, Alkoholisches Eosin Y für 8 sec, 80% Ethanol für 1 min, 100% Ethanol für 1 min 2x, Mittel (Xylol-Ersatz) für 1 min 3x, Deck mit Harz ClearingBasis Eindeckmittel. Untersuchen Sie die mikroskopisch Dias. </li><li> Um die Retention von ECM-Protein Reaktivität des Herzens ECM, Fleck für ECM-Strukturproteine ​​wie Kollagen IV bestätigen Sie mit der hydratisierten Folien in einer befeuchteten Kammer platziert und mit 10% normalem Eselserum (NDS) in phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,1% Behandlung von Triton -X100 (PBST) für 1 h bei Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen der Gewebeabschnitte zu bedecken. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit dem primären Antikörper der Wahl bei einer empirisch ermittelten Verdünnung in 5% NDS / PBST. Zum Beispiel wurde die Collagen IV-Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 150. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Objektträger mit PBST 3x und gelten mit einem Fluoreszenzfarbstoff ein sekundärer Antikörper der Wahl konjugiert. Verdünnen Sie die Antikörper durch einen empirisch ermittelten Betrag. Inkubieren für 1 h bei RT. Waschen mit PBS 3x. </li><li> Stain die Folien mit einem DNA-bindenden Farbstoff wie DAPI Abwesenheit von Zellkernen zu überprüfen, indem Sie einen DAPI enthält mounti mitng Medium, wenn die Abdeckung die Folien rutscht. </li><li> Untersuchen Sie die Folien mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 50 bis 400-fache. </li></ol> 5. P1 Neonatal Murine Kardiomyozyten für Rezellularisierung <ol><li> Spray jeden Welpen mit 70% Ethanol und enthaupten mit einem einzigen Einsatz Klinge. </li><li> Halten jedes Welpen zwischen dem Daumen und Zeigefinger, während der Brustkorb in der Mittellinie mit kleinen sterilen Schere aufgespalten wird, um die Brusthöhle zu exponieren. Wenden Sie Druck das Herz zu ermöglichen, sich frei von der Brust hervorstehen, während es frei von den großen Gefäße geschnitten wird und die Vorhöfe nur das ventrikuläre Gewebe zu verlassen. </li><li> Legen Sie jedes Herz direkt in ein 50 ml Röhrchen mit 20 ml eiskaltem Calcium, Bikarbonat frei Hanks gepufferte Salzlösung mit 20 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (CBFHH), bis alle Herzen gesammelt werden. </li><li> Saugen Sie das CBFHH und fügen 10-15 ml frischem CBFHH (eiskaltes) auf das Rohr. Waschen Sie das Gewebe durch das Gewebe in t wirbelner Rohr mehrmals. </li><li> Dekantiert die Lösung, die Herzen in eine 60 mm Kunststoff-Petrischale enthält. </li><li> Sezieren jede latent Vorhofgewebe aus den Herzen unter Vergrößerung auf Eis, indem sie es weg von den Herzen mit den Feder Schere trimmen. Mince bis die Ventrikel in homogene Größe kleine Stücke schneiden. Entfernen Sie alle getrennt nicht ventrikuläre Gewebe aus der Schale mit # 5 Pinzette. </li><li> Pipette so viel von der Lösung CBFHH wie erforderlich, um die Gewebefragmente in eine kleine sterile Fläschchen zu übertragen, das eine sterile Mikro Rührstab enthält. </li><li> Lassen Sie das Gewebe auf den Boden des Fläschchens