Name: Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Membranprotein-Mikrokristallen in lipider kubischer Phase für serielle Femtosekunden-Kristallographie. Diese Methode ermöglicht Strukturbestimmung bei Raumtemperatur mit minimalem Probenverbrauch.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health gewährt R01 GM108635 und U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Seed Grants-Award und NSF STC Auszeichnung unterstützt 1231306. Wir A. Walker mit Manuskript Vorbereitung für die Unterstützung danken.

1. Filterlösungen und Lipids Anmerkung: Alle Reagenzien und Werkzeugen in diesem Protokoll verwendet wird, sollte so rein wie möglich sein, um die Einführung von teilchenförmigen Verunreinigungen in den Proben zu vermeiden, die die LCP-Injektor verstopfen können. <ol><li> Filter alle Fällmittel Lösungen und geschmolzenen Lipide durch 5 um Spin-down-Filter. Saubere Spritzen gründlich und wenden Druckluft zu trocknen. Verwenden Sie optional ein tragbares Reinraumhaube Staubpartikel oder Fasern während der Probenvorbereitungsverfahren Trapping zu verhindern. </li></ol> 2. Rekonstitution von MP in LCP Anmerkung: Die Wahl der besten LCP Wirts Lipid zur Kristallisation auf dem Ziel MP abhängt, und wird typischerweise während der Host - Lipid - Screening Kristallisationsversuche 14 identifiziert. Monoacylglycerole (MAGs) stellen die häufigste Klasse von Lipiden für LCP Kristallisation 15 verwendet. Die Protokolle basieren auf der Verwendung von 9,9 MAG (Monoolein) alsHost - Lipid, da dies die erfolgreichste Lipid in meso Kristallisation bisher 16 ist. 9.9 MAG kann durch andere LCP Wirts Lipide oder Lipidmischungen nach Berücksichtigung der Unterschiede in ihrer Phasenverhalten ersetzt werden. Zum Beispiel im Fall von GPCRs ist Monoolein typischerweise mit Cholesterol zur Stabilisierung Rezeptor dotiert. Hier verwenden 9: 1 (w / w) 9,9 MAG: cholesterol Mischung als Wirts Lipids. <ol><li> Mix Ziel MP, die in Waschmittel Mizellenlösung gereinigt wird, mit dem entsprechenden LCP Wirts Lipid unter Verwendung von zwei Spritzen (# 1 und # 2) und einen Kuppler, wie zuvor beschrieben 13. </li><li> Kurz gesagt, Last Spritze # 1 mit dem geschmolzenen Lipid und Spritze # 2 mit der MP-Lösung. Verwenden eines Verhältnisses zwischen Lipid- und wässriger MP - Lösung auf den Pegel entspricht, der gerade unterhalb des maximalen Hydratationskapazität des entsprechenden LCP Wirts Lipid ist beispielsweise 3: 2 v / v Lipid / MP - Lösung für 9,9 MAG, 1: 1 v / v Lipid / MP-Lösung für die meisten anderen kürzeren Ketten MAGs (7.9 MAG9,7 MAG, etc.). </li><li> Schließen Sie die Spritzen durch eine Spritze Koppler und beginnen Mischen der Substanzen durch die Kolben Drücken der Mischung hin und her zwischen den Spritzen zu bewegen, bis die Probe homogen und transparent wird. Bereiten Sie ca. 50 &amp; mgr; l der LCP-Probe für die Sammlung eines kompletten Datensatz von LCP-SFX. Die endgültige Probenvolumen wird in der Regel um etwa einen Faktor von zwei (auf ~ 100 &amp; mgr; l) nach der Proben Konsolidierung und Lipid-Titration (Abschnitt 5) zu erhöhen. </li></ol> 3. Definieren von Kristallisation in Spritzen <ol><li> Nach einer transparenten und homogenen LCP gebildet wird, die gesamte Probe in die Spritze zu bewegen # 2. Trennen Sie Spritze # 1, während die Kupplung zu Spritze # 2 verbunden zu halten. </li><li> Schließen Sie eine abnehmbare Nadel (Gauge 26s) auf einen anderen 100 ul saubere Spritze (Spritze # 3) und absaugen etwa 70 &amp; mgr; l der Fällmittellösung hinein. Die Zusammensetzung des Fällungslösung, die f triggertormation von High-Density-Mikrokristallen ist einzigartig für jedes Ziel MP, und vor dem Weitergehen zu diesen Protokollen bestimmt werden. Hier verwenden eine optimierte Fällmittellösung Zusammensetzung , die Duschen von Mikrokristallen des A 2A - Rezeptor (40 mM Natriumthiocyanat, 100 mM Natriumcitrat , pH 5, 26-28% PEG400) ergibt. </li><li> Ziehen Sie die Nadel aus der Spritze # 3, während die Teflonhülse in der Spritze zu halten. </li><li> Schließen Sie Spritzen # 2 und # 3 durch den Koppler, um sicherzustellen, dass Teflon Ferrulen in beiden Spritzen richtig an Ort und Stelle sind. Vorsichtig schrauben Sie den Koppler fest in Position. </li><li> Richten Sie die gekuppelten Spritzen vertikal mit Spritze # 2 auf der Unterseite und injizieren das Protein beladene LCP Probe aus der Spritze # 2 in die Spritze # 3 langsam und stetig, bis die LCP-String den Kolben der Spritze # berührt 3. Das LCP injizierte Volumen wird 1/10 des ursprünglichen Fällmittel Volumen in der Spritze # 3 (~ 7 ul) bis etwa betragen. Überprüfen Sie die Lautstärke durch das Scale-Lesung zu beiden syringes (beide Kolben von etwa 7 &amp; mgr; l bewegen sollte). </li><li> Trennen Sie Spritze # 2. Der Koppler wird jetzt nur Spritze # 3 verbunden ist, die die Probe in die Fällungslösung eingetaucht enthält. </li><li> Verwenden Parafilm vollständig Spritze # 3, einschließlich der Kolbenspritze Schnittstelle abzudichten, das Öffnungsende des Kopplers und der Nadelmutter. Unvollständige Abdichtung während dieses Schrittes können die Fällungsbedingungen führen zu ändern und um die Probe zu entwässern. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,7 Kristallisation in 6 weiteren Spritzen einzustellen (# 4 # 9) insgesamt ~ 50 &amp; mgr; l der LCP-Probe (~ 7 ul LCP pro jeder Spritze) verwendet. </li><li> Shop verschlossenen Spritzen in einem Plastik verschließbaren Beutel mit einem oder zwei faserfreie Reinigungstücher vorgetränkt mit Wasser gegen Probe Austrocknung zu schützen. Verschließen Sie die Tasche und speichern Spritzen in einem 20 ° C Inkubator während des Kristallwachstums. </li></ol> 4. Kristallerkennung <ol><li> Entfernen Sie die Spritzen aus dem Inkubator Bild der LCP Proben direkt in den Spritzen (# 3 # 9) alle 12-24 h unter einem Stereomikroskop mit Kreuz polarisiertem Licht. Identifizieren Kristalle als dicht gepackte glänzenden Teilchen oder, im Falle von kleineren Kristallgrße als einheitliche glow vom LCP Filaments. </li><li> Rück die versiegelten Spritzen an den Beutel, und lagern bei 20 ° C für zukünftige Verwendung. </li></ol> 5. Proben Konsolidierung und Titration mit 7,9 MAG Anmerkung: Die Lipid Titrationsschritt hier beschriebene dient zwei Zwecken: a) die überschüssige Fällungsmittellösung absorbiert und b) Lipid zu verhindern beim Einspritzen in den XFEL Strahl einfriert. Wenn ein LCP Probe, bestehend aus 9,9 MAG in eine Vakuumkammer eingespritzt wird, für die Datenerfassung kann intensive Verdampfung der Probe abkühlen auf Temperaturen unterhalb des Gleichgewichtsphasenübergangstemperatur (~ 18 ° C), Teilen der Probe in eine lamellare kristalline Phase umzuwandeln (Lc). Diese Patches von LC-Phase, wenn sie von dem Strahl getroffen, erzeugen intensive Pulver diffrAktion Ringe , die einen empfindlichen Detektor 6, wie der Cornell-SLAC Pixelarraydetektor (CSPAD) beschädigen können. Titration von 9,9 MAG Probe mit einer kürzeren Kette Lipid (9.7 MAG oder 7,9 MAG) mildert dieses Problem, da solche Mischungen niedrigere Phasenübergangstemperaturen haben. Hier beschreiben wir Titration einer LCP bestehend aus 9,9 MAG mit einem 7,9 MAG. Wenn kürzerkettige MAGs (9.7 MAG, 7,9 MAG, etc.) für die Kristallisation verwendet werden , oder wenn serielle Daten Kristallographie bei Umgebungsdruck gesammelt werden 5.11 die Titration in Schritt ist weiterhin erforderlich, aber es kann die ursprüngliche LCP Wirts Lipid durchgeführt werden verwendet für Kristallisation. <ol><li> Etwa 1 Stunde vor dem Beginn der Datensammlung, entfernen Spritzen mit Proben aus dem 20 ° C Inkubator. </li><li> Wählen Sie 2-4 Spritzen für die Konsolidierung Probe basiert auf einer ähnlichen Kristall Aussehen und Ähnlichkeit der Kristallisationsbedingungen. </li><li> Vorsichtig die Parafilm entfernen aus den ausgewählten Spritzen abdichten. </li><li> Entfernendie Spritze Koppler und befestigen Sie eine saubere abnehmbare Nadel (Gauge 26s) mit dem ersten ausgewählten Spritze. Sanft und den Kolben langsam nach vorne schieben die Fällmittel Squeeze-out durch die Nadel in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Vorsicht walten bei diesem Schritt, da die Anwendung eines hohen Drucks auf den Kolben in diesem Schritt könnte zusammen mit der Fällungsmittellösung ein Teil des Kristall beladen LCP auszuwerfen, was zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Probe. </li><li> Stoppen Sie den Kolben, wenn die meisten der Fällmittel wurde entfernt, und das LCP an der Nadel Eingang angesammelt hat. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5,4-5,5 mit den anderen ausgewählten Spritzen. </li><li> Um die resultierenden LCP Proben konsolidieren, verbinden zwei Spritzen zusammen durch einen sauberen Koppler. </li><li> Drücken Sie den Kolben auf einer Spritze die gesamte Probe aus einer der Spritzen zu einem anderen zu übertragen. </li><li> Trennen Sie die leere Spritze. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,7-5,9 alle des Kristalls beladene LCP-Material von den beiden zu vier vorge zu konsolidieren-Ausgewählte Spritzen in eine Spritze. Entfernen Sie so viel Fällmittel wie möglich. </li><li> In ~ 5 &amp; mgr; l von 7,9 MAG oder der ursprünglichen kurzkettigeren MAG Host Lipid zu einer leeren Spritze. Verbinden Sie diese Spritze in die mit der konsolidierten Probe durch eine Spritze Koppler und mischen durch alternativ Spritzenkolben drücken. Wiederholen, bis alle Restlösung absorbiert wird und eine homogene und transparente LCP gebildet. Die endgültige Menge an LCP nach der Titration kann 20-35 &amp; mgr; l variieren abhängig von dem Volumen des überschüssigen Fällungsmittel und seine Zusammensetzung. </li><li> Bewegen Sie die gesamte gemischte LCP Probe in eine Spritze und die leere Spritze trennen. </li></ol> 6. Charakterisierung von Mikrokristallen <ol><li> Befestigen Sie eine LCP-Injektor Laden Nadel (Punktstil 3, Spurweite 22, ein Zoll in der Länge) auf die Spritze mit einem konsolidierten Probe. </li><li> Sorgfältig auswerfen ~ 1 &amp; mgr; l der LCP-Probe auf einem Glasträger und bedecken Sie es mit einem Deckglas. Drücken Sie vorsichtig auf dieDeckglas zu Sandwich ist die Probe. </li><li> Nehmen Sie Bilder des LCP Probe unter einem Stereomikroskop mit der höchstmöglichen Vergrößerung (in der Regel 100 x) eine Hellfeldbeleuchtung und Kreuzpolarisatoren verwenden. Wenn möglich, nehmen Sie zusätzliche Bilder , die eine UV-Fluoreszenz - Mikroskop und ein SONICC (zweiter Ordnung Nonlinear Imaging chiraler Kristalle) 17 Imager die Existenz von Protein - Mikrokristalle in der Probe zu bestätigen. </li><li> Schätzen Sie Kristallgröße und Dichte 10. Die ideale Kristalldichte für eine Datensammlung Experiment wird auf der Kristallgröße abhängig sind, der Durchmesser des Röntgenstrahls und der Durchmesser der LCP-Strömungskanal und in einem Kristall Trefferrate von etwa 10-40% führen. </li></ol> 7. Einstellung der Kristalldichte Hinweis: Wenn die Kristalldichte in Schritt 6.4 ist zu hoch gefunden, was zu einem großen Prozentsatz von mehreren Kristall-Hits, die Kristalle sollten verdünnt werden nach den unten aufgeführten Schritten die OptimierungProbe für die Datenerfassung. Wenn die Kristalldichte zu niedrig für eine effiziente Datensammlung in allen hergestellten Proben ist, dann sollten die Kristallwachstumsbedingungen erneut optimiert werden, da es zur Aufkonzentrierung MP-Kristalle in LCP keine zuverlässige Methode. <ol><li> Bereiten Sie die erforderliche Menge von reinem LCP werden zur Verdünnung verwendet, indem die LCP-Zusammensetzung (gleiche Lipid und Fällmittel) der ursprünglichen Probe mit Kristallen nachahmt, die verdünnt werden muss. </li><li> Verschieben Sie alle ordentlich LCP in einer Spritze. Nehmen Sie leere Spritze, aber lassen Sie den Koppler angeschlossen. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze, die die LCP-Probe mit Mikrokristalle enthält. Schließen Sie die Probenspritze an die Spritze, die ordentlich LCP durch den Koppler. </li><li> Mischen Sie den Inhalt der Spritzen durch sie zurückgeschoben und her durch den Koppler, bis Homogenität erreicht wird. </li><li> Wiederholen Sie Abschnitt 6 neu zu bewerten, die mikrokristallinen Dichte in der eingestellten Probe. </li></ol> 8. LCP Injector Laden einnd LCP-SFX Data Collection <ol><li> Ziehen Sie den Koppler aus der Spritze mit der Probe und fügen Sie eine 1 &quot;Laden Nadel an der Spritze. </li><li> Übertragung von 20-40 &amp; mgr; l der Probe in das Reservoir eines LCP Injektors. </li><li> Legen Sie die LCP - Injektor in die Probenkammer 18, den Injektor zu starten, stellen Sie die Durchflussrate und sammeln LCP-SFX - Daten. </li></ol> 9. Der Einbau von löslichen Protein-Kristalle in LCP Hinweis: Die Verwendung hochviskoser Medien, wie LCP, für die Lieferung von Kristallen von löslichen Proteinen ein Protein Verbrauch drastisch verringern können in einem seriellen Kristallographie Experiment. In diesen Schritten wird beschrieben, wie Kristalle von löslichen Proteinen in LCP zu integrieren. Kristalle können durch jede Technik, konsolidiert zusammen in Form einer Kristallsuspension filtriert und falls erforderlich, erhalten werden. <ol><li> Passen Kristalldichte in Suspension Kristall Trefferraten von ca. 10-40% zu gewährleisten. </li><li> Test die Kompatibilität der Fällungsmittellösung mit LCP mittels 7,9 MAG, 9,7 MAG oder eine 1: 1-Mischung von 7,9 und 9,9 MAG MAG als Wirts Lipids. </li><li> Mischungs ~ 25 &amp; mgr; l der Kristallsuspension mit ~ 25 &amp; mgr; l des Lipid-Host einen Spritzenmischer bis eine homogene LCP Formen verwenden. </li><li> Bewerten Kristallgröße und Dichte, wie in Abschnitt 6. Legen Sie die Probe in der LCP-Injektor und sammeln Daten beschrieben, wie in Abschnitt 8 beschrieben. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Protokolle beschrieben hier bieten einen allgemeinen Überblick über die Probenvorbereitung für ein Standard-LCP-SFX-Experiment mit einem LCP-Injektor. Basierend auf unserer Erfahrung, die Gesamtmenge der endgültigen Mikrokristall beladene LCP Probe benötigt , um einen vollständigen Datensatz zu sammeln ist in der Regel 50 bis 100 &amp; mgr; l (Tabelle 1; 25-50 ul anfänglichen Protein beladene LCP - Probe), abhängig von der Größe mikrokristallinen , Qualität und Dichte. Da jeder 100 ul gasdichte Glasspritze etwa 7 &amp; mgr; l von LCP in der Form einer vollständig ausgezogenen Schnur aufnehmen kann richtige und sogar Diffusion der Fällungsmittellösung in das LCP, mindestens vier bis sieben Proben in Spritzen zu gewährleisten, sollte hergestellt werden, jedes LCP-SFX Experiment. Da die Probe durch einen schmalen 20-50 um Durchmesser Kapillare extrudiert wird, ist es wichtig, alle Fremd partikuläre Material in der Probe zu vermeiden. Staub und Fasern, die gelegentlich in dem LCP eingeführt werden könntenProbe oder Fällmittel Lösungen können die Einspritzdüse Kapillare verstopfen und die Ausfallzeit während des Experiments zu erhöhen. Daher ist es wichtig, den Lipid- und alle Lösungen durch einen 5 &amp; mgr; m Porenfilter zu filtern, bevor Proben vorbereitet. Wahlweise kann ein Reinraum oder ein tragbares Reinraumhaube zur Probenvorbereitung verwendet werden. Diese Protokolle basieren auf der Verwendung von 9,9 MAG (Monoolein) als Wirt für Lipid MP Kristallisation. Sie sind jedoch nicht auf 9,9 MAG beschränkt und kann leicht an andere LCP Wirts Lipide oder Lipidmischungen nach der in der Lipidphase Verhalten die Unterschiede zu berücksichtigen angepasst werden. Die meisten der Strukturen der Abgeordneten in LCP kristallisiert wurden einer der MAGs erhalten unter Verwendung, mit 9,9 MAG bisher 15 der erfolgreichsten Vertreter zu sein. Der Hauptnachteil von 9,9 MAG für SFX Verwendung ist seine Übergang zu lamellaren Kristallphase auf unter 18 ° C abgekühlt, die oft auftritt, wenn die Datenerfassung wird in Vakuum durchgeführt. Die titratiauf 7,9 MAG in Abschnitt 5 dieses Protokoll beschrieben wird, liefert eine gute Lösung für dieses Problem. Nach unserer Erfahrung Kristalle widerstehen, eine solche Titration ohne Nebenwirkungen. Wenn jedoch die Zugabe von 7,9 MAG oder anderen kurzkettigen MAG nicht erwünscht ist, kann die Titration mit 9,9 MAG durchgeführt werden. In diesem Fall wird das Gas, das den Fluss von LCP während des Einspritzens in das Vakuum stabilisiert sollte aus Helium Stickstoff umgeschaltet werden, was die Bildung einer kristallinen Lipidphase in den meisten Proben, auf Kosten des mit einem weniger stabilen Probenstrom verhindern kann. Die gelartige Konsistenz von LCP hat einen großen Vorteil für die Verwendung als Kristallträgermedium, da es Anpassung der Rate Kristallfluss ermöglicht über einen weiten Bereich, geeignet für Serien Kristallographie Datensammlung bei modernen XFEL und Synchrotronquellen. Passend zu den Kristalldurchflussrate mit den XFEL Pulswiederholrate führt zu drastischen Reduzierung der Kristallverbrauch um Größenordnungen compared zu Flüssigkeitseinspritzung. LCP ist ein geeignetes Trägermedium für die Lieferung nicht nur von MP - Kristalle darin gezüchtet, sondern auch für Kristalle von löslichen Proteine ​​21. 24, für die Durchführung von Serien Kristallographie Experimente das Arsenal von Werkzeugen und Reagenzien erstrecken - Mehrere alternative viskos haben Medien Kristallträger vor kurzem 22 eingeführt. Außerdem serielle Kristallographie mit LCP als Kristallabgabemedium wurde bei herkömmlichen Synchrotronstrahlungsquellen, zumindest für gut beugende Kristalle 24,25 demonstriert. Zukünftige Aktualisierungen von Synchrotronstrahlungsquellen, die Röntgenstrahlintensität um Größenordnungen steigern, sowie Verbesserungen bei der Detektortechnologien, wird ein noch zugänglicher und attraktive Methode zur Strukturbestimmung Serien Kristallographie machen. LCP-SFX hat seine Wirksamkeit für MP Strukturbestimmung demonstriert. Für anspruchsvolle biologische Systeme (wie GPCRs oder makromolekularen Komplexen) wobei large, beugungs Qualität Kristalle sind schwer zu wachsen, LCP-SFX kann ein attraktives bieten, wenn nicht die einzige, durchführbare Option, um eine atomare Auflösung Struktur zu lösen. Mit all seinen Vorteilen, dh unter Verwendung von LCP als Matrix für MP Kristallisation und Kristall Lieferung, geringe Proteinverbrauch, das Fehlen von Strahlenschäden, Raumtemperatur Datenerfassung, Möglichkeiten der zeitaufgelösten Studien 26,27 und ohne Kristallernte Anforderung, LCP- SFX sollten eine wichtige Rolle in der Zukunft der Strukturbiologie spielen.

