Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, mehrere Biomarker in Liquor cerebrospinalis, also CSF, schnell und kostengünstig zu quantifizieren, um deren Eignung für die Diagnose und Therapiemonitoring zu beurteilen. Dies ist ein neuer Test, der es uns ermöglicht, Biomarker zu messen, die zuvor nicht messbar waren. Wir sind der Ansicht, dass dieser sowohl für diagnostische Zwecke als auch zur Differenzierung zwischen verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen genutzt werden kann und potenziell auch prognostische Informationen liefern könnte.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie schnell, einfach in der Probenvorbereitung, hochspezifisch und kostengünstig ist und sich daher gut für die Übertragung in das klinische Labor eignet. Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik reichen bis in die Therapie oder Diagnostik hinein, da dieser Hochdurchsatztest in zukünftigen klinischen Studien für neuartige Therapien bei Neurodegeneration eingesetzt werden kann. Diese Methodik kann außerdem auf andere Erkrankungen und Gewebe angewandt werden, beispielsweise Urin bei Nierenerkrankungen, Plasma bei Kardiomyopathie und Zellen zur Beurteilung der Pluripotenz.

Um dieses Verfahren zu beginnen, resuspendieren Sie die gewünschten synthetischen Peptide gemäß den Herstelleranweisungen auf eine Stammlösungskonzentration von einem Milligramm pro Milliliter. Bereiten Sie 1:10-Verdünnungen des Peptids aus der Stammlösung vor und geben Sie jeweils 1.000 Pikomol jedes Peptids in eine Low-Binding-Mikrozentrifugenprobe. Trocknen Sie die gesammelte Peptidprobe in einem SpeedVac-Konzentrator ein.

Speichern Sie die Probe nach Fertigstellung bei minus 20 Grad Celsius. Anschließend aliquotieren Sie 100 Mikroliter CSF in Low-Binding-Mikrozentrifugenröhrchen. Gefriertrocknen Sie die CSF-Proben.

Suspendieren Sie ein Aliquot der gepoolten Peptidprobe in Verdauungspuffer, um Konzentrationen von 10 und einem Pikomol pro Mikroliter zu erhalten. Geben Sie anschließend die gepoolte Peptidprobe in die gefriergetrockneten 100-Mikroliter-Aliquots von CSF mit Konzentrationen von null, einem, zwei, fünf, 10 und 15 Pikomolar ein. Fügen Sie dann 20 Nanogramm intaktes, nicht verwandtes Protein hinzu, um als interner Standard zu dienen und die Verdauungseffizienz von Trypsin zu kontrollieren.

Fügen Sie Puffer für die Verdauung zu den CSF-Aliquoten hinzu, um ein Endvolumen von 20 Mikrolitern zu erreichen, und wirbeln Sie die Proben. Danach verdauen Sie die Proben gemäß Standardprotokoll, indem Sie 1,5 Mikroliter Dithiothreitol hinzufügen und eine Stunde bei Raumtemperatur schütteln. Danach geben Sie drei Mikroliter Iodacetamid zu den Proben hinzu und schütteln 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Dann 165 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzufügen. 10 Mikroliter einer 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter umfassenden, für die Sequenzierung geeigneten modifizierten Trypsinlösung, die in 50 Millimolar Ammoniumbicarbonatpuffer resuspendiert wurde, zu den Proben hinzufügen. Die Proben über Nacht in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Stoppen Sie dann die Verdauung, indem Sie die Proben einfrieren. Nach dem Auftauen der CSF-Verdauungsansätze auf Eis zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 16.000 × g. Danach überführen Sie 60 Mikroliter jedes Verdauungsansatzes in ein 300-Mikroliter-Glasinsert.

Unter Verwendung eines LC-MS-Systems, ausgestattet mit einer C18-UPLC-Säule, injizieren Sie die höchste Konzentration aus dem Standardkurvenpunkt mittels eines 10-minütigen linearen Gradienten von 1 auf 40 % Acetonitril. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, öffnen Sie das resultierende Chromatogramm in der Software und notieren Sie die Retentionszeit sowie die beiden intensivsten Übergänge pro Peptid. Aktualisieren Sie anhand dieser Informationen eine zuvor erstellte Multiple-Reaction-Monitoring- oder MRM-Methode mit zeitgesteuerten Kanälen zur Peptidmessung.

Um die Empfindlichkeit aufrechtzuerhalten, stellen Sie sicher, dass jeder Kanal für mindestens einen Übergang pro Peptid mehr als acht Punkte pro Peak und eine Verweilzeit von mehr als 0,01 Sekunden aufweist. Fügen Sie Lösungsmittelverzögerungen in die MRM-Methode ein, indem Sie in den Methodenereignissen der MS-Methode Datei Lösungsmittelverzögerungen auswählen. Es ist entscheidend, den richtigen Peak in einer kurzen HPLC-Methode korrekt zuzuordnen.

Dies kann mithilfe der in die Matrix eingefügten Peptide erfolgen, die für eine Kalibrierkurve verwendet werden, wobei während der Methodenentwicklung mehrere Übergänge beobachtet werden. Abschließend muss die Datenannotation manuell überprüft werden, um die Genauigkeit sicherzustellen. Analysieren Sie jedes Peptid und dessen Verhältnis zu einem geeigneten stabilisotopenmarkierten internen Standard.

Hier ist ein Chromatogramm der signifikanten Peptidmarker aus dem Hochdurchsatz-CSF-Assay dargestellt. Die Daten liefern standardisierte Verhältnisse zum jeweiligen stabilisotopenmarkierten internen Standard, die zur Bestimmung absoluter CSF-Konzentrationen verwendet und hinsichtlich Veränderungen in klinischen Proben statistisch ausgewertet werden können. Die Quantifizierung der 74 Peptide, die in diesem CSF-Assay enthalten sind, ergab, dass 25 davon im CSF von Demenzpatienten signifikant verändert waren, und Ergebnisse für die Demenzmarker pro-Orexin und YKL-Chitinase-3-ähnliches Protein werden hier gezeigt.

ApoE4 ist ein bekannter Risikofaktor für die Alzheimer-Krankheit, und der Nachweis von ApoE-Isoformen basiert auf dem Nachweis der entsprechenden Peptide für die Aminosäureveränderungen der Isoformen E2 und E4. Hier ist das erwartete Peakmuster für jede Isoformkombination dargestellt. Sobald die Methode eingerichtet ist, kann der Test innerhalb eines Tages durchgeführt werden, sofern er ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach der Entwicklung dieser Methode war es möglich, einen neuen Satz von Biomarkern mit hoher analytischer Empfindlichkeit und Spezifität zu messen, und dies wird es Forschern ermöglichen, neurodegenerative Erkrankungen auf eine neue Weise zu bewerten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen MRM-Assay hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifität entwirft und optimiert. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit DTE, Termiten, Ameisensäure und menschlichem Gewebe äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen während dieses Verfahrens.