zu sedimentieren und die CBFHH Lösung entfernen. </li><li> Make-up 50 ml einer Enzymlösung 1,75 mg / ml Trypsin, 20 ug / ml DNase II in CBFHH. Pipettieren 5 ml dieser Enzymlösung und fügen Sie sie in ein Röhrchen gehackten ventrikuläre Gewebe und auf einem Magnetrührer enthält. Rühre bei einer konstanten Geschwindigkeit (340 UpM) bei Raumtemperatur für 8 min. HINWEIS: Die Rührwirkung sollte schonend sein und doch erlaubenfür die Suspension der Schlämme. </li><li> Entfernen Sie die Fläschchen aus der Rührplatte und lassen Sie den Brei 3 min zu sedimentieren. Pipettieren und verwerfen die anfängliche verdauen Überstand, wie es Blutzellen und Gewebereste in erster Linie enthält. </li><li> Pipettieren eine zweite 5 ml Aliquot der Enzymlösung und fügen Sie es zum Verdauen Ventrikel. Man rührt 8 min und lassen Sie es für weitere 3 min zu sedimentieren. Bevor die Digests beginnen, bereiten zwei 50-ml-Röhrchen (mit der Bezeichnung 1 und 2), die jeweils mit 12 ml eiskaltem fötalen Rinderserum (FBS). Legen Sie eine 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb oben auf jedes Röhrchen. Pipettieren dieser Überstand durch den Filter auf dem Rohr 1. </li><li> Wiederholen Sie die Verdauung zusätzlich 8 mal, um die Platzierung des Digest Überstand zwischen den beiden Röhrchen, die FBS abwechseln. Teilen Sie die letzte Überstand gleichmäßig zwischen den Rohren 1 und 2 zu gleichen Volumina in jedem Röhrchen gewährleisten. HINWEIS: Jedes Röhrchen Sammlung wird nun 32,5 ml Gesamtvolumen der Zellsuspension enthalten. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen enthaltening den Überstand 150 xg für 6 min bei 4 ° C. </li><li> Während die Verdauung Teilmengen zu sammeln, bereiten fünf 100-mm-Gewebekulturplatten mit 6 ml Medium (Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-Glutamin) pro Platte. Inkubieren diese Aliquots bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min , um die Medien zu äquilibrieren. </li><li> Saugen Sie das CBFHH Enzymmischung und Resuspendieren der Zellen in den 30 ml Kulturmedien oben hergestellt, die Zellen aus den beiden Sammelröhrchen kombiniert. </li><li> Rück 6 ml der Zellsuspension zu jeder der 100-mm-Platten und Inkubation für 45 min bei 37 ° C. </li><li> Am Ende der Inkubation übertragen die nicht-adhärenten Zellen zu 5 neue Speisen und erneut inkubieren 45 min (die Fibroblastenfraktion dem Geschirr anhaften begonnen wird und getrennt werden können, falls gewünscht, ausgewachsen). </li><li> Am Ende der zweiten Runde der Pre-Plating, sammeln die Medien und nicht-haftenden Zellen aus den Schalen und drehen Sie die Medien bei 150xg für 6 min. </li><li> Abzusaugen überschüssige Medien , die Zellen auf die ungefähre gewünschte Konzentration zu bringen, (4,0 x 10 5 Zellen pro Konstrukt in 100 ul Perfusat). Entfernen eines aliquoten zum Zählen und oder Vitalitätstests 14. </li></ol> 6. Bioreactor Rezellularisierung von P3 Herz Matrix <ol><li> Vorbehandeln die isolierten Herzen Matrix mit Kulturmedien (siehe Schritt 5.15) über Nacht vor der Zugabe der Zellen. </li><li> Bauen Sie die Elemente einer Langendorff - System , wie in gezeigt. 