Name: Nachweis des pH-abhängige Aktivität von Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro und In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Charakterisierung der pH-abhängigen Chaperon-Aktivität von Escherichia coli HdeB unter sauren Bedingungen. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung säureaktivierter Chaperone und deren Aktivierungsmechanismen.

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Wir danken Dr. Claudia Cremers für ihre hilfreiche Ratschläge auf Chaperon-Assays. Ken Wan ist für seine technische Unterstützung bei HdeB Reinigung anerkannt. Diese Arbeit wurde von der Howard Hughes Medical Institute (zu JCAB) und den National Institutes of Health Zuschuss RO1 GM102829 zu JCAB und UJJ-UD unterstützt wird von einem Postdoc-Stipendium gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) zur Verfügung gestellt.

1. Expression und Reinigung von periplasmatischen HdeB HINWEIS: HdeB wurde in E. ausgedrückt coli - Zellen , die das Plasmid pTrc- hdeB 10 und gereinigt aus dem Periplasma auf Polymyxin Lyse beherbergen. <ol><li> Bereiten Sie eine Nacht - Kultur von E. coli - Zellen , die das Plasmid pTrc- hdeB 10 in 30 ml LB , enthaltend 200 ug / ml Ampicillin (LB Amp) beherbergt. Beimpfen von vier 1 l - Kulturen von LB Amp wachsen und sie bei 37 ° C und 200 rpm bis OD 600nm von 0,7 erreicht ist. Dann fügen 300 uM IPTG die Expression von HdeB zu induzieren und die Wachstumstemperatur auf 30 ° C ab. </li><li> Nach 5 h Proteinexpression bei 30 ° C, Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 8.000 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Wasche das Zellpellet mit 100 ml die Zellen erneut bei 8.000 xg für 5 min bei 4 ° C A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) und zentrifugieren puffern. </li><li> Anschließend resuspendierendas Zellpellet in 80 ml Puffer A, enthaltend 1 mg / ml Polymyxin-Sulfat. Für eine effiziente Zerstörung der äußeren Membran, rühren Sie vorsichtig die Suspension für 1 Stunde bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge die cytoplasmatische Fraktion und Zelltrümmer zu entfernen, die Suspension für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C. Dies resultiert in ~ 60 ml Überstand mit dem löslichen HdeB enthält. </li><li> Dialysieren des Überstandes des periplasmatischen Extrakt über Nacht gegen 150x Volumen Puffer B enthält (20 mM Tris / HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0), um eine Dialysemembran mit 6 kDa MW mit cut-off. Konzentriere die Proteine ​​auf 15 ml unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 3 kDa. Filtern die Proteinlösung eine 0,2 um Porenfilter. </li><li> Anwenden, die das Protein auf eine Anionenaustauscher-Chromatographiesäule (Säulenvolumen 5 ml), die mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 ml / min mit 5 Säulenvolumina Puffer B äquilibriert wurde. Sobald das Protein auf die Säule geladen wird, Waschen der Säule mit Puffer B für 10 min beieine Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 ml / min. Elute HdeB mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in Puffer B über einen Zeitraum von 50 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml / min 6. </li><li> Identifizieren Fraktionen, die HdeB 15% SDS-PAGE. Mischen Sie 20 ul Probe mit 5 ul 5x reduziert SDS-Ladepuffer. Last 10 ul auf das Gel, und führen in Tris-Glycin-Puffer (14,4 g / l Glycin, 2,9 g / L Tris, 1 g / L Natriumdodecylsulfat, pH 8,3). Führen Sie das Gel bei 150 V, bis der Bromphenol Band nahe dem Boden des Gels (~ 45 min) gewandert ist. </li><li> Pool aller HdeB enthaltenden Fraktionen, bei 4 ° C dialysiert über Nacht gegen 4 L HdeB Aufbewahrungspuffer (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0) und konzentriert, um das Protein zu etwa 300 &amp; mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht cut-off von 3 kDa. Bestimmen Sie die Konzentration von HdeB bei 280 nm unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ε 280nm = 15.595 M -1 cm -1. Bereiten Sie 100 ul Aliquots und gratfreiezie die Aliquots in flüssigem Stickstoff. HINWEIS: HdeB kann für mindestens 6 Monate bei -70 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Chaperone Aktivitätstest Thermisch Mit Ausklappen Malatdehydrogenase (MDH) HINWEIS: Der Einfluß von gereinigtem HdeB auf die Aggregation von thermisch porcine mitochondriale Malat-Dehydrogenase (MDH) bei verschiedenen pH-Werten wurde Entfalten überwacht, wie weiter unten beschrieben. Alle aufgelisteten Proteinkonzentrationen