Name: Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Erfahren Sie die hochdurchsatzfähige Kryohistologie für mineralisiertes Gewebe. Diese Methode ermöglicht mehrere Bildgebungsrunden pro Objektträger und liefert digitale, beobachterunabhängige Ergebnisse für die muskuloskelettale Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren möchten die folgenden Finanzierungsquellen erwähnen: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 und T90-DE021989.

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
<li>Adissu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+reveals+correlative+and+unique+phenotypes+in+a+high-throughput+mouse+phenotyping+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen.</a> Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Ayadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+large-scale+phenotyping+initiatives%3A+overview+of+the+European+Mouse+Disease+Clinic+%28EUMODIC%29+and+of+the+Wellcome+Trust+Sanger+Institute+Mouse+Genetics+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project.</a> Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf5+progenitors+give+rise+to+fibrocartilage+cells+that+mineralize+via+hedgehog+signaling+to+form+the+zonal+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis.</a> Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).</li>
<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Hier haben wir ein detailliertes cryohistology Protokoll vorgestellt zusammen lokalisieren und verschiedene biologische Maßnahmen quantifizieren durch Bilder von mehreren Runden der Färbung / Bildgebung auf einem einzigen Abschnitt auszurichten. Das Verfahren den cryotape umrissenen Verwendung ist besonders nützlich , da es die Morphologie schwierig Abschnitt Gewebe (zB mineralisiertem Knochen und Knorpel) beibehält. Zusätzlich wird das geschnittene Gewebe fest mit dem Glasträger, so dass für mehrere Runden der...

Biologische Forschung erfordert oft effizienter Phänotypisierung, die häufig mit irgendeiner Art von histologischen Analyse 1-3 zugeordnet ist. Dieser Bedarf wird noch deutlicher , mit den ehrgeizigen Projekten jedes Gen im Mausgenom 4 zu stören. Diese histologischen Analysen können von der Beurteilung der Zellmorphologie und / oder anatomischen Merkmale zu Abbildungs ​​Expression spezifischer Gene oder Proteine ​​auf einzelne Zellen liegen. In der Tat ist einer der grundlegenden Beiträge der Histologie auf das Gebiet der Genomik ist die Fähigkeit, ein spezifisches molekulares Signal auf einen bestimmten Bereich oder Zelltyp zu assoziieren. Traditionelle Methoden der Histologie, vor allem für Muskel-Skelett-Gewebe, sind oft zeitaufwendig und mühsam und erfordert manchmal Wochen zu beheben, entkalken, Abschnitt, Fleck, und Bild die Probe dann analysieren die Bilder über die menschliche Interpretation. Analysieren von mehreren molekularen Signale, ob über Immunhistochemie, in situ hybridizatIon oder spezielle Flecken, erfordert mehrere Abschnitte und sogar mehrere Proben in geeigneter Weise durchzuführen. Darüber hinaus können diese mehreren Reaktionen auf dieselbe Zelle nicht zusammen lokalisiert und manchmal nicht auf einen bestimmten Bereich innerhalb einer gegebenen Probe co-lokalisiert werden kann. Wie die Genomik und epigenomics Feld in das digitale Zeitalter bewegt, muss die histologische Feld auch nachziehen effizient mit hohem Durchsatz und automatisierte Analyse einer Vielzahl von molekularen Signalen innerhalb eines einzigen histologischen Schnitt zu liefern. Tatsächlich gibt es eine Nachfrage nach verbesserten histologische Techniken, die mehrfache molekulare Signale zu spezifischen Zellen innerhalb eines gegebenen Probe zuordnen können. Vor kurzem haben wir einen neuen Hochdurchsatz - cryohistological Methode zur Beurteilung mehrerer Reaktionsmaßnahmen in einem bestimmten Abschnitt von mineralisiertem Gewebe 14.05 veröffentlicht. Das Verfahren beinhaltet die Kryoschnitt mit gefrorenen cryotape Stabilisierung der verschweißte Abschnitt anhaftenden starr an einem Mikroskop-Objektträger, undDurchführung von mehreren Runden der Färbung und Bildgebung auf jedem Abschnitt. Diese Runden der Bilder werden dann manuell oder über Computerautomatisierung vor der Bildanalyse (Figur 1) ausgerichtet ist . Hier stellen wir ausführliche Protokolle dieses Verfahrens und Beispiele geben, wo diese Techniken unser Verständnis von verschiedenen biologischen Prozessen verbessert.