2. Autoclave die Glasteile und Ethylenoxid sterilisieren die Plastikteile Sterilität zu gewährleisten. Verschiedenen Untereinheiten des Systems können in einer laminaren Strömungshaube zusammengebaut werden, bevor sie auf dem Stützgestell angebracht ist. Zirkulierende Wasserbad und beheizten Wasserströmungspfad wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen. </li><li> Füllen Sie das zusammengefügte System mit 120 ml Gewebekulturmedien (siehe Schritt 5.15). </li><li> Legen Sie die katheterisierte Herz Matrix aus Schritt 2.14 in einer 60 mm culeine 1-ml-Spritze mit 22 G x 1 Nadel beladen mit Zellsuspension aus Schritt 5.20 an den Katheter unter Vergrößerung ture Schale und zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass diese Anordnung das Herz zu vermeiden frei von Luftblasen ist Embolisation. </li><li> die 100 &amp; mgr; l der Zellsuspension in das Herz Matrix über den Koronararterien vorsichtig perfuse. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Spritze / Nadel-Kombination. HINWEIS: Eine langsame Perfusion von ca. 20 &amp; mgr; l pro min ist erforderlich, um die Zellen fließt aus den Adern zu verhindern, das Herz im Transit. </li><li> Mit einem stumpfen 22g Stummel an den Luer-Anschluss an der Unterseite des Bioreaktors Herzgefäßdeckel befestigt ist, schieben Sie den Katheter auf den Stummel. </li><li> Starten Sie die peristaltische Pumpe und zu beobachten , dass der Fluss geht wie in Abbildung 2 dargestellt. Der Ablauf geht aus dem Reservoir über die Pumpe durch die Blasenfalle in die in der Aorta in Schritt platziert Katheter 2.5 (rot Pfad in Fig. 2). Beachten Sie die Strömung des Herz-Kreislauf aus der Venes und tropft von der Spitze, Umlauf zum Medienspeicher. HINWEIS: Die Perfusionsfördermenge von individuellen Faktoren wie dem Gefäßwiderstand des Konstrukts und der Größe des Herzens, aber eine Rate von 50 bis 100 &amp; mgr; l abhängt / min ist ein guter Ausgangspunkt. An Zwischenzeitpunkten können Funktionsprüfungen durchgeführt werden. Die Größenskala des Neugeborenen rezellularisiertes Herz begrenzt die Beurteilungen, die durchgeführt werden können , aber wir haben festgestellt , dass optisch - basierten Systemen verwendet werden können , das Verhalten zu quantifizieren zu schlagen , so wie sie bei erwachsenen Rattenherzen verwendet wurden. 4 Das Konstrukt kann für längere perfundiert werden Zeiträume (bis zu 23 h). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Abhängigkeit dieser Technik auf wiederholte Perfusionen des Herzens ist die Vermeidung einer Embolie eine wichtige Komponente für ein erfolgreiches Ergebnis. Von der anfänglichen Katheterisierung des Herzens in den Schritten 2,2-2,6, zu den Veränderungen der Lösung zwischen den Schritten von 2,8 bis 2,14, sind Manipulationen, die Einführung von Luftblasen, die Kompromiss den Fluss des Perfusats in das Myokard zulassen. Aufgrund der geringen Größe des neonatale Herz, auch in das Gefßsystem winzige Blasen kann eine te...