beziehen sich auf die Monomer-Konzentration. <ol><li> Zur Herstellung von MDH, dialysieren MDH bei 4 ° C über Nacht gegen 4 l Puffer C (50 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5) und konzentriert, um das Protein zu etwa 100 &amp; mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 30 kDa. HINWEIS: Eine sorgfältige Dialyse von MDH ist erforderlich, da MDH als Ammoniumsulfatlösung geliefert wird. </li><li> Zum Entfernen von Aggregaten, zentrifugieren Sie das Protein für 20 min bei 20.000 × g bei 4 ° C. Bestimmen MDH-Konzentration durch Absorption bei 280 nm (ε &lt;sub&gt; 280 nm = 7.950 M -1 cm -1). Bereiten Sie 50 ul Aliquots von MDH und Flash-gefrieren die Aliquots für die Lagerung. </li><li> Platz 1 ml Quarzküvette in ein Fluoreszenz-Spektralphotometer mit temperaturgesteuerten Probenhalter und Rührer ausgestattet war. Set λ ex / em bis 350 nm. </li><li> Fügen geeignete Volumina von vorgewärmten (43 ° C) Puffer D (150 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl) zu den gewünschten pH-Werte (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 und pH 5,0) in die Küvette und set die Temperatur in den Küvettenhalter bis 43 ° C. Das Gesamtvolumen beträgt 1,000 &amp; mgr; l. </li><li> Hinzufügen 12,5 uM HdeB (oder alternativ das gleiche Volumen an HdeB Speicherpuffer für den Puffersteuerung) zu dem Puffer, gefolgt von der Zugabe von 0,5 uM MDH. Beginnen Lichtstreuung zu überwachen. Inkubieren Sie die Reaktion für 360 sec ausreicht, damit der MDH Entfaltung. </li><li> Erhöhen Sie den pH - Wert auf 7 durch Zugabe von 0,16-0,34 Volumen von 2 M ungepufferte K 2 HPO 4 und weiterhin reCording Lichtstreuung für eine weitere 440 sec. </li><li> Gesetzt, das Ausmaß der MDH-Aggregation, die in Abwesenheit des Chaperons an einem definierten Zeitpunkt nach der Neutralisation aufgenommen wird (hier nach 500 sec, wenn die maximale Lichtstreuung von MDH beobachtet wurde) auf 100%. Normalisieren HdeB Aktivität zu dem Lichtstreuungssignal von MDH in Abwesenheit von HdeB bei jeder angegebenen pH-Wert. </li></ol> 3. Nachweis von HdeB-LDH-Komplexbildung durch Analytische Ultrazentrifugation (AUC) HINWEIS: Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente von HdeB allein oder im Komplex mit thermisch Lactatdehydrogenase Entfaltung (LDH) wurden einer analytischen Ultrazentrifuge durchgeführt werden. <ol><li> Zur Herstellung von LDH, dialysieren LDH bei 4 ° C über Nacht gegen 4 l Puffer C (50 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,5) und konzentriert, um das Protein zu etwa 200 &amp; mgr; M unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 30 kDa. HINWEIS: Eine sorgfältige Dialyse von LDH als LD erforderlichH wird als Ammoniumsulfat-Lösung zugeführt. </li><li> Zum Entfernen von Aggregaten, zentrifugieren LDH für 20 min bei 20.000 × g bei 4 ° C. Bestimmen LDH - Konzentration durch Absorption bei 280 nm (ε 280 nm = 43.680 M -1 cm -1). Bereiten Sie 50 ul Aliquots von LDH und Flash-gefrieren die Aliquots für die Lagerung. </li><li> Inkubieren 3 uM LDH in Gegenwart und Abwesenheit von 30 uM HdeB in Puffer D (pH 4 bzw. 7) für 15 min bei 41 ° C. HINWEIS: Die Inkubation von LDH bei höheren Temperaturen führt zu seiner vollständigen Aggregation und keine Chaperon Wirkung HdeB beobachtet werden. </li><li> Lassen Sie die Proben abkühlen auf Raumtemperatur. Dann laden Proben in Zellen mit einem Standard-Sektor 2-Kanal-Mittelstücke mit 1,2 cm Weglänge. Laden der Zellen in der Ultrazentrifuge und Äquilibrieren auf 22 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Sedimentation. </li><li> Spin-Proben bei 22 ° C und 167.000 xg in dem jeweiligen Rotor für 12 h und überwachen die Sedimentation des Proteins kontinuierlich bei 280 nm. Wie zuvor gezeigt, wird das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert, wenn das übertragene Lichtintensität jedes Kanals gemessen wird, anstatt Extinktion. Dies verbessert auch die Qualität der nachfolgenden Datenanpassung. </li><li> Führen Sie die Datenanalyse mit SEDFIT (Version 15.01b Dezember 2015), mit der kontinuierlichen c (n) Verteilungsmodell 17. Ein Tutorial beschreibt , wie SEDFIT verwenden können in Bezug 18 zu finden. <ol><li> Stellen Sie das Konfidenzniveau für die ME (Maximum Entropy) Regularisierung bis 0,7. </li></ol></li><li> Berechnen Puffer Dichte sowie die Viskosität unter Verwendung SEDNTERP 19. Zur Abschätzung der Menge von aggregiertem Protein Client, Vergleichen der Integrale von sedimentierten LDH in pH 4 bis pH 7 als Referenz. HINWEIS: Die Integration der Sedimentationsverteilungsmuster Plots können direkt in SEDFIT erfolgen. Alternative Software Sedimentationsgeschwindigkeits Daten analysieren kann in einer aktuellen Bewertung 20 gefunden werden. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Überwachung MDH Inaktivierung und Reaktivierung in Gegenwart von HdeB HINWEIS: Der Einfluß von gereinigtem HdeB auf die Neufaltung von ungefalteten pH-MDH wurde durch Überwachung MDH-Aktivität bei Neutralisation bestimmt. <ol><li> Inkubieren 1 uM MDH in Puffer D bei den gewünschten pH-Werte (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 und pH 5,0) für 1 h bei 37 ° C in Abwesenheit oder Anwesenheit von 25 uM HdeB. Dann verschieben sich die Temperatur auf 20 ° C für 10 min. NOTE: No MDH Neufaltung wurde in Gegenwart von HdeB beobachtet, selbst wenn MDH bei Temperaturen höher als 37 ° C inkubiert. </li><li> Zur Rückfaltung von denaturiertem Säure MDH, neutralisieren die Proben auf pH 7 durch Zugabe von 0,13-0,42 Volumen von 0,5 M Natriumphosphat, pH 8,0 initiieren. </li><li> Nach Inkubation für 2 h bei 20 ° C, MDH - Aktivität zu bestimmen durch Überwachung der Abnahme von NADH bei 340 nm 9. HINWEIS: MDH katalysiert die NADH-abhängige Reduktion von Oxalacetat zu L-Malat. <ol&gt; <li> Mischungs 50 ul der Inkubation der Reaktion mit 950 &amp; mgr; l Assaypuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 1 mM Oxalacetat und 150 &amp; mgr; M NADH). HINWEIS: Die Endkonzentration des MDH in dem Assaypuffer sollte 44 nm betragen. </li><li> Überwachen Sie die Änderung der Absorption mit einem Spektralphotometer, ausgestattet mit einem Steuerblock Peltier Temperatur auf 20 ° C. </li><li> Bericht des MDH-Aktivität im Vergleich zu 44 nM nativem MDH, die bei pH 7,0 gehalten wurde. </li></ol></li></ol> 5. Wirkung von HdeB Überexpression auf E. coli Überleben unter Säurestress HINWEIS: E. coli MG1655 genomische DNA wurde mit einem veröffentlichten Protokoll 21 isoliert. <ol><li> Amplify hdeB von E. coli MG1655 durch PCR - Primer hdeB mit - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT und hdeB - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C. </li><li> Eingerichtet , um die PCR - Reaktion in 50 ul wie folgt: 10 &amp; mgr; l 5x - Polymerase - Puffer, 200 uM dNTPs, 0,5 uM Primer JUD2, 0,5 uM Primer JUD5, 150 ng genomische DNA MG1655, 0,5 ul DNA - Polymerase, fügen ddH 2 O auf 50 &amp; mgr; l. </li><li> Führen Amplifikation hdeB wie folgt: Schritt 1: 5 min bei 95 ° C, 1 Zyklus; Schritt 2: 30 sec bei 95 ° C, 30 sec bei 55 ° C, 30 sec bei 72 ° C, 40 Zyklen; Schritt 3: 10 min bei 72 ° C. </li><li> Klon resultierende PCR - Fragment in die EcoR I und BamH I - Stellen des Plasmids pBAD18 Verwendung von Standardverfahren für Restriktionsstelle Klonen. Man reinige das Plasmid ein Plasmid Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Überprüfen Sie die resultierende Plasmid durch Sequenzierung 10. </li><li> Transformieren Sie das Plasmid, das HdeB oder die leeren Vektorkontrolle pBAD18 in den Stamm BB7224 (Δ rpoH) (Genotyp: F -, λ -, e14 - [araD139] B / r [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-fimE) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn10 (Tc S) suhX401 deoC1 araD + rpoH :: kan +; 16) unter Verwendung von chemisch kompetenten Zellen. HINWEIS: Dieser Stamm ist temperaturempfindlich. </li><li> Nach 45 sec Hitzeschock bei 42 ° C und vor der Beschichtung, Inkubation Zellen bei 30 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute. Führen Sie einzelne Kolonie Streifen-outs der positiven Klone und Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Bereiten Sie eine Nacht - Kultur in 50 ml LB - Amp und pflegen die Zellen bei 200 Umdrehungen pro Minute und 30 ° C. </li><li> Verdünnte Nacht - Kulturen 40-fach in 25 ml LB Amp und wachsen die Bakterien in Gegenwart von 0,5% Arabinose (Ara) bei 30 ° C und 200 rpm bis zu einer OD 600nm = 1,0 bis HdeB Proteinexpression induzieren. </li><li> Für die pH-Verschiebung Experimenten verwenden LBDurch Zugabe geeigneter Mengen von 5 M HCl: Amp + Ara die Zellen zu OD 600 nm von 0,5 und passen sich den jeweiligen pH - Werte (pH 2,0, pH 3,0 und pH 4,0 hier) zu verdünnen. </li><li> Nach den angegebenen Zeitpunkten (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), um die Kulturen durch Zugabe der entsprechenden Mengen von 5 M NaOH neutralisiert. </li><li> Überwachen des Wachstums der neutralisierten Kulturen in Flüssigkultur für 12 Stunden bei 30 ° C unter Verwendung von OD-Messungen. </li></ol>

