Nachweis des pH-abhängige Aktivität von Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro und In Vivo

Das übergeordnete Ziel dieser in vivo und in vitro Chaperon-Assays ist es, die pH-abhängige Aktivität des Escherichia coli Chaperons HdeB unter sauren pH-Bedingungen zu charakterisieren. Säureaktivierte Chaperone haben nur eine Aufgabe zu erfüllen, sie müssen Proteine vor säureinduzierter Proteinentfaltung und -abbau schützen. Diese Funktion ist besonders wichtig für Darmbakterien, die das saure Milieu des Magens überleben müssen, wenn sie den Darm erfolgreich besiedeln wollen.

Die Methoden, die wir hier vorstellen, ermöglichen es Ihnen, säureaktivierte Chaperone zu identifizieren und zu charakterisieren und die pH-Bedingungen zu definieren, die zu ihrer Aktivierung führen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Chaperone, wie z. B. HdeB in vitro und in vivo, charakterisiert, was Ihnen hilft, den Mechanismus seiner Aktivierung zu entschlüsseln. Diese Methoden wurden erfolgreich für andere säureschützende Chaperone, wie z. B. HDA, angewendet und können weiter modifiziert werden, um mit anderen Chaperonen und/oder Stressbedingungen zu arbeiten.

Der Einfluss von gereinigtem HdeB auf die Aggregation der thermisch entfaltenden mitochondrialen Malat-Dehydrogenase des Schweins bei verschiedenen pH-Werten wird überwacht. Dialysierte MDH bei vier Grad Celsius über Nacht gegen vier Liter Puffer C. Dann konzentrierte das Protein unter Verwendung von Zentrifugalfiltereinheiten mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 30 Kilodalton auf etwa 100 Mikromolar. Um Aggregate zu entfernen, zentrifugieren Sie das Protein 20 Minuten lang bei 20.000 Mal G bei vier Grad Celsius.

Bestimmung der MDH-Konzentration durch Extinktion bei 280 Nanomolaren. Bereiten Sie dann 50 Mikroliter MDH-Aliquots vor und frieren Sie die Aliquote für die Lagerung schockein. Legen Sie eine Quarzküvette von einem Milliliter in ein fluoreszierendes Spektralphotometer, das mit temperaturgesteuerten Probenhaltern und Rührern ausgestattet ist.

Stellen Sie die Anregungs- und Eintrittswellenlänge auf 350 Nanometer ein. Geben Sie die entsprechenden Volumina des vorgewärmten Puffers D mit den gewünschten pH-Werten in die Küvette. Das Gesamtvolumen beträgt 1.000 Mikroliter.

Stellen Sie die Temperatur im Küvettenhalter auf 43 Grad Celsius ein. Geben Sie 12,5 mikromolare HdeB zum Puffer, gefolgt von der Zugabe von 0,5 mikromolaren MDH. Beginnen Sie mit der Überwachung der Lichtstreuung.

Inkubieren Sie die Reaktion 360 Sekunden lang, um eine ausreichende Entfaltung von MDH zu ermöglichen. Erhöhen Sie den pH-Wert auf sieben, indem Sie ein Volumen von 0,16 bis 0,34 % von zwei molaren ungepuffertem Dikaliumphosphat hinzufügen, und setzen Sie die Aufzeichnung der Lichtstreuung für weitere 440 Sekunden fort. Analysieren Sie die Daten, wie im Textprotokoll beschrieben.

Transformieren Sie das Plasmid, das HdeB exprimiert, oder die MD-Vektorkontrolle, PBAD 18, in den Stamm BB7224 Delta RPOH unter Verwendung chemisch kompetenter Zellen. Dieser Stamm ist temperaturempfindlich und muss bei 30 Grad Celsius angebaut werden. Nach 45 Sekunden Hitzeschock bei 42 Grad Celsius und vor dem Plattieren inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius und 200 U/min.

Führen Sie einzelne Kolonie-Streak-Outs positiver Klone durch und inkubieren Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Übernachtkultur in 50 Millilitern LB mit Ampicillin vor und kultivieren Sie die Zellen bei 200 U/min und 30 Grad Celsius. Über Nacht Kulturen 40-fach in 25 Milliliter LB mit Ampicillin verdünnen.