<table><tbody><tr><td>10% neutral gepuffertes Formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar. Giftig. Kann mit 4% Paraformaldehyd substituiert werden.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Kryoformen</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>Je nach Gewebe können unterschiedliche Größen verwendet werden</td></tr><tr><td>Kryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>Kann durch andere Kryomatrizen substituiert werden. PVA/PEG-basierte Harze haben jedoch in unseren Händen am besten funktioniert.</td></tr><tr><td>2-Methyl-Butan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>Kann durch andere Marken/Modelle ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Probenscheibe</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>Kann durch andere Marken/Modelle ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Kryostat-Klingen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>Kann durch andere Marken/Modelle ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Kryotape</td><td>Section Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rollenelektronenmikroskopie Sciences</td><td>62800-46</td><td>Kann durch andere Marken/Modelle ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Objektträger aus Kunststoff</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71890-01</td><td>Kann durch andere Marken/Modelle ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Objektträger aus Glas</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>können durch andere Marken/Modelle ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td>Norland Optical</td><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td></td></tr><tr><td>UV Black Light</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>InSpeck rote Mikrokügelchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>InSpeck grüne Mikrokügelchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&nbsp;</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Alizarin-Complexon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3882&nbsp;</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Demeclocyclin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&nbsp;</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>ELF 97 gelb fluoreszierendes Phosphatase-Substrat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar. Kann durch Hoechst 33342 oder andere Kernfarbstoffe ersetzt werden.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (Cy5 nukleare Gegenfärbung)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Natriumacetat wasserfrei</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Natriumtartrat zweibasisches Dihydrat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Natriumnitrit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>MgCl2 Hexahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Fast Red TR Salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8764</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar. Kann auch durch andere Substrat-Kits wie Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naphthol AS-MX&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4875</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>N,N Dimethylformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D158550</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Toluidinblau O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td> Es <td>können auch andere lineare oder gekachelte Scanner verwendet werden.</td></tr><tr><td>DAPI Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>CFP Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>GFP Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>YFP Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>Custom gelb (ELF 97) Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Gewohnheit; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 Filterset</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJane Tape Transfer System</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>62800-10</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr><tr><td>CryoJane Tape Windows</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>62800-72</td><td>Mehrere Anbieter verfügbar.</td></tr><tr><td>CryoJane Objektträger</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>62800-4X</td><td>Mehrere Lieferanten verfügbar.</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz, multi-bild cryohistology von mineralisiertem gewebe

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

Es besteht ein zunehmender Bedarf an effizienter Phänotypisierung und Histopathologie einer Vielzahl von Geweben. Dieser Bedarf an Phänotypisierung zeigt sich bei den ehrgeizigen Projekten, jedes Gen im Mausgenom zu zerstören. Die Forschungsgemeinschaft benötigt schnelle und kostengünstige Mittel, um Gewebe histologisch zu phänotypisieren. Histologische Analysen von Skelettgeweben sind oft zeitaufwändig und bestenfalls semi-quantitativ und erfordern regelmäßig eine subjektive Interpretation der Objektträger von geschulten Personen. In dieser Arbeit stellen wir ein kryohistologisches Paradigma für eine effiziente und kostengünstige Phänotypisierung mineralisierter Gewebe vor. Zunächst stellen wir eine neuartige Methode der bandstabilisierten Kryosektion vor, die die Morphologie mineralisierter Gewebe bewahrt. Diese Schnitte werden dann starr auf Objektträger geklebt und über mehrere Malrunden hinweg immer wieder abgebildet. Die resultierenden Bilder werden dann entweder manuell oder über eine Computersoftware ausgerichtet, um zusammengesetzte Stapel aus mehreren geschichteten Bildern zu erhalten. Das Protokoll ermöglicht die Co-Lokalisierung zahlreicher molekularer Signale zu spezifischen Zellen innerhalb eines bestimmten Abschnitts. Darüber hinaus können diese Fluoreszenzsignale über eine Computersoftware objektiv quantifiziert werden. Dieses Protokoll überwindet viele der Mängel, die mit der Histologie von mineralisiertem Gewebe verbunden sind, und kann als Plattform für die zukünftige Phänotypisierung von Muskel-Skelett-Geweben mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt dienen.