Röntgenkristallographie ist die erfolgreichste Technik bisher für die Lösung von atomarer Auflösung Strukturen von Membranproteinen (MPs). Kristallisation aus lipiden Mesophasen, die auch als lipidischen kubische Phase (LCP) bekannt ist , oder in meso Kristallisation, stellt eine der wichtigsten Entwicklungen in MP - Kristallographie, die die hochauflösende Strukturbestimmung von anspruchsvollen Ziele wie G - Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs aktiviert hat 1). Die jüngsten Fortschritte in LCP - Tools und Technologien haben diese Technik zur Verfügung zu einer großen Gemeinschaft von Strukturbiologen auf der ganzen Welt 2 gemacht. In vielen Fällen sind zu klein , die MP - Kristalle an in LCP bilden auch am weitesten fortgeschrittenen Mikrofokus- Synchrotron Strahlrohre eingesetzt werden, wo die Proben leiden jedoch , die von schweren Strahlenschäden und eine Verschlechterung vor ausreichendes Signal mit hoher Auflösung 3 erhalten werden kann. Ein neuer Ansatz zur kristallographischen Datenerfassungwurde mit der Inbetriebnahme des Freie-Elektronen-Laser (XFEL) erste Röntgen aktiviert. Das Verfahren beruht auf dem Prinzip der &quot;Beugung vor Zerstörung&quot; basiert, zunächst theoretisch 4 eingeführt und dann experimentell bestätigt , auf biologische Proben , die bei der Linac Coherent Light Source (LCLS) 3, der Pionier der Welt im harten XFELs. Ein XFEL erzeugt mit hoher Helligkeit Röntgenpulse innerhalb von wenigen Zehn Femtosekunden Dauer, die von einem ursprünglichen Kristall beugen, bevor die Proteinatome in Reaktion auf Strahlenschäden bewegen kann. In den anfänglichen Experimenten wurden Mikrokristalle kontinuierlich dem Schnittpunkt mit dem XFEL Strahl in einem wässrigen Strom durch eine Flüssigkeitseinspritzeinrichtung 5 erzeugt geliefert. Dieser Versuchsaufbau ist als serielle Femtosekunden-Kristallographie (SFX) bekannt. Der Hauptnachteil Flüssigkeitseinspritzdüsen für SFX der Verwendung ist die hohe Strömungsgeschwindigkeit, die folglich zehn bis hundert Milligramm gereinigtes Protein zum Sammeln einer kompletten Datensatz erfordert. Durch employing einen speziellen Injektor, der die gelartige LCP Proben (LCP Mikroextrusion Injektor) 6 verarbeiten kann, sind wir in einer LCP - Matrix gewachsen Mikrokristalle aus verschiedenen menschlichen GPCRs erfolgreich ausgeliefert und erhalten ihre hochaufgelöste Strukturen 6 - 9, mit einem deutlich reduzierten Protein Verbrauch auf unter 0,3 mg pro Datenmenge. Der Injektor besteht aus einem Behälter, der bis zu 20, 40 oder 100 &amp; mgr; l des Kristall beladene LCP und einer engen Kapillare (10-50 um Durchmesser) halten kann, durch die die Probe durch Anlegen einer Hochdruck extrudiert wird (bis zu 10.000 psi) von einem Hydraulikkolben mit einem Druck amplifizierten Stufe durch eine Flüssigkeit aus einer HPLC (high-performance liquid chromatography) Pumpe angetrieben. Der Strom von LCP Verlassen der kapillaren Düse wird durch eine parallele Strömung von nicht-reaktiven Gases (typischerweise Helium oder Stickstoff) stabilisiert. Hier bieten wir visuelle Demonstrationen der erforderlichen Schritte zur Vorbereitung und zu charakterisieren Probenfür ein LCP-SFX Experiment. Weitere Einzelheiten finden Sie in den veröffentlichten Protokollen 10. Als Beispiel werden wir Adenosin - A 2A -Rezeptor 11 und bereiten Kristalle dieses Proteins in LCP für die SFX Ansatz mit Hilfe der Röntgendatenerfassung verwenden. Während unsere Protokolle mit jedem Injektor von Streaming-LCP fähig kompatibel sind für die Datenerfassung durch serielle Kristallographie an XFEL und Synchrotronquellen, zur Veranschaulichung, werden wir die LCP-Injektor in Ref beschrieben verwenden. 6. Optimierte Fällmittel Bedingungen , die mit hoher Dichte Mikrokristalle in LCP produzieren sollte durch Hochdurchsatz - Kristallisation 12,13 Screening identifiziert werden , bevor dieses Protokoll fortfahren. Ein typisches Ablaufdiagramm für dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