Züchten Sie die Bakterien in Gegenwart von 0,5 % Arabinose bei 30 Grad Celsius und 200 U/min auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 gleich 1,0, um die HDEB-Proteinexpression zu induzieren. Für die pH-Shift-Experimente verwenden Sie LB mit Ampicillin und Arabinose, um die Zellen auf einen OD 600 von 0,5 zu verdünnen. Passen Sie die jeweiligen pH-Werte an, indem Sie geeignete Volumina von fünf molaren Salzsäure hinzufügen.

Nach den angegebenen Zeitpunkten werden die Kulturen durch Zugabe der entsprechenden Volumina von fünf molaren Natriumhydroxid neutralisiert. Überwachen Sie das Wachstum der neutralisierten Kulturen und der Flüssigkultur 12 Stunden lang bei 30 Grad Celsius mit OD-Messungen. Um das pH-Optimum der Chaperonaktivität von HdeB in vitro zu untersuchen, wurde natives MDH in einen vorgewärmten Puffer des angegebenen pH-Werts in Gegenwart oder Abwesenheit oder HdeB verdünnt.

Nach 360 Sekunden Inkubation wurde die Aggregation von MDH bei 43 Grad Celsius durch Neutralisation ausgelöst. In Gegenwart von HdeB ist das Lichtstreusignal bei Neutralisation von pH vier signifikant verringert, was darauf hindeutet, dass HdeB die Aggregation von MDH verhindert. Aggregationsmessungen reagieren sehr empfindlich auf Änderungen der Temperatur oder des Puffergehalts.

Um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, wurde der Einfluss des Chaperon-Speicherpuffers auf die Client-Aggregation untersucht. Der HdeB-Speicherpuffer hatte keinen Einfluss auf die MDH-Aggregation. Um die Auswirkungen von HdeB in vivo zu untersuchen, wurden pH-abhängige Überlebensassays mit dem temperatursensitiven RPOH-Deletionsstamm durchgeführt.

Diesem Stamm fehlen die meisten Chaperone und er ist daher anfälliger für erhöhte Temperaturen, einen niedrigen pH-Wert oder oxidierten Stress. Eine Überexpression des HdeB unter neutralen pH-Bedingungen zeigte keinen Einfluss auf die Wachstumsrate des Stammes, der vergleichbar gut wuchs wie der Kontrollstamm, der den leeren Vektor beherbergt, PBAD 18. Im Gegensatz dazu wurden deutliche Unterschiede in ihrer Fähigkeit gefunden, das Wachstum nach einer Behandlung mit pH drei oder vier wieder aufzunehmen, wobei der HdeB-überexprimierende Stamm im Vergleich zum Kontrollstamm eine reproduzierbar verbesserte Erholung nach einer Behandlung mit niedrigem pH-Wert zeigte.

Einmal gemeistert, kann die Aufreinigung in drei Tagen, der In-vitro-Streuassay in einem Tag und die In-vivo-Überlebensassays in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Wenn Sie diese Experimente durchführen, stellen Sie sicher, dass Sie Ihr Versuchsdesign sorgfältig überdenken, sowohl in Bezug auf die Art der Client-Proteine, ihre Konzentrationen als auch auf die Pufferbedingungen, die Sie verwenden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hilft, ein detaillierteres Verständnis über den Mechanismus der Chaperonaktivierung und ihre Auswirkungen im In-vivo-Kontext zu erlangen.

Und vergessen Sie nicht, dass die Untersuchung des pH-Optimums eines säureschützenden Chaperons eine ziemliche Herausforderung sein kann. Dies liegt daran, dass sich das Aggregationsverhalten des Client-Proteins, das Sie verwenden, wahrscheinlich auch mit dem pH-Wert ändert. Achten Sie daher darauf, Puffersysteme zu wählen, die sowohl für das Chaperon als auch für das Client-Protein geeignet sind.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. Spin-Down-Assays nach SCS-Seite, bei autoquantifizierter Chaperon-vermittelter Unterdrückung der Client-Aggregation durchgeführt werden.