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<html> Um den Mechanismus der Aktivierung und Chaperon-Funktion HdeB große Mengen HdeB zu studieren muss exprimiert und gereinigt werden. Eine Anzahl von Expressionsvektorsysteme sind für die Herstellung von großen Mengen eines Zielproteins, einschließlich pTrc oder pBAD-Vektoren zur Verfügung, von denen beide in dieser Studie verwendet wurden. Die Promotoren sind leicht zugänglich für E. coli - RNA - Polymerase und somit HdeB stark upregulated Ausdruck erlauben in jedem E. coli - Stamm. Dieser Aspekt i...

Eine gemeinsame natürliche Umgebung , in der mikrobiellen Krankheitserregern Entfaltungsbedingungen Säure-induzierte Protein erleben , ist die Säugetier-Magen (pH - Bereich 1-4), deren sauren pH - Wert dient als eine wirksame Barriere gegen Krankheitserreger in Lebensmitteln 1. Proteinentfaltung und Aggregation, die durch Aminosäure-Seitenkette Protonierung verursacht wird, beeinflusst biologische Prozesse, Schäden Zellstrukturen und letztendlich verursacht Zelltod 1,2. Da der pH - Wert der bakteriellen Periplasma fast augenblicklich mit dem Umwelt pH äquilibriert durch die freie Diffusion von Protonen durch die poröse äußere Membran periplasmatische und inneren Membranproteine von Gram-negativen Bakterien sind die empfindlichsten Zellkomponenten unter sauren Stressbedingungen 3. Um ihre periplasmatischen Proteom gegen eine schnelle Säure-vermittelte Schädigung, Gram-negative Bakterien verwenden, um die säureaktivierten periplasmatischen Chaperonen HdeA und HdeB schützen. HdeA ist eine bedingt ungeordnet Chaperon <sup&gt; 4,5: Bei neutralem pH - Wert, ist HdeA vorhanden als gefaltete, Chaperon-inaktive Dimer. Bei einem pH - Verschiebung unter pH 3 wird HdeA die Chaperon - Funktion aktiviert schnell 6,7. Die Aktivierung von HdeA erfordert grundlegenden strukturellen Veränderungen, einschließlich der Dissoziation in Monomere, und die teilweise der Monomere Entfaltung 6-8. Einmal aktiviert, bindet HdeA an Proteine, die unter sauren Bedingungen entfalten. Es verhindert effektiv ihre Aggregation sowohl bei der Inkubation bei niedrigem pH-Wert sowie bei pH Neutralisation. Nach der Rückkehr auf pH 7,0, erleichtert HdeA die Neufaltung seiner Client - Proteine in einem ATP-unabhängige Art und Weise und wandelt wieder in seine dimere, Chaperon-inaktive Konformation 9. In ähnlicher Weise ist die homologe Chaperon HdeB auch Chaperon-inactive bei pH 7,0. Im Gegensatz HdeA jedoch erreicht HdeB die Chaperonaktivität seine scheinbare Maximum bei pH 4,0, Bedingungen , unter denen HdeB noch weitgehend gefaltet und dimeren 10. Außerdem senken, ferner mit den pH-Wert causes die Inaktivierung von HdeB. Diese Ergebnisse legen nahe, dass trotz ihrer umfangreichen Homologie, HdeA und HdeB in der Art ihrer funktionellen Aktivierung unterscheiden und ihnen so einen breiten pH-Bereich mit ihren Schutz Chaperon-Funktion zu decken. Einem anderen Chaperon, die in der Säurebeständigkeit von E. beteiligt ist coli ist die zytoplasmatischen Hsp31, die wiederhergestellt werden entfaltete Client - Proteine bis neutralen Bedingungen zu stabilisieren scheint. Die genaue Art der Hsp31-Aktion hat sich jedoch blieb rätselhaft 12. Da die anderen enteropathogenen Bakterien, wie Salmonella , die hdeAB Operon fehlt, ist es sehr wahrscheinlich , dass andere noch nicht identifizierte periplasmatischen Chaperonen könnte existieren , die in der Säurebeständigkeit dieser Bakterien 11 beteiligt sind. Die Protokolle hier vorgestellten erlauben die pH-abhängige Aktivität von Chaperon HdeB in vitro und in vivo 10 zu überwachen und angewendet werden kann , andere Chaperone zu untersuchenwie Hsp31. Alternativ kann das komplexe Netzwerk von Transkriptionsfaktoren, die die Expression steuern hdeAB potentiell durch den Assay in vivo Stress untersucht werden. Um die Chaperon - Funktion von Proteinen in vivo verschiedene Versuchsanordnungen charakterisieren können angewendet werden. Ein Weg ist die Proteinentfaltungsstressbedingungen anzuwenden und phänotypisch mutante Stämme zu charakterisieren, die entweder das interessierende Gen überexprimieren oder eine Deletion des Gens tragen. Proteom - Studien können durchgeführt werden , um festzustellen , welche Proteine nicht mehr Aggregat unter Stressbedingungen , wenn das Chaperon vorhanden ist, oder der Einfluss eines Chaperons auf einem bestimmten Enzym kann bei Stress - Bedingungen unter Verwendung von enzymatischen Assays 14-16 bestimmt werden. In dieser Studie haben wir uns für HdeB in einer rpoH Deletionsstamms überexprimiert, die den Hitzeschock - Sigma - Faktor 32 fehlt RpoH den Ausdruck aller wichtigen E. steuert coli Chaperone und deren Löschung ist bekannt sens zu erhöhenitivity auf Umweltstressbedingungen , die Proteinentfaltung 15 verursachen. Die in - vivo - Chaperon - Aktivität von HdeB wurde durch Überwachung ihrer Fähigkeit bestimmt , den pH - Empfindlichkeit des Δ rpoH Stamm zu unterdrücken. Insgesamt ist die hier vorgestellten Protokolle einen schnellen und einfachen Ansatz liefern die Aktivität eines säureaktivierten Chaperon in vitro als auch in der in vivo - Kontext zu charakterisieren.