Ein Allgemeiner Workflow für die Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology Abbildung 1 stellt die allgemeine Arbeitsablauf für diese Technik verwendet. Es umfasst mehrere Schritte, von der Fixierung durch mehrere Runden von Bildgebung und schließlich Ausrichtung / Bildanalyse. Der Prozess kann so wenig nehmen, wie in der Woche von Probe Fixierung durch 4 Runden der Bildgebung zu gehen, die wenig...

In diesem Manuskript stellen wir eine halbautomatische Kryohistologie-Plattform mit hohem Durchsatz vor, um ausgerichtete Kompositbilder von Mehrfachreaktionsmessungen aus mehreren Runden der Fluoreszenzbildgebung an gefrorenen Schnitten mineralisierter Gewebe zu erstellen.

Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Das Ziel dieser Technologie besteht darin, histologische Werkzeuge bereitzustellen, die komplexe Modellsysteme auf kostengünstige und für die Forschung im Bereich des Bewegungsapparats aussagekräftige Weise hochdurchsatzfähig, unabhängig von Beobachter*innen und vollständig digital integrieren. Die Histologie ist für die meisten biologischen Forschenden zwar unverzichtbar, jedoch oft arbeitsintensiv und nicht quantitativ. Daher besteht ein Bedarf an histologischen Methoden, die eine effiziente, hochdurchsatzfähige und automatisierte Analyse ermöglichen.Mit unserer Kryohistologie-Plattform kann der Forscher mehrere molekulare Signale bestimmten Zellen innerhalb einer gegebenen Probe zuordnen, indem dieselbe Probe mehrfach in hoher Durchsatzkapazität abgebildet und gefärbt wird. Die Durchführung des Verfahrens wird von Doktor Xi Jiang und Li Chen, wissenschaftlichen Assistenten in meinem Labor, demonstriert, die die Entwicklung und Anwendung dieser Techniken maßgeblich vorangetrieben haben. Um mit dem Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie die Probe aus der Formalinlösung, entfernen Sie überschüssiges Gewebe und überführen Sie sie in 30 % Saccharose, hergestellt in 1x PBS.Inkubieren Sie die Proben in Saccharose für 12 bis 24 Stunden bei vier Grad Celsius. Füllen Sie anschließend eine Kryoschneideform mit Kryo-Einbettmedium und legen Sie die Proben in die Form. Richten Sie dann die Proben in der Form so aus, dass die Schnittebene für den Bereich von Interesse parallel zum Boden der Form ist.Danach das Kryomodell auf ein Stück Trockeneis stellen, bis eine dünne Schicht des Kryo-Einbettmediums gefriert und die Proben an Ort und Stelle fixiert. Anschließend den verbleibenden Raum im Kryomodell mit Kryo-Einbettmedium auffüllen, wobei das Kryomodell weiterhin auf dem Trockeneisplättchen verbleibt. Danach das Kryomodell in einen Behälter mit durch Trockeneis vorgekühltem 2-Methylbutan stellen.Wenn die Proben vollständig eingefroren sind, das Kryomodell entfernen und überschüssiges 2-Methylbutan abschütteln. Das Kryomodell in Cellophan einwickeln und bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius lagern. Übertragen Sie in diesem Verfahren den Probenblock aus dem Gefrierschrank in einen auf minus 20 bis minus 25 Grad Celsius eingestellten Kryostaten.Entfernen Sie anschließend den Block aus der Kryoschablone und schneiden Sie überschüssiges Kryoeinbettmedium mit einer