Imaging Zelllebensfähigkeit auf Undurchsichtige Scaffolds - am Beispiel eines neuartigen Strick-Titan-Implantat

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Mikrostruktur und Zelladhäsion auf einem undurchsichtigen, stricktechnisch hergestellten Titanimplantat mittels fluoreszenzbildgebender Verfahren sichtbar zu machen. Diese Methode verbessert die Analyse des Gewebeengineerings bei undurchsichtigen Gerüsten. Ein Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass man die Zellviabilität sowie die Proliferation auf dem Gerüst unter definierten Kulturbedingungen mit Ped-Luft verfolgen kann.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die fluoreszente Färbung und später die Visualisierung herausfordernd sind. Individuelle Eigenschaften des Gerüsts, wie beispielsweise die Porengröße, können die Dauer beeinflussen, und/oder die Autofluoreszenz des Gerüsts kann die Wahl der verwendeten Fluorochrome beeinflussen. Geben Sie bis zu fünf Gerüste mit einer Dicke von sechs oder sieben Millimetern in ein 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie sie dreimal für jeweils 20 Minuten mit Wasser.

Führen Sie dies bei Raumtemperatur mit sanfter Agitation durch. Waschen Sie anschließend die Scaffolds unter gleichen Bedingungen in 30 Milliliter 1 % Triton X-100-Lösung. Danach führen Sie zwei weitere Wasserwäschen durch.

Sonizieren Sie nun die Scaffolds nacheinander in Reagenzgrad-Aceton (99 %), 99 % Isopropanol und 99 % Ethanol. Führen Sie jeden Sonikationsschritt zweimal für jeweils fünf Minuten durch. Anschließend sonizieren Sie den Scaffold dreimal in Wasser für insgesamt 15 Minuten.

Bringen Sie die Scaffolds abschließend auf ein fusselfreies Tuch auf und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Am nächsten Tag autoklavieren Sie die Scaffolds 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius und 15 PSI. Um zu überprüfen, ob die Reinigung erfolgreich war, verwenden Sie indirekte Fluoreszenz.

Geben Sie 2000 Mikroliter der frisch hergestellten Schwefel-Rhodamin B-Färbelösung in ein Loch einer 12-Loch-Platte und überführen Sie mithilfe einer Pinzette ein Gerüst in dieses Loch. Erstellen Sie anschließend Negativbilder des Gerüsts mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem RFP-LED-Würfelfilter ausgestattet ist, und suchen Sie bei hoher Vergrößerung nach Verunreinigungen. Überführen Sie im Biosicherheitswerkbank eins die sauberen Gerüste in die Löcher einer 24-Loch-Platte.

Geben Sie 500 Mikroliter Kulturmedium mit 37 Grad Celsius in jede Vertiefung und lassen Sie das Gerüst 15 Minuten lang einweichen. Bereiten Sie derweil 500.000 Ad-GFP-infizierte SEP1-Zellen pro 1 Milliliter Medium vor. Nach 15 Minuten saugen Sie das Medium vollständig von den Gerüsten ab und besiedeln diese mit 100 Mikrolitern der Zellsuspension.

Dann inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der kurzen Inkubation fügen Sie weitere 500 Mikroliter Kulturmedium hinzu und inkubieren die Scaffolds 24 Stunden lang. Am nächsten Tag wechseln Sie das Kulturmedium, um nicht-angewachsene Zellen zu entfernen.

Danach die Adhäsion und Ausbreitung der Zellen auf den Gerüsten mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops, das mit einem GFP-LED-Würfelfilter ausgestattet ist, bewerten. Für eine Live-Dead-Färbung zunächst die SEP1-Zellen wie zuvor auf dem Gerüst ansäen. Nach 24 bis 48 Stunden das Kulturmedium vollständig abpipettieren und die Gerüste bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit DPBS waschen.

Färben Sie die Zellen nun mit einem Kulturmedium, das Calcein AM, Hoechst 33342 und Ethidiumhomodimer enthält. Diese drei Fluorophore sind alle lichtempfindlich, weshalb es entscheidend ist, die Zellen ab diesem Zeitpunkt im Dunkeln zu halten. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten mit den Fluorophoren, um eine gleichmäßige Verteilung innerhalb des Scaffolds zu gewährleisten.

Bestimmte Eigenschaften des Gerüsts beeinflussen diese Inkubationszeit. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit DPBS, wobei ein Milliliter pro Vertiefung verwendet wird. Führen Sie jeden Waschschritt fünf Minuten bei Raumtemperatur durch.

Unmittelbar nach den Waschschritten dokumentieren Sie die Scaffolds mittels Fluoreszenzmikroskopie. Um die Zellviabilität über die Zeit zu messen, verwenden Sie Resazurin-Umsatzmessungen. Entfernen Sie zunächst vollständig das Kulturmedium aus den SEP1-Zellen in einer 24-Loch-Platte und waschen Sie die Zellen mit jeweils 500 Mikrolitern DPBS pro Loch.

Decken Sie die Zellen anschließend mit dem erforderlichen Volumen an steriler Resazurin-Arbeitslösung ab und führen Sie eine Vertiefung nur mit Resazurin als Kontrolle ein. Inkubieren Sie die Zellen dann 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation übertragen Sie 100 Mikroliter des konditionierten Überstandes aus jeder Vertiefung in eine 96-Mikro-Well-Platte, um die Fluoreszenz gemäß dem schriftlichen Protokoll zu messen.

Entfernen Sie für die weitere Kultivierung die Resazurin aus der Vertiefung und waschen Sie dreimal mit je einem Milliliter DPBS. Führen Sie jeden Waschschritt fünf Minuten bei Raumtemperatur durch. Nach dem dritten Waschen geben Sie 500 Mikroliter Kulturmedium in jede Zellvertiefung und setzen die Inkubation für weitere zeitliche Messungen fort.

Mithilfe indirekter fluoreszenter Färbung wurden vor der Reinigung vorhandene Verunreinigungen dokumentiert, um das Reinigungsprotokoll zu optimieren. Die deutliche Verringerung der Substanzbelastung auf dem Gerüst zeigt die Effizienz des beschriebenen Reinigungsprotokolls. Die Entwicklung der aufeinanderfolgenden Implantate, die für die Gelenkersatzbehandlung verwendet werden, wird durch Vorgänge bestimmt, die an der Grenzfläche zwischen Zelle und Material stattfinden.

Nach 24-stündiger Adhärenz an den Gerüsten hatten sich die SEP1-Zellen angeheftet. Anschließend wurden Fluorochrome angewendet, um Zelltod und Proliferation über einen bestimmten Zeitraum hinweg auf den Gerüsten zu untersuchen. Die Live-Dead-Färbung zeigte eine blaue Kernfärbung sowie rote Fluoreszenz in toten Zellen und grüne Fluoreszenz in lebensfähigen Zellen.

Zusätzlich wurde die Zellviabilität auf dem Gerüst mittels des Resazurin-Umsatz-Assays quantifiziert. Über einen Zeitraum von zwei Wochen wurden Daten von Zellen gesammelt, die mit oder ohne Gerüste kultiviert wurden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die verwendeten Fluorochrome an das verfügbare Gerüst und Mikroskop anzupassen.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die immunfluoreszenzchemische Färbung angewendet werden, um das Vorhandensein von Proteinen oder die Aktivierung von Signaltransduktionswegen sichtbar zu machen. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie der Arthroplastik, da die Wechselwirkung der Zelloberfläche mit dem umgebenden Gewebe im lebenden Organismus deren Funktion und Haltbarkeit bestimmen wird.