<table><tbody><tr><td>NEB10-beta E. coli Zellen</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon Mix, Lennox</td><td>LAB Express</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826-5kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Polymyxin B-Sulfat&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>100565</tr><tr><td>0,2 &Mikro; m porensteriler Spritzenvorsatzfilter</td><td>Corning</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, 15%</td><td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>Malatdehydrogenase (MDH)</td><td>Roche</td><td>10127914001</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat (monobasisch)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Kalium Phosphat (zweibasisch)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500 Fluoreszenzspektrophotometer</td><td>Hitachi</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>Oxalacetat</td><td>Sigma</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>Laktatdehydrogenase (LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Proteome Lab XL-I analytische Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href='https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render& wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/'>392764</a></td><td></td></tr><tr><td>Tafelstück, 12 mm, Epon Anthrazit gefüllt</td><td>Beckman Schar</td><td>306493</td><td></td></tr><tr><td>AN-50 Ti Rotor, analytisch, 8-fach</td><td>Beckman Schar</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Miniprep Kit</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>zur Plasmidaufreinigung (Protokoll 5.1)</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>DOT Scientific Inc</td><td>DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzzellküvette</td><td>Hellma Analytics</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotide</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Set</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Avanti J-26XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>Varian Cary 50 Spektralphotometer</td><td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 Dialysemembran MWCO: 6 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Zentrifugalfiltereinheiten 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermocycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis des ph-abhängige aktivität von<em&gt; escherichia coli</em&gt; chaperone hdeb<em&gt; in vitro</em&gt; und<em&gt; in vivo</em

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bakterien werden häufig auf Umweltveränderungen ausgesetzt ist, wie beispielsweise Veränderungen in pH, Temperatur, Redox-Status, Lichtexponierung oder mechanische Kraft. Viele dieser Bedingungen verursachen Proteins in der Zelle entfaltet und nachteilige Auswirkungen auf das Überleben des Organismus. Eine Gruppe von unabhängigen, Stress spezifische molekulare Chaperone gezeigt wesentliche Rolle für das Überleben dieser Stressbedingungen wurden spielen. Während vollständig gefaltet und Chaperon-inaktiv vor Stress, diese Proteine ​​schnell entfalten und werden Chaperon-aktiv unter bestimmten Stressbedingungen. Einmal aktiviert, wobei diese bedingt ungeordneten Chaperone binden an eine Vielzahl von unterschiedlichen aggregationsanfällig Proteine, verhindern ihre Aggregation und entweder direkt oder indirekt Protein bei der Rückkehr in Nichtstressbedingungen Rückfaltungs erleichtern. Der primäre Ansatz ein detaillierteres Verständnis über den Mechanismus ihrer Aktivierung und Client-Erkennung für die Gewinnung umfasst die Reinigung und subsequent Charakterisierung dieser Proteine in vitro - Assays unter Verwendung von Chaperon. Follow-up - in - vivo - Stress - Tests sind absolut notwendig , um unabhängig die in - vitro - Ergebnisse bestätigt werden können . Dieses Protokoll beschreibt in vitro und in vivo - Verfahren der Chaperon - Aktivität von E. Charakterisierung coli HdeB, ein säureaktivierter Chaperon. Lichtstreuungsmessungen wurden als bequeme Auslese für HdeB Fähigkeit verwendet , um säureinduzierte Aggregation eines etablierten Modell Client Protein, MDH, in vitro zu verhindern. Analytische Ultrazentrifugation Experimente wurden angewandt, um die Komplexbildung zwischen HdeB und ihrem Kunden Protein LDH zeigen, Licht in das Schicksal von Client-Proteine ​​nach ihrer Rückkehr in Nicht-Stress-Bedingungen zu vergießen. Die enzymatische Aktivität Assays der Client-Proteine ​​wurden durchgeführt, um die Auswirkungen von HdeB auf pH-induzierte Client-Inaktivierung und Reaktivierung zu überwachen. Schließlich wurden die Überlebensstudien verwendet monitor den Einfluss von Chaperon - Funktion des HdeB in vivo.