Rasierklinge ab. Geben Sie dann etwas Kryoeinbettmedium auf die Probenscheibe und richten Sie den Block so aus, dass die Oberfläche der Probenscheibe parallel zur Unterseite des Blocks liegt. Warten Sie, bis das Kryoeinbettmedium gefriert.Platzieren Sie danach die Probenscheibe auf dem Probenträger und justieren Sie den Träger so, dass die Klinge parallel zur Oberfläche des Probenblocks schneidet. Schneiden Sie anschließend Stücke von Cryotape zurecht, um den interessierenden Bereich abzudecken, und kühlen Sie diese im Kryostat vor. Danach trimmen Sie den Block auf eine Ebene innerhalb des interessierenden Bereichs zurück und nehmen dabei nach Bedarf weitere Anpassungen vor.Wenn die Region von Interesse erreicht ist und ein Schnitt angefertigt werden kann, entfernen Sie alle Späne von der Oberfläche des Blockes. Entfernen Sie anschließend die nicht haftende Trägerschicht des Cryotapes, indem Sie das Tape an den nichtklebrigen silbernen oder goldenen Laschen anfassen. Legen Sie das Tape danach mit der klebrigen Seite nach unten auf den Block.Üben Sie mit dem Roller Druck auf das Cryotape aus und schneiden Sie einen Schnitt entweder mit dem automatischen Motor oder mit dem manuellen Schneidrad des Kryostaten. Anschließend legen Sie den Schnitt mit der Gewebeseite nach oben auf einen Kunststoffmikroskopobjektträger innerhalb des Kryostaten. Entfernen Sie den Kunststoffobjektträger aus dem Kryostaten und lassen Sie das Kryo-Einbettmedium schmelzen, sodass der Schnitt an der Oberfläche des Objektträgers haftet.Wiederholen Sie das Schneiden für serielle Schnitte oder andere Bereiche von Interesse. Sobald abgeschlossen, legen Sie die Schnitte in eine Objektträgerbox und lagern Sie sie bei vier, minus 20 oder minus 80 Grad Celsius, abhängig von der erforderlichen Lagerdauer und den nachgeschalteten Untersuchungsmethoden. Um die Methode mit UV-härtbarem Klebstoff durchzuführen, beschriften Sie zuerst den Objektträger.Tragen Sie einen Tropfen UV-aktivierbaren optischen Klebstoff auf zwei Objektträger auf und verwenden Sie die Kante eines Objektträgers, um eine dünne Schicht des Klebstoffs über die Oberfläche der Objektträger zu verteilen. Schneiden Sie anschließend die silberne Goldfolie ab und legen Sie den mit Klebeband versehenen Gewebeschnitt gewebeseitig nach oben auf die Klebstoffschicht des ersten Objektträgers. Bringen Sie den Schnitt in einer rollenden Bewegung von einer Kante zur anderen auf, um die Bildung eingeschlossener Blasen unter dem Klebeband zu minimieren.Entfernen Sie danach den abgeklebten Abschnitt vom ersten Objektträger und legen Sie ihn auf die Klebeschicht des zweiten Objektträgers, wobei Sie darauf achten sollten, Luftblasen zu vermeiden. Sobald die für das jeweilige Experiment erforderliche Anzahl an Abschnitten auf jedem Objektträger platziert ist, wischen Sie den überschüssigen Klebstoff von den umgebenden Bereichen ab. Prüfen Sie anschließend die Abschnitte genau auf unter der Folie eingeschlossene Luftblasen oder Fasern.Legen Sie die Objektträger anschließend fünf bis zehn Minuten unter das UV-Schwarzlicht, um die Klebeschicht zu vernetzen. Bereiten Sie in diesem Schritt die Referenzmarkierungslösung