Herzinsuffizienz ist häufig und tödlich. Es ist eine progressive Erkrankung, die zu einer verminderten Kontraktilität des Herzens führt, die Durchblutung von Organen und lässt die metabolischen Anforderungen des Körpers unerfüllten beeinträchtigt. Es wird geschätzt , dass 5,7 Millionen Amerikaner an Herzinsuffizienz leiden , und es ist die Hauptursache für Hospitalisierung in den Vereinigten Staaten 9. Die kollektive Kosten der Patienten bei Herzinsuffizienz in den Vereinigten Staaten die Behandlung von mehr als 300.000.000.000 $ Dollar pro Jahr 9-10. Die einzige definitive Therapie für Endstadium Herzinsuffizienz ist orthotope Herztransplantation. Jedes Jahr wird geschätzt , dass mehr als 100.000 Spenderherzen für Herztransplantationsverfahren in den Vereinigten Staaten 1-2 benötigt werden. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Spendern werden nur rund 2.400 Transplantationen pro Jahr in den USA 2 durchgeführt. Offensichtlich muss diese Organmangel behandelt werden als andere Strategien erforderlich sind, für transplanta zusätzliche Organe zu produzierention und im Idealfall würden diese Organe autologe, um die Komplikationen, die mit Ablehnung und Lebensdauer Immunsuppression verbunden zu vermeiden. Mammalian adulten Kardiomyozyten zeigen eine begrenzte Regenerationsfähigkeit auf Verletzung aber die jüngsten Hinweise darauf , dass Säugetier-neonatalen Herzen eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen 5-8 halten. Insbesondere folgende Teil chirurgische Resektion, ein regeneratives Fenster wurde zwischen der Geburt und der postnatalen Tag entdeckt 7. Diese regenerative Periode wird durch einen Mangel an fibrotische Narbe, die Bildung von Neovaskularisation, die Freisetzung von angiogenen Faktoren aus dem Epikard und Kardiomyozyten Proliferation 5-8 , 11. Diese regenerative Zeitfenster bietet das Potenzial für die Neugeborenen-Herz als neuartige Materialquelle für die Entwicklung eines bioartifiziellen Herz verwenden. Die extrazelluläre Matrix ist bekannt, wichtige Hinweise zur Verfügung zu stellen cardiomyocyt zu förderne Proliferation und Wachstum. Deutliche Unterschiede in der Verfügbarkeit von Molekülen in der neonatalen und adulten Matrizen 12 und ihre Fähigkeit , die Regeneration zu fördern , wurden 13 untersucht. ein ECM-Gerüsts für zellulare Repopulation zu bieten und die Erzeugung eines bioartifizielle Herz dezellularisierte erwachsenen Matrices wurden in mehreren Studien verwendet. Während diese Studien und neue Entdeckungen in der Stammzellentechnologien werden schnell voran, haben mehrere Hürden noch erfüllt werden. Zum Beispiel, Einschränkungen bei der Erhaltung native Struktur der Matrix, zellulären Integration in die Matrix Wand, und die Fähigkeit, die Proliferation und das Wachstum aller begrenzen den Erfolg dieses Ansatzes zu unterstützen. Während überlegen haben regenerative Attribute der Neugeborenen-Herz zugeschrieben worden ist, haben sich die praktischen Aspekte der Verwendung eines solchen Gewebes seine Explorations begrenzt. Basierend auf der nachgewiesenen Regenerationsfähigkeit des Neugeborenen-Herz haben wir durch die Entwicklung eines neuartigen Matrizen entwickeltTechnik der Dezellularisierung für die P3 Maus Herz. Der P3 Herz wurde für diese Studien ausgewählt , da es innerhalb des Fensters von Herzregeneration wie zuvor 6 bestimmt aber das Herz ist groß genug , um zu ernten, und Dezellularisieren recellularize. Das Ziel dieser Studie ist es, die Durchführbarkeit der Schaffung einer Matrix aus einer neonatalen Mäuseherz zu demonstrieren. Unsere Studien belegen für die Machbarkeit von Dezellularisieren einer Minute, Neugeborenen-Herz, während die strukturelle und proteinöse Integrität des ECM beibehalten wird. Wir zeigen auch die Fähigkeit, dieses Herz-ECM mit mCherry exprimierenden Kardiomyozyten recellularize und wir haben diese Kardiomyozyten für die Expression von verschiedenen kardialen Marker folgende Rezellularisierung sucht. Diese Technologie wird für die Prüfung der Überlegenheit einer neonatalen Matrix für die Entwicklung eines bioartifiziellen Herzens ermöglichen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Materialien für die Isolierung von Mausherzen</stark></td></tr><tr><td>P1-Mauswelpen (wie abgebildet; B6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>60 mm Kulturschale</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4 (steril)</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Einwegklinge</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Standardschere</td><td>Moria