HdeA und HdeB sind E. homolog coli - Proteine, bekannt periplasmatische Proteine gegen Säurestressbedingungen 10 zu schützen. Unsere Arbeit ergab, dass ähnlich wie HdeA, HdeB fungiert auch als eine Säure molekularen Chaperon aktiviert. Jedoch im Gegensatz zu HdeA, HdeB Funktionen bei einem pH, der noch potentiell bakterizide, aber deutlich höher als der pH - Optimum von HdeA 6,9,10,22. Um den pH - Optimum von HdeB der Chaperon - Aktivität in vi...

Diese Studie beschreibt biophysikalischen, biochemischen und molekularen Techniken , um die Chaperon - Aktivität von Escherichia coli HdeB unter sauren pH - Bedingungen zu charakterisieren. Diese Verfahren wurden für andere Säureschutz Chaperone wie HdeA erfolgreich angewendet und kann modifiziert werden, um andere Chaperone und Belastungsbedingungen zu arbeiten.

Nachweis des pH-abhängige Aktivität von<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; und<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Das übergeordnete Ziel dieser in-vivo- und in-vitro-Chaperon-Assays besteht darin, die pH-abhängige Aktivität des Escherichia coli-Chaperons HdeB unter sauren pH-Bedingungen zu charakterisieren. Säureaktivierte Chaperone haben nur eine einzige Aufgabe: Sie müssen Proteine vor säureinduzierter Entfaltung und vor Abbau schützen. Diese Funktion ist besonders wichtig für enterische Bakterien, die die saure Umgebung des Magens überleben müssen, um den Darm erfolgreich besiedeln zu können.Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen es Ihnen, säureaktivierte Chaperone zu identifizieren und zu charakterisieren sowie die pH-Bedingungen zu definieren, die zu ihrer Aktivierung führen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Chaperone wie HdeB in vitro und in vivo charakterisiert, was Ihnen hilft, den Mechanismus ihrer Aktivierung zu entschlüsseln. Diese Methoden wurden bereits erfolgreich auf andere säureschützende Chaperone wie HDA angewandt und können weiter modifiziert werden, um mit anderen Chaperonen und/oder Stressbedingungen zu funktionieren.Der Einfluss von gereinigtem HdeB auf die Aggregation von thermisch entfaltender porciner mitochondrialer Malatdehydrogenase bei verschiedenen pH-Werten wird überwacht. Dialysieren Sie MDH über Nacht bei vier Grad Celsius gegen vier Liter Puffer C. Anschließend konzentrieren Sie das Protein mithilfe von Zentrifugalfiltereinheiten mit einer Molekulargewichts-Cutoff-Grenze von 30 Kilodalton auf etwa 100 Mikromolar. Um Aggregate zu entfernen, zentrifugieren Sie das Protein 20 Minuten bei 20.000 × g und vier Grad Celsius.Bestimmen Sie die MDH-Konzentration durch Absorption bei 280 Nanometer. Bereiten Sie anschließend 50 Mikroliter-Aliquote von MDH vor und schockgefrieren Sie die Aliquote zur Lagerung. Geben Sie eine 1-Milliliter-Quarzküvette in ein Fluoreszenzspektrophotometer, das mit temperaturgesteuerten Probenhaltern und Rührern ausgestattet ist.Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlänge auf 350 Nanometer ein. Geben Sie die entsprechenden Volumina des vorgewärmten Puffers D bei den gewünschten pH-Werten in die Küvette. Das Gesamtvolumen beträgt 1.000 Mikroliter.Stellen Sie die Temperatur im Küvettenhalter auf 43 Grad Celsius ein. Geben Sie 12,5 µM HdeB zum Puffer hinzu, gefolgt von der Zugabe von 0,5 µM MDH. Beginnen Sie mit der Überwachung der Lichtstreuung.Die Reaktion 360 Sekunden lang inkubieren, um eine ausreichende Entfaltung von MDH zu ermöglichen. Den pH-Wert durch Zugabe von 0,16 bis 0,34 Volumina zwei molarer ungepufferter Dipotassiumphosphat auf sieben erhöhen und die Lichtstreuung weitere 440 Sekunden lang aufzeichnen. Die Daten wie im Textprotokoll beschrieben analysieren.Transformieren Sie das Plasmid, das HdeB oder den MD-Vektor-Kontrollstamm PBAD 18 exprimiert, in den Stamm BB7224 Delta RPOH unter Verwendung chemisch kompetenter Zellen. Dieser Stamm ist temperatursensitiv und muss bei 30 Grad Celsius kultiviert werden. Inkubieren Sie die Zellen nach 45 Sekunden Hitzeschock bei 42 Grad Celsius und vor dem Aufplattieren bei 30 Grad Celsius und 200 U/min.Streichen Sie Einzelkolonien positiver Klone und inkubieren Sie diese über Nacht bei 30 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Übernachtkultur in 50 Milliliter LB mit Ampicillin vor und kultivieren