<table><tbody><tr><td>LCP-Wirtslipid Monoolein (9.9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>Wirtslipid für das zu kristallisierende Protein</td></tr><tr><td>LCP-Wirtslipid Monoolein (9.9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&nbsp;</td><td>Wirtslipid für das zu kristallisierende Protein</td></tr><tr><td>LCP-Wirtslipid Monopalmitolein (9,7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>Wirtslipid für das zu kristallisierende</td></tr><tr><td>Protein LCP-Wirtslipid 7,9 MAG</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850534</td><td>Wirtslipid für die Tiration, um die Bildung von lamellärer Kristallphase (Lc) während der Probeninjektion zu vermeiden</td></tr><tr><td>Aufgereinigte Proteinlösung, konzentriert auf 20-50 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Zielprotein</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td>Zum Auflösen von Lipiden</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>Zum Waschen von Spritzen</td></tr><tr><td>Eleven 100 &#956; l Hamilton gasdichte Spritzen ohne Nadeln</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>Für die LCP-Aufbereitung</td></tr><tr><td>Acht Spritzenkoppler</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>Für die LCP-Vorbereitung</td></tr><tr><td>LCP-Injektor-Ladenadel</td><td>Hamilton</td><td>7804-01 Punktform 3, Länge 1 Zoll</td><td>Für LCP-Abgabe und Injektorbeladung</td></tr><tr><td>Abnehmbare</td><td>Nadel Hamilton</td><td>7768-01</td><td>Zum Entfernen von Fällungslösung</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Wird zum Versiegeln von Spritzen</td></tr> verwendet <tr><td>Fusselfreie Linsenreinigungstücher</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalfilterschläuche, Ultrafree-MC, 0,5 ml, Durapore 5 & micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>Wird zur Filtration von Fällungslösungen und Lipiden</td></tr> verwendet <tr><td>Objektträger, 1 Zoll x 3 Zoll</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Zwei Spritzflaschen mit feinen Spitzen. Eine mit Milli-Q oder destilliertem Wasser gefüllt, die andere mit Methanol</td><td>VWR</td><td>89094-640</td><td>Diese werden zur Reinigung der Spritzen, Nadeln und Kupplung verwendet. Zuerst wird Methanol verwendet, dann Wasser.</td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>Zum Föhnen von Spritzen, Nadeln, Aderendhülsen und Kupplungen</td></tr><tr><td>Schutzbrillen Druckluftdosen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Office Depot (Dust-Off)</td><td>527494</td><td>Für die Spritzenreinigung</td></tr><tr><td>Trockenblockheizung mit digitalem Temperaturregler</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&nbsp;</td><td>Wird zum Auftauen von Lipiden verwendet</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>Schleuderlösungen</td></tr><tr><td>Reinraum Mini - 12 Zoll tragbare Überdruckhaube mit HEPA-Filter</td><td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>Reinigung Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Stereo-Zoom-Mikroskop ausgestattet mit einem linearen Polarisator und einem rotierenden Analysator&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>UV-Mikroskop zur Überprüfung der Kristalldichte</td></tr><tr><td></td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>Optional, für Kristallbildgebungszwecke</td></tr><tr><td>SHG-Imager</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>Optional, für Kristallbildgebungszwecke</td></tr></tbody></table>

herstellung und lieferung von protein microcrystals in lipidische cubic phase für serial femtosekunden kristallographie

