Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proben von Membranproteinkristallen in lipidischer kubischer Phase für die Datensammlung mittels Serieller Kristallographie an Synchrotron- und Röntgen-Freie-Elektronen-Laser-Quellen vorzubereiten. Diese Methode sollte helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Strukturbiologie von Membranproteinen zu beantworten, wie beispielsweise Transportvorgänge und Signalübertragung über die Membran. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Strukturaufklärung von Membranproteinen in ihrer nativen Lipidumgebung bei Raumtemperatur ermöglicht, wobei der Probenverbrauch minimal ist und Strahlenschäden vernachlässigbar gering ausfallen.

Personen, die mit dieser Methode neu sind, werden Schwierigkeiten haben, da die lipidische kubische Phase ein viskoses, gelartiges Material ist, das ohne spezielle Werkzeuge und Vorerfahrung schwer zu handhaben ist. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Rekonstitution von Membranproteinen in der lipidischen kubischen Phase, oder LCP, unter Verwendung der Spritzen Nummer eins und Nummer zwei, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem eine transparente und homogene LCP gebildet wurde, überführen Sie die gesamte Probe in die Spritze Nummer zwei.

Lösen Sie die Spritze Nummer Eins, während Sie den Kuppler mit der Spritze Nummer Zwei verbunden lassen. Befestigen Sie eine abnehmbare Nadel an einer weiteren sauberen 100-Mikroliter-Spritze, genannt Spritze Nummer Drei. Saugen Sie etwa 70 Mikroliter der Präzipitationslösung darin auf.

Trennen Sie die Nadel von Spritze Nummer drei, während die Teflonsphäre in der Spritze verbleibt. Verbinden Sie die Spritzen Nummer zwei und drei über den Kupplungsadapter, wobei sichergestellt werden muss, dass die Teflonsphären in beiden Spritzen korrekt positioniert sind. Schrauben Sie den Kupplungsadapter vorsichtig fest.

Stellen Sie die gekoppelten Spritzen vertikal aus, wobei die Spritze Nummer Zwei unten ist, und injizieren Sie die proteinhaltige LCP-Probe langsam und gleichmäßig aus der Spritze Nummer Zwei in die Spritze Nummer Drei, bis der LCP-Strang den Kolben der Spritze Nummer Drei berührt. Das injizierte LCP-Volumen beträgt etwa ein Zehntel des anfänglichen Fällungsmittelvolumens in der Spritze Nummer Drei. Überprüfen Sie das Volumen anhand der Skaleneinstellung an beiden Spritzen.

Trennen Sie anschließend Spritze Nummer zwei. Der Kupplungsadapter ist nun nur noch mit Spritze Nummer drei verbunden, die die Probe in der Präzipitatorlösung enthält. Versiegeln Sie Spritze Nummer drei vollständig mit Parafilm, einschließlich der Verbindung zwischen Kolben und Spritze, dem offenen Ende des Kupplungsadapters und der Nadelmutter.

Ein unvollständiges Versiegeln während dieses Schritts kann dazu führen, dass sich die Präzipitationsbedingungen ändern und die Probe austrocknet. Wiederholen Sie die Injektion der proteinhaltigen LCP-Probe, um die Kristallisation in sechs weiteren Spritzen vorzubereiten, wobei insgesamt etwa 50 Mikroliter der LCP-Probe verwendet werden. Lagern Sie die versiegelten Spritzen in einer wiederverschließbaren Kunststofftasche zusammen mit einem oder zwei faserfreien Reinigungstüchern, die zur Vorbeugung gegen Austrocknung der Probe mit Wasser vorgefeuchtet wurden.

Versiegeln Sie den Beutel und lagern Sie die Spritzen während des Kristallwachstums in einem 20-Grad-Celsius-Inkubator. Zum Nachweis der Kristalle entnehmen Sie die Spritzen dem Inkubator und geben die LCP-Proben direkt in den Spritzen alle 12 bis 24 Stunden unter einem Stereomikroskop mit kreuzpolarisiertem Licht frei. Identifizieren Sie Kristalle als dicht gepackte, glänzende Partikel oder im Fall kleinerer Kristallgröße als gleichmäßiges Leuchten des LCP-Fadens.

Die verschlossenen Spritzen zurück in die Tüte geben und bei 20 Grad Celsius zur späteren Verwendung lagern. Der Lipid-Titrationschritt ist notwendig, um die überschüssige Fällungslösung zu absorbieren und ein Einfrieren der Lipide beim Einspritzen in den Röntgen-Freie-Elektronen-Laserstrahl zu verhindern. Etwa eine Stunde vor Beginn der Datensammlung die Spritzen mit den Proben aus dem 20-Grad-Celsius-Inkubator entnehmen.