Sie die Zellen bei 200 U/min und 30 Grad Celsius. Verdünnen Sie die Übernachtkulturen 40-fach in 25 Milliliter LB mit Ampicillin.Züchten Sie die Bakterien bei 30 Grad Celsius und 200 U/min in Gegenwart von 0,5 % Arabinose bis zu einer optischen Dichte bei 600 Nanometern (OD 600) von 1,0, um die Expression des HDEB-Proteins zu induzieren. Für die pH-Schritt-Experimente verwenden Sie LB mit Ampicillin und Arabinose, um die Zellen auf eine OD 600 von 0,5 zu verdünnen. Stellen Sie die jeweiligen pH-Werte ein, indem Sie geeignete Volumina von fünf molarer Salzsäure zugeben.Nach den angegebenen Zeitpunkten werden die Kulturen durch Zugabe der entsprechenden Volumina fünf molarer Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Überwachen Sie das Wachstum der neutralisierten Kulturen und der Flüssigkultur 12 Stunden lang bei 30 Grad Celsius mittels OD-Messungen. Um das pH-Optimum der Chaperon-Aktivität von HdeB in vitro zu untersuchen, wurde natives MDH in vorgewärmtes Puffermedium des angegebenen pH-Werts in Gegenwart oder Abwesenheit von HdeB verdünnt.Nach 360 Sekunden Inkubation wurde die Aggregation von MDH bei 43 Grad Celsius durch Neutralisation ausgelöst. In Gegenwart von HdeB ist das Lichtstreuungssignal nach der Neutralisation von pH 4 signifikant verringert, was darauf hinweist, dass HdeB die Aggregation von MDH verhindert. Aggregationsmessungen sind sehr empfindlich gegenüber Änderungen der Temperatur oder der Pufferzusammensetzung.Um falsch positive Ergebnisse auszuschließen, wurde der Einfluss des Chaperon-Lagertanks auf die Aggregation der Client-Proteine untersucht. Der HdeB-Lagertank hatte keinen Einfluss auf die MDH-Aggregation. Um die Effekte von HdeB in vivo zu untersuchen, wurden pH-abhängige Überlebensassays mit dem temperatursensitiven RPOH-Deletionsstamm durchgeführt.Dieser Stamm weist einen Mangel an den meisten Chaperonen auf und ist daher anfälliger für erhöhte Temperaturen, niedrigen pH-Wert oder oxidativen Stress. Eine Überexpression von HdeB unter neutralen pH-Bedingungen zeigte keine Wirkung auf die Wachstumsrate des Stammes, der vergleichbar gut wuchs wie der Kontrollstamm, der den leeren Vektor PBAD 18 enthält. Im Gegensatz dazu wurden deutliche Unterschiede in der Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums nach Behandlung bei pH 3 oder pH 4 festgestellt, wobei der HdeB-überexprimierende Stamm reproduzierbar eine verbesserte Erholung nach Behandlung mit niedrigem pH-Wert im Vergleich zum Kontrollstamm zeigte.Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann die Reinigung innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden, der In-vitro-Streutest an einem Tag und die In-vivo-Überlebensassays an zwei Tagen, sofern alles ordnungsgemäß durchgeführt wird. Berücksichtigen Sie bei der Durchführung dieser Experimente sorgfältig das experimentelle Design, insbesondere hinsichtlich der Art der Clientproteine, deren Konzentrationen und der verwendeten Pufferbedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zu einem detaillierteren Verständnis des Mechanismus der Chaperonaktivierung und deren Auswirkungen in einem In-vivo-Kontext beiträgt.Und vergessen Sie nicht, dass die Untersuchung des pH-Optimums eines säureprotektiven Chaperons ziemlich herausfordernd sein kann. Dies liegt daran, dass sich das Aggregationsverhalten des verwendeten Zielproteins wahrscheinlich ebenfalls mit dem pH-Wert ändert. Stellen Sie daher sicher, dass Sie Puffersysteme wählen, die sowohl für das Chaperon als auch für das Zielprotein geeignet sind.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Spin-Down-Assays nach SCS-Seite durchgeführt werden, um die automatisch quantifizierte chaperonvermittelte Unterdrückung der Aggregation von Substraten zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Quelle: Dahl, J. et al. Nachweis der pH-abhängigen Aktivität von Escherichia coli Chaperone HdeB In vitro und In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert einen auf Fluoreszenzspektrophotometer basierenden Test zur Bewertung der Chaperonaktivität auf einem Substratprotein unter Säure- und Hitzestress. Es beschreibt die Schritte zur Überwachung der Entfaltung und Aggregation des Substrats durch Lichtstreuung und vergleicht Bedingungen mit und ohne den Begleiter.