Bonn (Fine Science Tools)</td><td>14381-43</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Federschere 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Vannas Federschere - 3 mm</td><td>Cutting Edge Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>#5 Pinzette</td><td>Dumnot (Fine Science Tools)</td><td>11295-00</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td colspan="4">2. Materialien für die Dezellularisierung</stark></td></tr><tr><td>Inlet Adapter</td><td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>autoklavierbar</td></tr><tr><td>Septum</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>autoklavierbar</td></tr><tr><td>1/8 Zoll ID x 3/8 OD C-Flex Schlauch</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>autoklavierbar</td></tr><tr><td>Luer auf 1/8" Schlauchtülle Adapter</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>autoklavierbar</td></tr><tr><td>Luer auf 1/8" Schlauchtülle Adapter</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>autoklavierbar</td></tr><tr><td>Prolene 7-0 chirurgisches Nahtmaterial</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>Ringständer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td></td><td>Clamp Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>regulärer Clamp-Halter</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>60-cm³-Spritzenzylinder;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Becher</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>22 G x 1 Spritzennadel</td><td>BD</td><td>305155</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>12 cc Spritze</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>3-Wege-Absperrhahn</td><td>Smith Medical</td><td>MX5311L</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>PE50-Schlauch</td><td>BD Clay Adams Intramedic</td><td>427411</td><td>Muss durch Hitze verformbar sein. Polyethylen empfohlen.</td></tr><tr><td>1% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Ultrapure Qualität empfohlen. Frische Lösung herstellen und Filter vor Gebrauch sterilisieren.</td></tr><tr><td>1% Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Frische Lösung aus einem Vorrat von 10 % herstellen und vor Gebrauch mit Filter sterilisieren.</td></tr><tr><td>Steriles dH2O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>oder MilliQ systemgereinigtes Wasser.</td></tr><tr><td>1x Pen/Strep</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>oder gleichwertig &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">3. Materialien für die DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>, Fisher</td><td>BP1700></td><td>30 U/mg Aktivität</td></tr>, <tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Tris-Base-/Hydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Pico-Green dsDNA-Assay-Kit</td><td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td>benötigt ein Fluorimeter, um anzuzeigen</td></tr><tr><td colspan="4">4. Verfahren zum Fixieren und Schneiden von Gewebe</stark></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>Gelatine Typ A aus Schweinehaut</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>muss mindestens 300 Blüten haben</td></tr><tr><td colspan="4">5. Methode für die Gewebehistologie</stark></td></tr><tr><td>Kryoformen 10 x 10 x 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker/Bright</td><td>Model OTF</td><td>oder gleichwertige</td></tr><tr><td>Objektträger&nbsp; 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Hämatoxylin 560&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801570</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>Define</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3803590</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>blauer Puffer&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3802915</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>alkoholischer Gehalt an Eosin Y 515&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801615</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>Formel 83 Xylol-Ersatz&nbsp;</td><td>CBG Biotechnologie&nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Permount Eindeckmedium</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>Kollagen-IV-Antikörper</td><td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>oder</td></tr> <tr><td>gleichwertiger Alpha-Actinin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>AB9465</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>mCherry