vor, indem Sie 50 Mikroliter grüne und 50 Mikroliter rote Mikrokügelchen in 100 Mikroliter Wasser auflösen. Lagern Sie die Lösung im Dunkeln bei vier Grad Celsius.Tauchen Sie dann eine Pipettenspitze in die Mikrosphärenlösung und geben Sie die Mikrosphärenlösung auf jeden Schnittabschnitt neben dem Bereich von Interesse. Anschließend trocknen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur und schützen sie vor Licht, indem Sie sie 30 Minuten lang mit Folie abdecken, falls die Objektträger am selben Tag weiterverarbeitet werden. Andernfalls bewahren Sie die Objektträger in einer Objektträgerbox bei vier Grad Celsius auf.Nach der Färbung der Schnitte die Deckgläser mit einem geeigneten Eindeckmedium auf den Objektträgern aufbringen. Zum Durchführen der Bildgebung die Objektträger in die Mikroskoptabletts laden und diese in den Tablettstapel des durchlichtmikroskopischen Scanners einschieben. Anschließend im Mikroskop-Software die Profilliste aufrufen, um für jeden Objektträger ein Profil mit der jeweils geeigneten Belichtungszeit für jeden Fluorophor zu laden.Klicken Sie auf die Schaltfläche „Start Preview Scan“, um ein Vorschaubild jedes Objektträgers aufzunehmen. Die Software weist automatisch einen Dateinamen zu, indem sie die auf den Objektträgeretiketten angebrachten Barcodes liest. Alternativ kann jedem Objektträger manuell ein Dateiname zugewiesen werden.Legen Sie die interessierenden Bereiche fest, indem Sie den Gewebeerkennungs-Assistenten aufrufen, jeden Bereich mit dem Zeichentool markieren, erforderliche Anpassungen vornehmen und diese für nachfolgende Bildaufnahmerunden speichern. Sobald jede Probe vorbereitet ist, starten Sie den Scanvorgang durch Klicken auf die Schaltfläche „Scan starten“. Nach jeder Bildaufnahmerunde tauchen Sie die Proben in ein Coplin-Gefäß, das mit 1x PBS gefüllt ist, bis die Deckgläser von den Objektträgern abfallen, bevor der nächste Färbeschritt erfolgt.Nach Abschluss aller Bildaufnahmerunden exportieren Sie die Bilder von jedem einzelnen Kanal als TIF- oder JPG-Dateien zur Bildzusammenstellung und -analyse. In dieser Abbildung wurde ein Schnitt aus dem Femur eines drei Monate alten Mäuses mit Calceinblau gefärbt und für das akkumulierte Mineral, sichtbar in Weiß, sowie für Mineralisierungsmarkierungen, sichtbar in Grün und Rot in der ersten Bildaufnahmerunde, abgebildet. Anschließend wurden die Objektträger auf TRAP-Aktivität, sichtbar in Gelb in der zweiten Runde, und auf AP-Aktivität, sichtbar in Rot in der dritten Bildaufnahmerunde, untersucht.Schließlich wurden die Objektträger in der vierten Runde mit Toluidinblau angefärbt. Die Referenzmarker wurden in jeder Bildaufnahmerunde, einschließlich der chromogenen Runde, abgebildet und mithilfe einer benutzerdefinierten Software ausgerichtet. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in kürzerer Zeit durchgeführt werden als eine typische Entkalkung einer Probe dauert.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie hochwertige Bilder mit hohem Informationsgehalt von mineralisierten Geweben erstellt werden können, die, wie wir hoffen, von der muskuloskelettalen Forschungsgemeinschaft breiter genutzt werden können.

