Die Extraktion von Strukturextrazellulären polymeren Substanzen aus Aerobic Granular Sludge

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Extraktionsmethodik zur Gewinnung struktureller extrazellulärer polymerer Substanzen oder EPS aus Bio-Schäumen, insbesondere aus aerobem Kornschlamm, darzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Kornschlamms zu beantworten, beispielsweise das Verständnis des Granulationsprozesses sowie die Analyse der EPS-Zusammensetzung.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Vorhandensein von Gelfoam-Polymeren in EPS kurzfristig überprüft werden kann. Zentrifugieren Sie den körnigen Schlamm bei 4.000 × g und vier Grad Celsius für 20 Minuten und dekantieren Sie den Überstand. Sammeln Sie die Körnchen im Pellet zur Extraktion.

Erhitzen Sie 150 Milliliter Leitungswasser in einem 1.000-Milliliter-Glaskolben auf einem Magnetrührer auf 80 Grad Celsius vor. Geben Sie drei Gramm Granulat in einen 250-Milliliter-Rundkolben mit Aussteifungen und füllen Sie den Kolben mit entmineralisiertem Wasser bis auf 50 Milliliter auf. Fügen Sie 0,67 Gramm Natriumcarbonat-Decahydrat zum Kolben hinzu, um eine Natriumcarbonat-Konzentration von 0,5 % Gewicht pro Volumen zu erhalten.

Stellen Sie den Kolben mit der Mischung in das Wasserbad. Decken Sie den Kolben und das Becherglas separat mit Aluminiumfolie ab, um Verdunstung zu verhindern. Rühren Sie die Mischung 35 Minuten lang bei 400 U/min und 80 Grad Celsius.

Überführen Sie das Gemisch in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit dem Gemisch bei 4.000 × g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Sammeln Sie das Überstand und verwerfen Sie den Pellet.

Der Dialyse-Schritt ist optional, um strukturelle EPS aus aerobem Kornschlamm zu gewinnen. Er bietet jedoch mehrere Vorteile, die im Protokoll beschrieben sind. Pipettieren Sie das Überstand in einen Dialysebeutel mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 3.500 Dalton und führen Sie die Dialyse 24 Stunden lang gegenüber 1000 ml Ultrapurem Wasser durch.

Wechseln Sie das Dialysewasser nach 12 Stunden, um die Wirkung der Dialyse zu verbessern. Überführen Sie das dialysierte Extrakt in einen 250 ml fassenden Glasbecher und rühren Sie das Extrakt langsam bei 100 U/min und Raumtemperatur um. Überwachen Sie kontinuierlich die pH-Änderungen mit einer pH-Elektrode, während Sie 1-molare Salzsäure unter Rühren bis zu einem End-pH-Wert von 2,205 zugeben, um das Ale in seiner sauren Form zu erhalten.

Nach der Einstellung des pH-Werts auf 2,2 wird das Extrakt in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 4000 × g und 4 °C zwanzig Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das gelartige Pellet gesammelt. Das gelartige Pellet liegt in der sauren Form vor.

Um die Natriumform von Ale zu erhalten, geben Sie langsam 0,5 molare Natriumhydroxidlösung zum Gel hinzu und mischen das Gel dabei langsam per Hand mit einem Glasstab, bis ein pH-Wert von 8,5 erreicht ist. Mit einer Pasteurpipette wird der Natrium-Ale-Extrakt langsam tropfenweise in eine Calciumchloridlösung eingebracht. Wenn das extrahierte EPS ionische Hydrogel-bildende Eigenschaften besitzt, bilden sich tropfenförmige, kugelige Perlen.

Alternativ wird, falls das extrahierte EPS keine ionischen hydrogelformenden Eigenschaften aufweist, der Extrakt in der Calciumchloridlösung dispergieren. Die Hydrogelkügelchen und die Calciumchloridlösung 30 Minuten lang belassen. Mit einem Löffel die Hydrogelkügelchen aus der Calciumchloridlösung entnehmen und in eine EDTA-Lösung überführen.

Lagern Sie die Hydrogel-Kügelchen für drei Stunden in 10 ml EDTA-Lösung bei vier Grad Celsius. Dieser Test zeigt ein Beispiel für die im Protokoll beschriebenen Stabilitätsprüfungen. Überwachen Sie, ob während dieser Lagerung eine sichtbare Zersetzung der Kügelchen auftritt, um zu bewerten, ob die Kügelchen diesen Bedingungen standhalten können.

Falls die Extraktion erfolgreich war, wird der aerobe körnige Schlamm nach dem alkalischen Extraktionsschritt solubilisiert, und nach der Ansäuerung und Zentrifugation des extrahierten EPS wird ein Pellet erhalten. Wenn es sich bei den extrahierten EPS um strukturelle EPS handelt und diese die Fähigkeit besitzen, mit Calciumionen Hydrogele zu bilden, entstehen Gelkügelchen, wenn die extrahierten EPS in die Calciumlösung getropft werden. Werden hingegen EPS extrahiert, die nicht über diese Gelebildungs-Fähigkeit verfügen, so dispergiert die EPS-Lösung in der Calciumlösung.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, die Extraktion struktureller EPS aus aerobem Kornschlamm durchzuführen. Außerdem sollten Sie die Fähigkeit der gewonnenen EPS, mit Calciumionen Gele zu bilden, testen können. Wir haben diese Extraktionsmethodik ausgewählt, um den Einfluss der Extraktionstechnik auf die aus aerobem Kornschlamm gewonnenen EPS zu veranschaulichen.

Außerdem wollten wir zeigen, dass keine EPS-Extraktionsmethode universell anwendbar ist.