Antikörper</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>NKX2.5-Antikörper</td> Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Maus-Antikörper AF488 Antikörper</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Esel Anti-Huhn AF594 Antikörper</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&nbsp;</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziege CY5 Antikörper</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Eindeckmittel mit DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td colspan="4">6. Isolierung von ventrikulären Kardiomyozyten bei Neugeborenen mittels Prä-Platte</stark></td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg frei),</td> <td>Hyklon</td><td>SH30031,02</td><td>oder gleichwertigem</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>oder gleichwertigem</td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>oder gleichwertigem</td></tr><tr><td>50-ml-Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>oder gleichwertigem</td></tr><tr><td>Primeria 100 mm Platten</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>Primeria-Oberfläche verbessert die Bindung von Fibroblasten und fördert eine höhere Myozytenreinheit</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Vitamin B12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>oder gleichwertige</td></tr><tr><td>Fibronektin-beschichtete Platten&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Glaswaren für Herz-Bioreaktoren</td><td>Radnoti Glass Technology</td><td>120101BEZ</td><td>Muss durch Autoklavieren oder Gas sterilisierbar sein.</td></tr></tbody></table>

neonatal cardiac scaffolds: neuartige matrices für regenerative studies

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Die einzige definitive Therapie für Herzinsuffizienz im Endstadium ist die orthotope Herztransplantation. Es wird geschätzt, dass jedes Jahr mehr als 100.000 Spenderherzen für Herztransplantationen in den Vereinigten Staatenbenötigt werden 1-2. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Spendern werden in den USA nur etwa 2.400 Transplantationen pro Jahr durchgeführt2. Zahlreiche Ansätze, von zelltherapeutischen Studien bis hin zur Implantation mechanischer Unterstützungssysteme, wurden entweder allein oder in Kombination unternommen, um das Herz dazu zu bringen, sich selbst zu reparieren oder das versagende Herz zu schonen3. Trotz dieser Bemühungen werden ventrikuläre Unterstützungssysteme immer noch weitgehend als Brücke zur Transplantation eingesetzt, und der Nutzen von Zelltherapien ist zwar vielversprechend, aber immer noch auf klinische Studien beschränkt. Darüber hinaus wurde eine direkte Xenotransplantation versucht, aber der Erfolg war aufgrund der Immunabstoßung begrenzt. Es liegt auf der Hand, dass eine andere Strategie erforderlich ist, um zusätzliche Organe für die Transplantation zu produzieren, und im Idealfall wären diese Organe autolog, um die Komplikationen zu vermeiden, die mit der Abstoßung und der lebenslangen Immunsuppression verbunden sind. Bei der Dezellularisierung werden residente Zellen aus Geweben entfernt, um die native extrazelluläre Matrix (ECM) oder das Gerüst freizulegen. Die Perfusionsdezellularisierung bietet die vollständige Erhaltung der dreidimensionalen Struktur des Gewebes, während der Großteil der mechanischen Eigenschaften des Gewebes intakt bleibt4. Diese Gerüste können für die Wiederbesiedlung mit gesunden Zellen verwendet werden, um Forschungsmodelle und möglicherweise dringend benötigte Organe für die Transplantation zu generieren. Wir haben die Gerüste von neonatalen Mäusen (P3), von denen bekannt ist, dass sie bemerkenswerte kardiale Regenerationsfähigkeiten behalten,5-8 der Dezellularisierung durch Detergenzienz ausgesetzt und diese Gerüste mit murinen Herzzellen neu besiedelt. Diese Studien unterstützen die Machbarkeit der Entwicklung eines neonatalen Herzkonstrukts. Sie ermöglichen es ferner zu untersuchen, ob die EZM des frühen postnatalen Herzens Signale enthält, die zu verbesserten Rezellularisierungsstrategien führen.

Dezellularisierung Im Durchschnitt ist die Zeit, um Dezellularisierung eines P3 Herz dieses Protokoll verwenden etwa 14 Stunden. eine durchschnittliche Herzgewicht von 23 mg für den P3 Neugeborener gegeben. Acellularity 3a zeigt eine völlig intakte P3 neonatale Herz (whole mount). 3b zeigt das gleiche Herz folgende Dezellularisierung. 4a und die ...