high-throughput-multi-image-cryohistology-of-mineralized-tissues

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Strategie zur quantitativen Analyse histologischer Daten im Knochenmark wird vorgestellt. Die konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen in Gewebeschnitten führt zu 2-dimensionalen Bildern, die automatisch analysiert werden. Co-Lokalisationsanalysen verschiedener Zelltypen werden mit Daten aus simulierten Bildern verglichen, um quantitative Informationen über zelluläre Interaktionen zu erhalten.

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Diese Arbeit stellt ein neuartiges Verarbeitungs- und Abbildungsprotokoll für eine dicke, dreidimensionale Gewebequerschnittsanalyse dar, die die vollständige Ausnutzung konfokaler Bildgebungsmodalitäten ermöglicht. Dieses Protokoll bewahrt die Antigenität und stellt ein robustes System zur Analyse der Hauthistologie und potenziell anderer Gewebetypen dar.

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Dieses Protokoll zielt auf bestimmte Zellen im Gewebe für die Bildgebung mit nanoskaligen Auflösung mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM). Große Anzahl von Schnittserien aus biologischem Material Harz eingebettet werden zuerst in einem Lichtmikroskop, das Ziel zu identifizieren und dann hierarchisch im SEM abgebildet.

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Kombination von zwei Probe-Verarbeitungstechniken, Hochdruck, Einfrieren und Mikrowellen-gestützte Probenverarbeitung, gefolgt von minimal Harz für die Datenerfassung mit fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) einbetten. Dies wird gezeigt, mit einer Maus tibiale Nerven Probe und Caenorhabditis Elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

Diese Methode beschreibt die Verwendung des R26R-Konfetti (Konfetti) Mausmodells zur Untersuchung mineralisierter Gewebe, die alle Schritte von der Zuchtstrategie bis zu den Bilderfassungen abdeckt. Enthalten ist ein allgemeines Protokoll, das auf alle Weichgewebe angewendet werden kann, und ein modifiziertes Protokoll, das auf mineralisierte Gewebe angewendet werden kann.

Clonale genetische Tracing mit der Konfetti-Maus zur Untersuchung mineralisierter Gewebe

Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Dieses Protokoll stellt eine umfassende Pipeline zur Analyse von Proben aus menschlichen Herzen dar, die sich über die mikroskopische und makroskopische Skala erstrecken.

Pipeline für dreidimensionale multidimensionale anatomische Untersuchung des menschlichen Herzens

Die Kombination aus iterativem Bleaching-Extends-Multiplexity (IBEX) und einem kommerziellen Nukleotidmarkierungsassay (Click-iT EdU) ermöglicht den Nachweis und die Kategorisierung von sich teilenden Zelltypen in hochdynamischen Prozessen in fixierten gefrorenen murinen Gewebeschnitten. Darüber hinaus ermöglicht eine neuartige Open-Source-Bildverarbeitungspipeline eine Bilderfassung und -analyse mit hohem Durchsatz.

Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analyse-Workflow zur Bewertung von Hautzell-Phänotypen und Proliferationszuständen in Gewebeproben

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

Dieses Protokoll beinhaltet einen Schritt-für-Schritt-Workflow für verkalkte Gefäßproben: Gewebehandhabung, Entkalkung, RNA-Validierung, Detektion von Verkalkungsniveaus und Strategien zur Auswahl von Interessenregionen auf dem Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Das Ziel ist es, eine umfassende Methode zur Erhaltung der Gefäßgewebemorphologie und RNA für eine zuverlässige räumliche transkriptomische Analyse zu präsentieren.

Verkalkte Arterienvorbereitung und -verarbeitung mit erhaltener Morphologie und RNA für digitale räumliche Profilierung

Dieses Protokoll standardisiert die Kryo-Elektronen-Tomographie (Kryo-ET) für dickes Gewebe, indem es Hochdruck-Gefrieren (HPF) mit der Waffelmethode, kryogenen Fokusionenstrahl (Cryo-FIB) Lift-out und dosissymmetrische, parallele Aufnahme integriert, wodurch gleichmäßig dünne Lamellen und vitrifizierte Proben für eine reproduzierbare In-situ-Analyse im Maus-Hippocampus entstehen.

Kryo-Elektronen-Tomographie-Workflow für dickes Gewebe demonstriert im Maus-Hippocampus

Erfahren Sie die hochdurchsatzfähige Kryohistologie für mineralisiertes Gewebe. Diese Methode ermöglicht mehrere Bildgebungsrunden pro Objektträger und liefert digitale, beobachterunabhängige Ergebnisse für die muskuloskelettale Forschung.

Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe

Weitere Videos entdecken