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Membranproteine ​​(MPs) sind wesentliche Bestandteile von Zellmembranen und primären drug targets. Rational Drug Design stützt sich auf genaue Strukturinformationen, die typischerweise durch Kristallographie gewonnen; jedoch MPs sind schwer zu kristallisieren. Die jüngsten Fortschritte in MP Strukturbestimmung hat sich stark von der Entwicklung der lipiden kubischen Phase (LCP) Kristallisationsverfahren profitiert, die in der Regel ergeben gut beugenden, aber oft kleine Kristalle, die bei herkömmlichen kristallographischen Datenerfassung an Synchrotronquellen von Strahlenschäden leiden. Die Entwicklung einer neuen Generation von Röntgen Freie-Elektronen-Laser (XFEL) Quellen, die extrem helle Femtosekundenpulse erzeugen hat keinen oder einen vernachlässigbaren Strahlenschäden Raumtemperatur Datensammlung von Mikrokristallen aktiviert. Unsere bisherigen Bemühungen LCP-Technologie mit Serien Femtosekunden-Kristallographie (LCP-SFX) haben dazu geführt, hochaufgelöste Strukturen von mehreren menschlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Kombination, which ein notorisch schwieriges Ziel für die Strukturbestimmung darstellen. In der LCP-SFX Technik wird LCP als Matrix für das Wachstum und die Lieferung von MP-Mikrokristalle auf den Schnittpunkt des Injektors Stroms mit einem XFEL Strahl zur kristallographischen Datenerfassung gewonnen werden. Es wurde gezeigt, dass LCP-SFX kann im wesentlichen die Beugungsauflösung zu verbessern, wenn nur Teil 10 um Kristalle vorhanden sind, oder wenn die Verwendung von kleineren Kristallen bei Raumtemperatur verschiedene Probleme im Zusammenhang mit größeren cryocooled Kristalle, wie Häufung von Fehlstellen zu überwinden, hohe Mosaizität und cryocooling Artefakte. Künftige Fortschritte in der Röntgenquellen und Detektortechnologien sollten serielle Kristallographie machen sehr attraktiv und praktikabel für die Umsetzung nicht nur bei XFELs, sondern auch an zugänglicher Synchrotron Strahlrohre. Hier präsentieren wir detaillierte visuelle Protokolle zur Herstellung, Charakterisierung und Lieferung von Mikrokristallen in LCP für serielle Kristallographie Experimente.Diese Protokolle umfassen Verfahren zur Durchführung von Kristallisationsexperimenten in Spritzen, Detektion und Charakterisierung der Kristallproben, Kristalldichte zu optimieren, Mikrokristall beladen LCP in die Einspritzvorrichtung zu laden und die Probe in den Strahl zur Datenerfassung liefern.