In diesen Studien bieten wir Methodik für Roman, Neugeborenen, murine Herzgerüste für den Einsatz in der regenerativen Studien.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Neuartige Matrices für Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, neuartige Gerüste aus neonatalem mirianischem Herzmuskelgewebe zu erzeugen, um sie für regenerative Untersuchungen zu nutzen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der regenerativen Kardiologie zu beantworten. Sie bietet ein neuartiges Modell zur Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen, da die extrazelluläre Matrix aus proliferationsfähigen Herzmuskelgewebe stammt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Entdeckung von Neuerungen in der extrazellulären Matrix von Neugeborenen ermöglicht. Stefan Kren, ein Techniker in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, ziehen Sie einen vier Zentimeter langen Abschnitt PE 50-Schlauch über eine kleine Alkoholflamme, um einen kleineren, dünneren Katheter herzustellen. Schneiden Sie die Enden auf die geeigneten Maße zu, um von jeder Seite des PO aus zwei symmetrische Katheter zu erhalten, und halten Sie ein geschnittenes Ende des Schlauchs kurz in die Flamme, um eine Zinkenplatte an der Öffnung am dünnen Ende anzuschmelzen. Füllen Sie danach eine 12-Milliliter-Spritze mit PBS und setzen Sie einen Dreihahn auf die Spritze. Befestigen Sie eine 22-Gauge-Nadel am Dreihahn und stechen Sie mit der Nadel durch die Septum. Danach schieben Sie den Katheter aus PE-Schlauch auf die Nadel und spülen die Gesamteinheit mit PBS aus. Wenn die Kathetereinheit bereit ist, desinfizieren Sie den Thorax des Neugeborenen mit 70 %igem Ethanol. Anschließend schneiden Sie mit einer herkömmlichen Schere die Haut vom Brustkorb ab, während Sie mit einer Pinzette Nr. 5 das Gewebe seitlich zur Seite ziehen.Als Nächstes perforieren Sie die Bauchwand knapp unterhalb des Sternums und greifen den Xyphoidfortsatz mit der Pinzette. Heben Sie das Sternum rostral vom Körper weg, während Sie durch die Rippen auf beiden Seiten des Brustkorbs schneiden, und klappen Sie den Rippenbogen nach oben zurück. Sobald das Herz sichtbar ist, ziehen Sie seitlich am Thymus, um die beiden Hauptlappen zu dissezieren, wodurch der Aortenbogen sowie die Vena cava und die Lungenvenen freigelegt werden.Unter Verwendung von 10 cm langen Feder-Scheren durchtrennen Sie die großen Arterien vom Aortenbogen sowie die Aorta selbst. Fassen Sie die Enden der durchtrennten Gefäße an, um das Herz nach vorne zu klappen, es so von Luftröhre und Speiseröhre zu lösen, und schneiden Sie zwischen Lunge und Herz sowie beidseits des Herzens, um die pulmonale Gefäßversorgung und die übrigen großen Venen zu durchtrennen. Anschließend fassen Sie die durchtrennten Enden der großen Gefäße an und entfernen das Herz aus dem Mediastinum, wobei Sie es in eine 60 mm große Kulturschale mit steriler PBS-Lösung legen.Um das Herz zu dezellularisieren, stellen Sie die Kulturschale unter ein Stereomikroskop und führen Sie die Kanülennadel in die Aorta ein, und zwar bis zur Aortenklappe, aber nicht darüber hinaus. Sichern Sie die Nadel mit einer Schlinge aus 7-0-Nahtmaterial, wobei die Kanülenphalanx proximal an der Schlinge anliegt und eine dichte Abdichtung bildet, und perfundieren Sie das Herz vorsichtig mit PBS. Wenn keine Leckagen auftreten, wird sich das Gewebe gleichmäßig aufhellen, während das latente Blut entfernt wird.Setzen Sie die Septum in den Hals des Einlassadapters ein und falten Sie die Seiten der Septum über das Glas. Befestigen Sie anschließend ein Reservoir, das mit 60 Milliliter 1%iger Natriumlaurylsulfat-Lösung in destilliertem Wasser gefüllt ist, über eine Leitung ausreichender Länge, um eine Säule zu erzeugen, die einen Druck von 20 Millimeter Quecksilbersäule erzeugt, und perfundieren Sie das Herz 14 Stunden lang mit SDS. Am Ende der Perfusion ist das Herz