Bewertung der bakteriellen Chaperonaktivität mittels thermischer Entfaltung eines Modellproteins

Quelle: Dahl, J., et al. Nachweis der pH-abhängigen Aktivität von Escherichia coli Chaperone HdeB In vitro und In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert den Einsatz rekombinanter E.-coli-Kulturen , um die schützende Wirkung eines säureaktivierten Chaperons während Säurestress zu bewerten. Die Überwachung des bakteriellen Wachstums zeigt ein verbessertes Überleben in chaperon-exprimierenden Kulturen im Vergleich zu Kontrollen und unterstreicht die Rolle von Chaperonen bei der...

Bewertung der schützenden Rolle eines säureaktivierten Chaperons bei E. coli unter Säurestress

Auf den aktuellen Protokollinformationen ein Verfahren zur Messung der Aktivität der funktionell homolog Deubiquitinierungsenzyme. Specialized-Sonden, die das Enzym kovalent modifizieren und lassen für die Erkennung. Dieses Verfahren hält das Potenzial, neue therapeutische Targets zu identifizieren.

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

Ein detailliertes Protokoll von einem Maus-Modell für Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) Besiedlung durch mit Hilfe von Bakterien mit der Bezeichnung der Biolumineszenz wird vorgestellt. Die Erkennung dieser biolumineszenten Bakterien durch eine nicht-invasive in Vivo imaging-System mit lebenden Tieren kann unser gegenwärtige Verständnis der EHEC Besiedlung voraus.

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Cognate J-Domain-Proteine arbeiten mit dem Hsp70-Chaperon zusammen, um eine Vielzahl biologischer Prozesse zu unterstützen, die von der Proteinfaltung bis zum Abbau reichen. Hier beschreiben wir einen in situ-Näheligationstest, der die Überwachung dieser vorübergehend gebildeten Chaperon-Maschinen in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Zellen ermöglicht.

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

Um Chaperon-Chaperon- und Chaperon-Substrat-Interaktionen zu untersuchen, führen wir synthetische Interaktionsscreens bei Caenorhabditis elegans mit RNA-Interferenz in Kombination mit leichten Mutationen oder Überexpression von Chaperonen durch und überwachen gewebespezifische Proteindysfunktion auf organismischer Ebene.

Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, die eine analytische Größenausschlusschromatographie zur Untersuchung der Histon-Chaperon-Oligomerisierung und -stabilität, den Pull-Down-Assay zur Entschlüsselung von Histon-Chaperon-Histon-Interaktionen, die AUC zur Analyse der Stöchiometrie der Proteinkomplexe und den Histon-Chaperoning-Assay zur funktionellen Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons in vitro umfassen.

In vitro Charakterisierung von Histon-Chaperonen mittels analytischer, Pull-Down- und Chaperoning-Assays

Dieses Protokoll zeigt die Chaperon-Aktivität des Hitzeschockproteins 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-Zellen dienen als Modell für den Assay, da sie ein natives, funktionell beeinträchtigtes Hsp70 beherbergen, was sie anfällig für Hitzestress macht. Die heterologe Einführung von funktionellem Hsp70 rettet die Wachstumsschwäche der Zellen.

Escherichia coli-basierter Komplementationsassay zur Untersuchung der Chaperonfunktion des Hitzeschockproteins 70

Ein Protokoll für die Produktion, Reinigung und Verwendung von enzymverpackten äußeren Membranvesikeln (OMV), das eine verbesserte Enzymstabilität für den Einsatz in verschiedenen Anwendungen bietet, wird vorgestellt.

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

Erfahren Sie die Charakterisierung der pH-abhängigen Chaperon-Aktivität von Escherichia coli HdeB unter sauren Bedingungen. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung säureaktivierter Chaperone und deren Aktivierungsmechanismen.

Nachweis des pH-abhängige Aktivität von

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