Imaging Zelllebensfähigkeit auf Undurchsichtige Scaffolds - am Beispiel eines neuartigen Strick-Titan-Implantat
September 7th, 2016
Hier präsentieren wir eine Fluorophor basierte Bildgebungstechnik die Lebensfähigkeit der Zellen auf einem nicht transparenten Titangerüst zu erkennen sowie Einblicke in die Gerüst Verunreinigungen erkennen. Dieses Protokoll behebt den Nachteil des Abbildens Zell-Zell oder Zell-Metall-Wechselwirkungen auf nichttransparenten Gerüste.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Mikrostruktur und Zelladhäsion auf einem undurchsichtigen gestrickten Titankernimplantat mit Hilfe von Fluoreszenzbildgebungsverfahren sichtbar zu machen. Diese Methode treibt die Analyse des Tissue Engineering mit undurchsichtigen Gerüsten voran. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass man sowohl die Zellviabilität als auch die Proliferation auf dem Gerüst mit definierter Kultivierungsluft verfolgen kann.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Fluoreszenzfärbung und später die Visualisierung eine Herausforderung darstellt. Individuelle Gerüsteigenschaften wie die Porengröße können das Timing beeinflussen, und/oder die Fluoreszenz des Gerüsts können die Wahl der von Ihnen verwendeten Fluorophore beeinflussen. Legen Sie bis zu fünf sechs oder sieben Millimeter dicke Gerüste in ein 50-Milliliter-Rohr und waschen Sie sie dreimal 20 Minuten pro Waschgang mit Wasser.
Tun Sie dies bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Waschen Sie anschließend die Gerüste in 30 Millilitern 1%iger Triton X-100-Lösung unter den gleichen Bedingungen. Führen Sie dann zwei weitere Wasserwäschen durch.
Beschallen Sie nun die Gerüste nacheinander mit 99 % Aceton, 99 % Isopropanol und 99 % Ethanol in Reagenzqualität. Führen Sie jeden Beschallungsschritt zweimal für fünf Minuten pro Beschallung durch. Beschallen Sie das Gerüst dann noch dreimal für insgesamt 15 Minuten mit Wasser.
Zum Schluss legen Sie die Gerüste auf ein fusselfreies Tuch und trocknen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft. Am nächsten Tag autoklavieren Sie die Gerüste für 15 Minuten bei 121 Grad Celsius und 15 PSI. Um zu bestätigen, dass die Reinigung funktioniert hat, verwenden Sie indirekte Fluoreszenz.
Beladen Sie eine Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 2000 Mikrolitern der frisch hergestellten Schwefel-Rhodamin-B-Färbelösung und übertragen Sie mit einer Pinzette ein Gerüst in diese Vertiefung. Nehmen Sie dann mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem RFP-LED-Würfelfilterset ausgestattet ist, Negativbilder des Gerüsts auf und suchen Sie bei hoher Vergrößerung nach Verunreinigungen. Übertragen Sie die sauberen Gerüste mit der Biosicherheitswerkbank in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte.
Geben Sie 500 Mikroliter 37 Grad Celsius heißes Kulturmedium in jede Vertiefung und lassen Sie das Gerüst 15 Minuten lang einweichen. Bereiten Sie in der Zwischenzeit 500.000 Ad-GFP-infizierte SEP1-Zellen pro 1 Milliliter Medium vor. Nach 15 Minuten saugen Sie das Medium vollständig aus den Gerüsten an und setzen Sie sie mit 100 Mikrolitern der Zellsuspension auf.
Inkubieren Sie sie dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie nach der kurzen Inkubation weitere 500 Mikroliter Nährmedium hinzu und inkubieren Sie die Gerüste 24 Stunden lang. Wechseln Sie am nächsten Tag das Kulturmedium, um nicht adhärente Zellen zu entfernen.