durchscheinend und weist kein erkennbares verbleibendes Gewebe mehr auf.Spülen Sie das System bis zum Hahn mit der verbleibenden SDS-Lösung durch und füllen Sie das Reservoir mit 10 Milliliter entionisiertem Wasser. Anschließend spülen Sie das Herz nacheinander mit 10 Milliliter 1 % Triton X-100, 10 Milliliter entionisiertem Wasser und 60 Milliliter PBS, das Penicillin und Streptomycin enthält, durch. Nach der letzten Perfusion lagern Sie das Herz in PBS mit Antibiotika bei vier Grad Celsius.Um das Gewebe erneut zu besiedeln, überführen Sie die katheterisierte Herzmatrix unter einem Stereomikroskop in eine 60 Millimeter große Kulturschale und verbinden eine mit einer 22-Gauge-Nadel ausgestattete 1-Milliliter-Spritze, die mit den gewünschten Zellen beladen ist, mit dem Katheter. Stellen Sie sicher, dass die Vorrichtung blasenfrei ist, und perfundieren Sie vorsichtig 20 Mikroliter der Zellsuspension pro Minute über die Koronararterien in die Herzmatrix. Sobald 100 Mikroliter der Zellen zugeführt wurden, trennen Sie die Spritze ab und schieben den Katheter auf eine 22-Gauge-stumpfe Nadel, die an der Luer-Anschlussstelle an der Unterseite des Deckels eines Bioreaktor-Herzgefäßes befestigt ist.Starten Sie nun die peristaltische Pumpe und vergewissern Sie sich, dass der Fluss vom Reservoir über die Pumpe durch den Blasenfänger zum Katheter verläuft und dass die Herzdurchblutung aus den Venen austritt und aus der Herzspitze tropft, wobei sie zum Mediumreservoir zurückgeleitet wird. In diesen Abbildungen ist die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung intakter und dezellularisierter Herzen dargestellt. Beachten Sie das Fehlen von Hämatoxylin-positiven Kernen sowie die Verringerung eosinophiler Strukturen im dezellularisierten Herzen.Um den Gehalt an extrazellulärer Matrix in intakten und dezellularisierten neugeborenen Herzen zu bewerten, zeigt die Immunfärbung, dass Kollagen IV in beiden, dem intakten und dem dezellularisierten Herzen, stark exprimiert wird und dass die Lokalisation dieses Proteins nach der Zellentfernung erhalten bleibt, während die DAPI-positiven Kerne effektiv entfernt werden. Der DNA-Gehalt ist in neugeborenen Herzen nach der detergentenbasierten Dezellularisierung ebenfalls verringert, was mit Berichten übereinstimmt, die die detergentenbasierte Dezellularisierung in anderen Geweben verwenden. In diesen Bildern können rekellularisierte Kardiomyozyten beobachtet werden, die in die Wand des linken Ventrikels eingewandert sind.Bis zu 23 Tage nach der Perfusion können diese migrierten Zellen positiv für Marker von kardialen Vorläuferzellen, mCherry, differenzierte Kardiomyozyten-Marker oder DAPI sein, wobei die Mehrheit der Zellen alle vier Marker exprimiert. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in 34 Stunden abgeschlossen werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, keine Luft über die Perfusionsapparatur einzubringen, um eine Embolie des Herzens zu vermeiden.Nach dieser Methode können Gelproduktion und 3D-Druck verwendet werden, um proliferative Transplantate oder sogar 3D-Herzen in vitro herzustellen. Diese Technik könnte den Weg dafür ebnen, dass Forscher die kardiale Regeneration fördern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein neugeborenes Mausherz dezellularisiert und rekellularisiert.Beachten Sie, dass die Arbeit mit Natriumlaurylsulfat gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer N-95-Maske oder die Nutzung einer Abzugshaube, wenn Sie das trockene Pulver des Reagenz handhaben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Generierung, Hochdurchsatz-Screening und Biobanking von human-induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Herzsphäroiden

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Neonatal Cardiac Scaffolds: Neuartige Matrices für Regenerative Studies

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