Im Folgenden beschreiben Vertreter mit Proben erhaltenen Ergebnisse , die durch die oben genannten Protokolle folgende, die es uns ermöglicht, SFX Daten sammeln und hochaufgelöste Strukturen von fünf menschlichen GPCRs lösen: Serotonin - Rezeptor 5-HT 2B mit einem Agonisten Ergotamin 8 (PDB ID 4NC3 in komplexen ), Smoothened - Rezeptor (SMO) im Komplex mit einem Antagonisten Cyclopamin 6 (PDB ID 4O9R), δ-Opioid - Rezeptor in Komplex mit einem bifunktionellen Peptidligand DIPP-NH 2 7 (PDB ID 4RWD), Angiotensin - Rezeptor im Komplex mit einem Blocker ZD7155 9 (PDB ID 4YAY) und ein Komplex zwischen Rhodopsin und 19 (PDB ID 4ZWJ) Arrestin; und zwei Test lösliche Proteine: Lysozym (PDB ID 4ZIX) und Phycocyanin (PDB ID 4ZIZ). 5-HT 2B vermittelt verschiedenen zentralen und peripheren physiologischen Funktionen des Neurotransmitters Serotonin. Dieser Rezeptorbei LCLS mit der cryocooled Struktur wurde verwendet, um die LCP-SFX-Methode, zu etablieren und zu validieren, indem die Raumtemperatur Struktur verglichen mit herkömmlichen microcrystallography an der Advanced Photon Source (APS) gelöst erhalten. Insgesamt ~ 100 &amp; mgr; l Probe mit LCP - Protein - Mikrokristalle (mittlere Größe von etwa 5 &amp; mgr; m) wurde für SFX Datensammlung hergestellt und verwendet, und die LCP-SFX Struktur 5HT 2B wurde bei 2,8 Å (Abbildung 2) 8 erfolgreich gelöst. Weitere nützliche Informationen über die Probenvorbereitung und Datenerfassung sind in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt. Smoothened-Rezeptor (SMO) ist ein Mitglied der Klasse F GPCRs und das molekulare Ziel des teratogen cyclopamine mit gut demonstriert Funktionen in der Embryonalentwicklung und Tumorwachstum. Zunächst relativ große Kristalle von SMO / Cyclopamin mit einer durchschnittlichen Größe von 120 × 10 × 5 &amp; mgr; m wurden erhalten und dann für die Daten collecti verwendetauf an einer Synchrotronquelle unter Verwendung von herkömmlichen Goniometers-basierten Kristallographie. Allerdings sind diese große Kristalle mit einer Mikrofokus-Strahllinie (10 &amp; mgr; m im Durchmesser) leiden großen Mosaizität (über 2-3 Grad) schlechte Beugungs erzeugt, wahrscheinlich aufgrund der Anhäufung von Kristallwachstumsdefekten oder von Wirkungen cryocooling bezogen. LCP-SFX, jedoch konnten wir Qualität Beugungsdaten bei LCLS von 5 &amp; mgr; m große Kristalle bei Raumtemperatur zu sammeln. Die Struktur wurde durch molekularen Ersatz bei einem anisotropen gelöst 3,4, 3,2 und 4,0 Å Auflösung entlang der drei Hauptachsen, deutlich die Lage von Cyclopamin in der Bindungstasche 6 (Figur 3) identifiziert. Alkaloid Opiate, wie Morphin, Targeting-μ-Opioidrezeptor (μ-OR) für schweren Schmerzbehandlung eingesetzt. Allerdings ist ihre umfangreiche Nutzung führt zu erworbenen Toleranz und Sucht. Die gleichzeitige Verabreichung von Morphinemit δ-Opioid-Rezeptor (δ-OR) -Antagonisten wurde, um die oben genannten Nebenwirkungen zu verhindern gezeigt, so dass die Suche nach Verbindungen mit einer gemischten δ-OR-Antagonisten und μ-OR-Agonisten Funktion zu fördern. Wir erhielten die anfänglichen Beugungsdaten auf δ-OR in einem Komplex mit einem bifunktionellen tetra-Peptid DIPP-NH 2 cryocooled Kristalle verwenden , die bei einer Synchrotron - Röntgenquelle auf 3,3 Å gebeugten Verwendung herkömmlicher Goniometer-basierten Datenerfassungsstrategie. Diese Daten zeigten eine teilweise mehrdeutig Elektronendichte für den Peptidliganden. Anschließend wurden XFEL Beugungsdaten bei Raumtemperatur erhalten und die Struktur wurde bestimmt bei 2,7 Å Auflösung 7 eine klare Dichte für den Liganden und dem Rezeptor zeigt. Diese Struktur bietet eine Gelegenheit für ein weiteres Verständnis Opioid-Rezeptorfunktion und Selektivität und wertvolle Erkenntnisse für die Entwicklung neuer Analgetika. 1 R) ist ein GPCR als primäre Regulator des Blutdrucks dient. Wir kristallisiert AT 1 R im Komplex mit einem Antagonisten ZD7155 in LCP. Optimierte Kristalle erreicht eine maximale Größe von 40 × 4 × 4 &amp; mgr; m 3 mit der besten Beugungs nur ~ 4 Å bei einer Synchrotronquelle erreicht. Durch Ändern Kristallisationsbedingungen, erhalten wir Duschen von kleineren Kristallen (10 × 2 × 2 &amp; mgr; m 3), die die Raumtemperatur Struktur bei 2,9 Å Auflösung unter Verwendung XFEL Strahlung zu erhalten , verwendet wurden. Insgesamt 2.764.739 Detektorbilder wurden gesammelt 9 einen kompletten Datensatz von etwa 65 &amp; mgr; l von Kristall beladene LCP entsprechend etwa 0,29 mg Protein zu machen. Der Gesamtzahl von Rahmen, wurden 457.275 als Kristall Treffer identifiziert, zu einer Trefferrate von 17% entspricht, von denen 73.130 Rahmen (16% der Treffer) wurden erfolgreich indexiert und integriert. GPCRs Signal durch zwei Hauptwege vermittelt durch entweder G-Proteine ​​oder Arrestine. Die Struktur des β 2 -adrenergen Rezeptors an einen heterotrimeren G s Protein gebunden wurde vor ein paar Jahren vor 20 gelöst, während die Struktur eines GPCR im Komplex mit arrestin schwer fassbar geblieben war. Wir erhielten kleine Kristalle eines Rhodopsin-Arrestin-Fusionsprotein in LCP, die 25 bis 30 &amp; mgr; m in der längsten Dimension erreicht, aber trotz umfangreicher Optimierungs gebeugt nur ~ 7 Å Auflösung an Synchrotronquellen. Durch die Verwendung der LCP-SFX - Methode innerhalb von 12 Stunden von XFEL Meßzeit sammelten wir 22.262 Kristall Hits, von denen 18.874 Muster wurden erfolgreich indiziert und integriert , um die Auflösungsgrenzen von 3,8 anisotroper / 3,8 A / 3,3 A 19. Rhodopsin-Arrestin ist eine sehr anspruchsvolle Proteinkomplex, der Strukturbestimmung traditionellen Ansätzen widerstanden. Die erfolgreiche Bestimmung dieser Struktur hat gezeigt, das große Potenzial vondie LCP-SFX Methode schwierige Probleme für die Bekämpfung und bot eine einzigartige Gelegenheit, den Mechanismus der arrestin voreingenommen Signalisierung in GPCRs zu untersuchen. Schließlich wird neben Proteinkristalle in der lipidischen Phase gezüchtet Membran unsere Probenvorbereitung und Lieferverfahren wurde für lösliche Proteinkristalle erfolgreich angepasst, wobei LCP als Trägermedium für die Lieferung von Kristallen verwendet wird, uns ermöglichen drastisch die Proteinverbrauch verringern zur Strukturbestimmung erforderlich. Strukturen von zwei Modellproteinen, Lysozym und Phycocyanin, wurden bei 1,89 Å und 1,75 Å Auflösung bzw. durch dieses Verfahren gelöst, unter Verwendung von weniger als 0,1 mg jedes Proteins 21. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Serotonin - Rezeptor - 2B </td><td> smoothened Rezeptor </td><td><strong&gt; Δ-Opioid-Rezeptor </td><td> Angiotensin - II - Rezeptor Typ 1 </td><td> Rhodopsin-Arrestin </td><td> Lysozym </td><td> Phycocyanin </td></tr><tr><td> PDB ID </td><td> 4NC3 </td><td> 4O9R </td><td> 4RWD </td><td> 4YAY </td><td> 4ZWJ </td><td> 4ZIX </td><td> 4ZIZ </td></tr><tr><td> Gesamtprobe verwendet *, ul </td><td> 100 </td><td> 83 </td><td> 50 </td><td> 65 </td><td> 75 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Das Gesamtprotein verwendet, ug </td><td> 300 </td><td> 500 </td><td> 300 </td><td> 290 </td><td> 340 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Durchschnittliche Kristallgröße, um </td><td> 5 × 5 × 5 </td><td> &lt;5 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 2 × 2 </td><td> 5-10 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 10 × 5 </td></tr><tr><td> Trefferquote, % </td><td>3.6 </td><td> 7.8 </td><td> 5.9 </td><td> 17 </td><td> 0,45 </td><td> 40 </td><td> 6.5 </td></tr><tr><td> Gesamtdatenerfassungszeit, hr </td><td> 10 </td><td> 8 </td><td> 4.6 </td><td> 6.4 </td><td> 12 </td><td> 0,75 </td><td> 0,67 </td></tr><tr><td> Anzahl der indizierten Mustern </td><td> 32819 </td><td> 61964 </td><td> 36083 </td><td> 73130 </td><td> 18874 </td><td> 54544 </td><td> 6629 </td></tr><tr><td> Raumgruppe </td><td> C 2 2 2 1 </td><td> P 2 1 </td><td> C 2 </td><td> C 2 </td><td> P 2 1 2 1 2 1 </td><td> P 4 3 2 1 2 </td><td> H 3 2 </td></tr><tr><td> Auflösung, Å </td><td> 2.8 </td><td> 3.2 / 3.4 / 4.0 </td><td> 2.7 </td><td> 2.9 </td><td> 3,3 / 3,8 / 3,8 </td><td> 1.89 </td><td> 1,75 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Zusammenfassung der Probenvorbereitung und Datenerfassungsstatistiken für repräsentative Strukturen löste das LCP-SFX - Methode. Die Probenmenge, die für eine LCP-SFX Experiments hängt von der Kristallbeugungsqualität Kristalldichte, wobei der Durchmesser der Einspritzdüse, sowie der XFEL Strahlgrße, Intensität und Pulswiederholungsrate. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufdiagramm eines typischen Probenvorbereitungsverfahren für LCP-SFX. Die Probenvorbereitung beginnt mit LCP Kristallisation des Zielproteins in gasdichten Glasspritzen. Nach Kristalle erhalten werden, die Kristall beladene LCP wird in einer Spritze und titriert mit zusätzlichen Lipid, konsolidiert absorb die überschüssige Fällmittellösung. Kristalle werden dann verschiedene Mikroskopieverfahren vor dem XFEL Datenerfassung charakterisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ein repräsentatives Ergebnis ist die Struktur von 5-HT 2B im Komplex mit Ergotamin. (a) Mikrokristalle von 5-HT 2B / Ergotamin abgebildet , um eine Hellfeld - Mikroskop - Modus 8 verwenden. Diese Zahl wurde von Referenz 8 mit urheberrechtliche Erlaubnis von Wissenschaft. (B) Mikrokristalle von 5-HT 2B / Ergotamin wiederverwendet abgebildet , um eine kreuzpolarisierte Mikroskopmodus 8 verwenden. Diese Zahl wurde von Referenz 8 mit Copyright wiederverwendetErlaubnis von Wissenschaft. (c) Eine Karikatur Darstellung der 5-HT 2B / Ergotamin Struktur durch die LCP-SFX - Ansatz erhalten. Lipids, die im Modell gebaut wurden, sind in Stick-Darstellung gezeigt. Der Ligand Ergotamin wird in Sphären Darstellung gezeigt. Durchgezogene Linien zeigen die ungefähre Membran Grenzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein repräsentatives Ergebnis ist die Struktur von SMO im Komplex mit Cyclopamin. Linker Bereich, Mikrokristalle von SMO / cyclopamine abgebildet , um eine kreuzpolarisierte Mikroskop - Modus 6 verwendet wird . Diese Zahl wurde von Referenz 6 mit Urheber Genehmigung von Nature Communications. Rechten Seite, eine Karikatur Vertre wiederverwendetauf der SMO / cyclopamine Struktur durch die LCP-SFX-Ansatz erhalten. Ligand cyclopamine wird in Sphären Darstellung gezeigt. Durchgezogene Linien zeigen die ungefähre Membran Grenzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir beschreiben Verfahren zur Herstellung und Abgabe von Membranprotein-Mikrokristallen in lipidischer kubischer Phase für die serielle Kristallographie an Röntgen-Freie-Elektronen-Lasern und Synchrotronquellen. Diese Protokolle können auch für die Einarbeitung und Abgabe von löslichen Proteinmikrokristallen verwendet werden, was zu einem erheblich reduzierten Probenverbrauch im Vergleich zur Flüssiginjektion führt.

Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proben von Membranproteinkristallen in lipidischer kubischer Phase für die Datensammlung mittels Serieller Kristallographie an Synchrotron- und Röntgen-Freie-Elektronen-Laser-Quellen vorzubereiten. Diese Methode sollte helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Strukturbiologie von Membranproteinen zu beantworten, wie beispielsweise Transportvorgänge und Signalübertragung über die Membran. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Strukturaufklärung von Membranproteinen in ihrer nativen Lipidumgebung bei Raumtemperatur ermöglicht, wobei der Probenverbrauch minimal ist und Strahlenschäden vernachlässigbar gering ausfallen.Personen, die mit dieser Methode neu sind, werden Schwierigkeiten haben, da die lipidische kubische Phase ein viskoses, gelartiges Material ist, das ohne spezielle Werkzeuge und Vorerfahrung schwer zu handhaben ist. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Rekonstitution von Membranproteinen in der lipidischen kubischen Phase, oder LCP, unter Verwendung der Spritzen Nummer eins und Nummer zwei, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem eine transparente und homogene LCP gebildet wurde, überführen Sie die gesamte Probe in die Spritze Nummer zwei.Lösen Sie die Spritze Nummer Eins, während Sie den Kuppler mit der Spritze Nummer Zwei verbunden lassen. Befestigen Sie eine abnehmbare Nadel an einer weiteren sauberen 100-Mikroliter-Spritze, genannt Spritze Nummer Drei. Saugen Sie etwa 70 Mikroliter der Präzipitationslösung darin auf.Trennen Sie die Nadel von Spritze Nummer drei, während die Teflonsphäre in der Spritze verbleibt. Verbinden Sie die Spritzen Nummer zwei und drei über den Kupplungsadapter, wobei sichergestellt werden muss, dass die Teflonsphären in beiden Spritzen korrekt positioniert sind. Schrauben Sie den Kupplungsadapter vorsichtig fest. Stellen Sie die gekoppelten Spritzen vertikal aus, wobei die Spritze Nummer Zwei unten ist, und injizieren Sie die proteinhaltige LCP-Probe langsam und gleichmäßig aus der Spritze Nummer Zwei in die Spritze Nummer Drei, bis der LCP-Strang den Kolben der Spritze Nummer Drei berührt. Das injizierte LCP-Volumen beträgt etwa ein Zehntel des anfänglichen Fällungsmittelvolumens in der Spritze Nummer Drei. Überprüfen Sie das Volumen anhand der Skaleneinstellung an beiden Spritzen.Trennen Sie anschließend Spritze Nummer zwei. Der Kupplungsadapter ist nun nur noch mit Spritze Nummer drei verbunden, die die Probe in der Präzipitatorlösung enthält. Versiegeln Sie Spritze Nummer drei vollständig mit Parafilm, einschließlich der Verbindung zwischen Kolben und Spritze, dem offenen Ende des Kupplungsadapters und der Nadelmutter.Ein unvollständiges Versiegeln während dieses Schritts kann dazu führen, dass sich die Präzipitationsbedingungen ändern und die Probe austrocknet. Wiederholen Sie die Injektion der proteinhaltigen LCP-Probe, um die Kristallisation in sechs weiteren Spritzen vorzubereiten, wobei insgesamt etwa 50 Mikroliter der LCP-Probe verwendet werden. Lagern Sie die versiegelten Spritzen in einer wiederverschließbaren Kunststofftasche zusammen mit einem oder zwei faserfreien Reinigungstüchern, die zur Vorbeugung gegen Austrocknung der Probe mit Wasser vorgefeuchtet wurden.Versiegeln Sie den Beutel und lagern Sie die Spritzen während des Kristallwachstums in einem 20-Grad-Celsius-Inkubator. Zum Nachweis der Kristalle entnehmen Sie die Spritzen dem Inkubator und geben die LCP-Proben direkt in den Spritzen alle 12 bis 24 Stunden unter einem Stereomikroskop mit kreuzpolarisiertem Licht frei. Identifizieren Sie Kristalle als dicht gepackte, glänzende Partikel oder im Fall kleinerer Kristallgröße als gleichmäßiges Leuchten des LCP-Fadens.Die verschlossenen Spritzen zurück in die Tüte geben und bei 20 Grad Celsius zur späteren Verwendung lagern. Der Lipid-Titrationschritt ist notwendig, um die überschüssige Fällungslösung zu absorbieren und ein Einfrieren der Lipide beim Einspritzen in den Röntgen-Freie-Elektronen-Laserstrahl zu verhindern. Etwa eine Stunde vor Beginn der Datensammlung die Spritzen mit den Proben aus dem 20-Grad-Celsius-Inkubator entnehmen.Wählen Sie zwei bis vier Spritzen für die Probenkonsolidierung basierend auf ähnlicher Kristallmorphologie und Übereinstimmung der Kristallisationsbedingungen aus. Entfernen Sie vorsichtig die Parafilm-Dichtung von den ausgewählten Spritzen. Nehmen Sie den Spritzenverbinder ab und befestigen Sie eine saubere, abnehmbare Nadel an der ersten ausgewählten Spritze.Schieben Sie den Kolben vorsichtig und langsam nach vorne, um das Präzipitat durch die Nadel in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu pressen. Seien Sie bei diesem Schritt vorsichtig; denn ein zu hoher Druck auf den Kolben kann Teile des kristallhaltigen LCP zusammen mit der Präzipitatlösung herausspritzen und so zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Probe führen. Stoppen Sie den Kolben, sobald der größte Teil des Präzipitats entfernt ist und sich das LCP am Nadeleingang angesammelt hat.Führen Sie diesen Vorgang für die anderen ausgewählten Spritzen durch. Um die resultierenden LCP-Proben zu vereinigen, verbinden Sie zwei Spritzen über einen sauberen Kupplungsadapter. Drücken Sie den Kolben einer Spritze, um die gesamte Probe aus einer Spritze in die andere zu übertragen.Trennen Sie die leere Spritze ab. Wiederholen Sie diesen Schritt, um das gesamte kristallhaltige LCP-Material in einer Spritze zu vereinigen. Entfernen Sie so viel Präzipitanz wie möglich. Fügen Sie etwa fünf Mikroliter von 7,9 MAG oder dem ursprünglichen, kürzerkettigen MAG-Wirtslipid einer leeren Spritze hinzu. Verbinden Sie diese Spritze über einen Spritzenverbinder mit der Spritze, die die vereinigte Probe enthält, und mischen Sie, indem Sie die Spritzenstößel abwechselnd niedertreiben. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Restlösung absorbiert ist und ein homogenes und transparentes LCP entstanden ist.Überführen Sie die gesamte gemischte LCP-Probe in eine Spritze und trennen Sie die leere Spritze ab. Befestigen Sie eine LCP-Injektor-Ladennadel an der Spritze mit der vereinigten Probe. Drücken Sie vorsichtig etwa einen Mikroliter der LCP-Probe auf einen Objektträger und bedecken Sie sie mit einem Deckglas.Drücken Sie vorsichtig auf die Deckglasplatte, um die Probe einzuklemmen. Nehmen Sie Bilder der LCP-Probe unter einem Stereomikroskop mit der höchstmöglichen Vergr&ouml;&szlig;erung auf, verwenden Sie dabei Hellfeldbeleuchtung und Kreuzpolarisatoren. Falls m&ouml;glich, fertigen Sie zus&auml;tzliche Aufnahmen mit einem UV-Fluoreszenzmikroskop und Bildgebungssystem an, um das Vorhandensein von Proteinmikrokristallen in der Probe zu best&auml;tigen.Schätzen Sie die Kristallgröße und -dichte ein. Die ideale Kristalldichte für ein Datenerfassungsexperiment hängt von der Kristallgröße, dem Durchmesser des Röntgenstrahls und dem Durchmesser des LCP-Streams ab und sollte zu einer Kristalltrefferrate von etwa 10 bis 40 % führen. Laden Sie abschließend den LCP-Injektor und führen Sie die LCP-Serielle Femtosekunden-Kristallographie oder die LCP-SFX-Datenerfassung wie im Textprotokoll beschrieben durch. Gezeigt sind hier Mikrokristalle des Serotoninrezeptors im Komplex mit Ergotamin, abgebildet im Hellfeldmikroskop-Modus und abgebildet im Kreuzpolarisations-Lichtmikroskop-Modus.Die Struktur des Serotoninrezeptor-Ergotamin-Komplexes wurde mittels der LCP-SFX-Methode erhalten. Gezeigt sind hier Mikrokristalle des Smoothant-Rezeptors im Komplex mit Cyclopamin, die mit einem kreuzpolarisierten Mikroskopmodus abgebildet wurden. Die Struktur des Rezeptor-Cyclopamin-Komplexes wurde mittels der LCP-SFX-Methode erhalten.Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden. Obwohl diese Methode Einblicke in die Struktur von Membranproteintargets ermöglicht, kann sie mit geringfügigen Modifikationen auch auf Proteine angewandt werden. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Arzneimittelforschung hinein, da hochauflösende Strukturen hervorragende Vorlagen für die standardmäßigen Lignan-Protein-Wechselwirkungen liefern und bei der Entwicklung wirksamerer Arzneimittel helfen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