Bewerten Sie dann die Adhärenz und Ausbreitung der Zellen auf den Gerüsten mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem GFP-LED-Würfelfilterset ausgestattet ist. Für eine Lebend-Tot-Färbung plattieren Sie zunächst die SEP1-Zellen wie bisher auf dem Gerüst. Nach 24 bis 48 Stunden wird das Nährmedium vollständig abgesaugt und die Gerüste fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit DPBS gewaschen.
Färben Sie die Zellen nun mit einem Kulturmedium, das Calcein AM, Hoechst 33342 und Ethidium-Homodimer enthält. Diese drei Fluorophore sind alle lichtempfindlich, daher ist es wichtig, die Zellen im Dunkeln zu halten. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit den Fluorophoren, um eine gleichmäßige Verteilung im Gerüst zu erhalten.
Spezifische Gerüsteigenschaften beeinflussen diese Inkubationszeit. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit DPBS und verwenden Sie einen Milliliter pro Vertiefung. Führen Sie jede Wäsche fünf Minuten lang bei Raumtemperatur durch.
Unmittelbar nach den Wäschen dokumentieren Sie die Gerüste fluoreszenzmikroskopisch. Um die Lebensfähigkeit der Zellen im Laufe der Zeit zu messen, verwenden Sie Resazurin-Umwandlungsmessungen. Aspirieren Sie zunächst das Kulturmedium vollständig aus den SEP1-Zellen, die in einer 24-Well-Platte sitzen, und waschen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern DPBS pro Well.
Bedecken Sie dann die Zellen mit dem erforderlichen Volumen steriler Resazurin-Arbeitslösung und fügen Sie eine Vertiefung nur mit Resazurin hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen etwa 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation werden 100 Mikroliter des konditionierten Überstands aus jeder Vertiefung in eine 96-Mikrotiterplatte überführt, um seine Fluoreszenz zu messen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Für die weitere Kultivierung das Resazurin aus der Vertiefung nehmen und dreimal mit einem Milliliter DPBS waschen. Führen Sie jede Wäsche fünf Minuten lang bei Raumtemperatur durch. Nach dem dritten Waschen geben Sie 500 Mikroliter Kulturmedium in jede Vertiefung der Zellen und setzen Sie die Inkubation für weitere Messungen im Zeitverlauf fort.
Mittels indirekter Fluoreszenzfärbung wurden Verunreinigungen vor der Reinigung dokumentiert, um das Reinigungsprotokoll zu optimieren. Eine deutliche Reduzierung der Substanzbelastung des Gerüsts zeigt die Effizienz des beschriebenen Reinigungsprotokolls. Die Anzahl der aufeinanderfolgenden Implantate, die für die Endoprothetikbehandlung verwendet werden, wird durch Ereignisse bestimmt, die an der Grenzfläche des Zellmaterials stattfinden.
Nach 24 Stunden Adhärenz mit den Gerüsten hatten sich die SEP1-Zellen angeheftet. Anschließend wurden Fluorophore eingesetzt, um den Zelltod und die Zellproliferation über einen bestimmten Zeitraum auf den Gerüsten zu untersuchen. Die Färbung lebender toter Zellen zeigte eine blaue Kernfärbung mit roter Fluoreszenz in toten Zellen und grüner Fluoreszenz in lebensfähigen Zellen.
Darüber hinaus wurde die Zellviabilität auf dem Gerüst mit Hilfe des Resazurin-Conversion-Assays quantifiziert. Über einen Zeitraum von zwei Wochen wurden Daten an Zellen gesammelt, die mit oder ohne Gerüste kultiviert wurden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Fluorophore, die Sie verwenden, an das Gerüst und das Mikroskop anzupassen, die Ihnen zur Verfügung stehen.
Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Immunfluoreszenzfärbung, angewendet werden, um das Vorhandensein von Proteinen oder die Aktivierung von Signalkaskaden sichtbar zu machen. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Therapie der Endoprothetik, da die Interaktion der Zellfläche mit dem umgebenden Gewebe in vivo ihre Funktion und Haltbarkeit bestimmt.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert eine fluoreszierende Bildgebungstechnik zur Visualisierung der Zelladhäsion und -lebensfähigkeit auf einem nicht-transparenten Titangerüst. Die Methode adressiert Herausforderungen bei der Bildgebung von Zellinteraktionen mit nicht-transparenten Materialien und verbessert die Analyse in der Gewebezüchtung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Gewebezüchtung
Hintergrund
- Nicht-transparente Gerüste stellen Herausforderungen für die Bildgebung von Zellinteraktionen dar.