Wählen Sie zwei bis vier Spritzen für die Probenkonsolidierung basierend auf ähnlicher Kristallmorphologie und Übereinstimmung der Kristallisationsbedingungen aus. Entfernen Sie vorsichtig die Parafilm-Dichtung von den ausgewählten Spritzen. Nehmen Sie den Spritzenverbinder ab und befestigen Sie eine saubere, abnehmbare Nadel an der ersten ausgewählten Spritze.

Schieben Sie den Kolben vorsichtig und langsam nach vorne, um das Präzipitat durch die Nadel in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu pressen. Seien Sie bei diesem Schritt vorsichtig; denn ein zu hoher Druck auf den Kolben kann Teile des kristallhaltigen LCP zusammen mit der Präzipitatlösung herausspritzen und so zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Probe führen. Stoppen Sie den Kolben, sobald der größte Teil des Präzipitats entfernt ist und sich das LCP am Nadeleingang angesammelt hat.

Führen Sie diesen Vorgang für die anderen ausgewählten Spritzen durch. Um die resultierenden LCP-Proben zu vereinigen, verbinden Sie zwei Spritzen über einen sauberen Kupplungsadapter. Drücken Sie den Kolben einer Spritze, um die gesamte Probe aus einer Spritze in die andere zu übertragen.

Trennen Sie die leere Spritze ab. Wiederholen Sie diesen Schritt, um das gesamte kristallhaltige LCP-Material in einer Spritze zu vereinigen. Entfernen Sie so viel Präzipitanz wie möglich.

Fügen Sie etwa fünf Mikroliter von 7,9 MAG oder dem ursprünglichen, kürzerkettigen MAG-Wirtslipid einer leeren Spritze hinzu. Verbinden Sie diese Spritze über einen Spritzenverbinder mit der Spritze, die die vereinigte Probe enthält, und mischen Sie, indem Sie die Spritzenstößel abwechselnd niedertreiben. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Restlösung absorbiert ist und ein homogenes und transparentes LCP entstanden ist.

Überführen Sie die gesamte gemischte LCP-Probe in eine Spritze und trennen Sie die leere Spritze ab. Befestigen Sie eine LCP-Injektor-Ladennadel an der Spritze mit der vereinigten Probe. Drücken Sie vorsichtig etwa einen Mikroliter der LCP-Probe auf einen Objektträger und bedecken Sie sie mit einem Deckglas.

Drücken Sie vorsichtig auf die Deckglasplatte, um die Probe einzuklemmen. Nehmen Sie Bilder der LCP-Probe unter einem Stereomikroskop mit der höchstmöglichen Vergrößerung auf, verwenden Sie dabei Hellfeldbeleuchtung und Kreuzpolarisatoren. Falls möglich, fertigen Sie zusätzliche Aufnahmen mit einem UV-Fluoreszenzmikroskop und Bildgebungssystem an, um das Vorhandensein von Proteinmikrokristallen in der Probe zu bestätigen.

Schätzen Sie die Kristallgröße und -dichte ein. Die ideale Kristalldichte für ein Datenerfassungsexperiment hängt von der Kristallgröße, dem Durchmesser des Röntgenstrahls und dem Durchmesser des LCP-Streams ab und sollte zu einer Kristalltrefferrate von etwa 10 bis 40 % führen. Laden Sie abschließend den LCP-Injektor und führen Sie die LCP-Serielle Femtosekunden-Kristallographie oder die LCP-SFX-Datenerfassung wie im Textprotokoll beschrieben durch. Gezeigt sind hier Mikrokristalle des Serotoninrezeptors im Komplex mit Ergotamin, abgebildet im Hellfeldmikroskop-Modus und abgebildet im Kreuzpolarisations-Lichtmikroskop-Modus.

Die Struktur des Serotoninrezeptor-Ergotamin-Komplexes wurde mittels der LCP-SFX-Methode erhalten. Gezeigt sind hier Mikrokristalle des Smoothant-Rezeptors im Komplex mit Cyclopamin, die mit einem kreuzpolarisierten Mikroskopmodus abgebildet wurden. Die Struktur des Rezeptor-Cyclopamin-Komplexes wurde mittels der LCP-SFX-Methode erhalten.

Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden. Obwohl diese Methode Einblicke in die Struktur von Membranproteintargets ermöglicht, kann sie mit geringfügigen Modifikationen auch auf Proteine angewandt werden. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Arzneimittelforschung hinein, da hochauflösende Strukturen hervorragende Vorlagen für die standardmäßigen Lignan-Protein-Wechselwirkungen liefern und bei der Entwicklung wirksamerer Arzneimittel helfen.