Die Protokolle beschreiben die wesentlichen Schritte für den Erhalt Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen ab Rekonstitution des Proteins in einer Lipid-kubische Phase (LCP), finden Anfangsbedingungen mit LCP-FRAP Vorkristallisation Assays, die Einrichtung von LCP Kristallisation Studien und Ernte-Kristallen .

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) erfüllen viele Funktionen innerhalb der äußeren Membranen von gramnegativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten. Hier hoffen wir, einen bekannten Engpass in Strukturstudien zu entschärfen, indem wir Protokolle für die Herstellung von β-Zylinder-OMPs in ausreichender Menge für die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie vorstellen.

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Ein Protokoll wird für die Röntgenkristallographie unter Verwendung von Proteinmikrokristallen vorgestellt. Zwei Beispiele, die in vivo- gewachsenen Mikrokristallen nach der Reinigung oder in Cellulo analysieren, werden verglichen.

Mikrokristallographie von Proteinkristallen und<em&gt; In Cellulo</em&gt; Beugung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die kontrollierte Produktion von Protein Mikrokristalle. Das Verfahren nutzt ein automatisierte Gerät ermöglicht kontrollierte Manipulation verschiedener Parameter der Kristallisation. Die Protein-Kristallisation ist durch kontrollierte und Automatische Zugabe von Kristallisation Lösungen während der Überwachung und Untersuchung der Radius-Verteilung von Partikeln in der Kristallisation Tropfen durchgeführt.

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

Dieses Protokoll beschreibt im Detail wie fabrizieren und mikrofluidischen Geräte zur Röntgenbeugung Datenerfassung bei Raumtemperatur betrieben. Darüber hinaus beschreibt die Kristallisation von Proteinen durch dynamische Lichtstreuung zu überwachen und Informationen zum Verarbeiten und analysieren erhalten Beugung Daten.

Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

Der Erfolg eines seriellen Femtosekunden zeitaufgelöste Kristallographie Experiments ist effiziente Musterlieferung abhängig. Hier beschreiben wir Protokolle, um die Extrusion von Bakteriorhodopsin Mikrokristalle aus eine hohe Viskosität Mikro-Extrusion Injektor zu optimieren. Die Methodik setzt auf Probe Homogenisierung mit einem neuartigen Dreiwege Kupplung und Visualisierung mit einer Highspeed-Kamera.

Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie serielle Kristallographieproben für die Datenerfassung auf einem hochviskosen Injektor, Lipidico, vorbereitet werden, das kürzlich im australischen Synchrotron in Auftrag gegeben wurde.

Lipidico Injektionsprotokoll für serielle Kristallographiemessungen am australischen Synchrotron

Das Ziel dieses Artikels ist es, dem Betrachter ein solides Verständnis dafür zu vermitteln, wie sein kleinvolumiges Dampfdiffusionsprotokoll für die Züchtung großer, einzelner Proteinkristalle in eine großvolumige Batch-Mikrokristallisationsmethode für die serielle Kristallographie umgewandelt werden kann.

Optimierung des Wachstums von Endothiapepsin-Kristallen für serielle Kristallographie-Experimente

Das vorgestellte Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung einer 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte. Der Einsatz von Dialysatorröhrchen für die großskalige Züchtung von Mikrokristallen wird auch für serielle Kristallographie und MicroED-Anwendungen demonstriert.

Hochdurchsatz-Proteinkristallisation mittels Mikrodialyse

Dieses Protokoll beschreibt einen Aufbau für die Kristallisation des Steroltransporters ABCG5/G8. ABCG5/G8 wird für die Hängetropfenkristallisation in Bizellen rekonstituiert. Das Protokoll erfordert keine speziellen Materialien oder Substrate, so dass es in jedem Labor zur Bestimmung der Proteinstruktur durch Röntgenkristallographie zugänglich und einfach angepasst werden kann.

ABCG5/G8-Kristallisation in einer lipidischen Bizellenumgebung für die Röntgenkristallographie

Erfahren Sie die Herstellung von Membranprotein-Mikrokristallen in lipider kubischer Phase für serielle Femtosekunden-Kristallographie. Diese Methode ermöglicht Strukturbestimmung bei Raumtemperatur mit minimalem Probenverbrauch.

Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

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