- Fluoreszierende Bildgebung kann Einblicke in die Zelllebensfähigkeit und -proliferation geben.
- Gerüsteigenschaften, wie die Porengröße, können die Bildgebungsergebnisse beeinflussen.
- Eine visuelle Demonstration ist aufgrund der Komplexität der fluoreszierenden Färbung unerlässlich.
Zweck der Studie
- Visualisierung der Mikrostruktur und Zelladhäsion auf Titanimplantaten.
- Verbesserung der Analysemethoden für nicht-transparente Gerüststrukturen.
- Lösung von Bildgebungsherausforderungen, die mit diesen Materialien verbunden sind.
Verwendete Methoden
- Fluoreszierende Bildgebungstechniken zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit.
- Vorbereitung von Titangerüsten für die Bildgebung.
- Waschprotokolle zur Gewährleistung der Klarheit der Bildgebungsergebnisse.
- Berücksichtigung der Gerüsteigenschaften, die die Wahl des Fluorophors beeinflussen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Zelladhäsion auf Titangerüsten.
- Nachgewiesene Fähigkeit, Zelllebensfähigkeit und -proliferation zu verfolgen.
- Identifizierung des Einflusses der Gerüsteigenschaften auf die Bildgebung.
- Bereitstellung eines zuverlässigen Protokolls für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Die Technik verbessert das Verständnis von Zell-Material-Interaktionen.
- Sie bietet eine Lösung für Bildgebungsherausforderungen mit nicht-transparenten Gerüsten.
- Zukünftige Anwendungen können die Ergebnisse in der Gewebezüchtung verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Imaging cell viability on non-transparent scaffolds, such as knitted titanium implants, addresses a critical bottleneck in tissue engineering and regenerative medicine R&D. This capability enables direct assessment of cell-material interactions, supporting predictive confidence in scaffold biocompatibility and functional integration. The method is strategically positioned to inform early discovery, target validation, and risk-adjusted advancement of novel implantable materials.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cell adhesion and viability on opaque biomaterials, clarifying cell-material interface mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying cell proliferation and survival on candidate scaffolds.
- Facilitates mechanistic de-risking of new implant materials prior to in vivo studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized protocol for preparing and imaging non-transparent scaffolds in vitro.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for cell viability and proliferation using fluorescence-based assays.
- Enables reliable comparison of scaffold cleaning protocols and surface modifications for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biocompatibility data with translational requirements for implantable devices.
- Supports continuity from discovery-stage scaffold evaluation to preclinical model selection.
- Reduces biological risk by enabling early detection of adverse cell-material interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for implantable biomaterials, bridging early hypothesis testing and translational validation.
- Discovery Biology: Quantifies cell adhesion, viability, and proliferation on candidate scaffolds to inform material selection.
- Screening: Standardizes viability and proliferation assays for non-transparent materials, supporting reproducibility and scalability.
- Analytics: Provides fluorescence-based quantitative readouts for cross-condition and time-course comparisons.
- Translational Research: Aligns in vitro cell-material interaction data with preclinical implant requirements.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for evaluating diverse non-transparent scaffold platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in scaffold biocompatibility and functional integration.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging and quantification protocols for opaque materials.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for novel implant candidates, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of scaffold technologies for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cell culture techniques.
- Demands access to appropriate fluorophores and imaging instrumentation compatible with scaffold properties.
- Necessitates cross-team standardization of cleaning and staining protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different scaffold geometries, pore sizes, or material compositions.
- Fluorophore selection and imaging parameters must be optimized for each scaffold type to avoid signal interference.
