Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, schnell und kostengünstig mehrere Biomarker in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) zu quantifizieren, um ihren Einsatz für die Diagnose und Behandlungsüberwachung zu bewerten. Dabei handelt es sich um einen neuen Assay, der es uns ermöglicht, Biomarker zu messen, die bisher nicht messbar waren. Und wir denken, dass dies für diagnostische Zwecke und auch zur Unterscheidung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen genutzt werden kann und möglicherweise auch prognostische Informationen geben kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell, einfach in der Probenvorbereitung, hochspezifisch und kostengünstig für die Umsetzung in das klinische Labor konzipiert ist. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose, da dieser Hochdurchsatztest in zukünftigen klinischen Studien für neuartige Therapien bei Neurodegeneration eingesetzt werden kann. Diese Methode kann auch auf andere Krankheiten und Gewebe angewendet werden, wie z. B. Urin bei Nierenerkrankungen, Plasma bei Kardiomyopathie und Zellen bei Pluripotenz.

Um dieses Verfahren zu starten, resuspendieren Sie die gewünschten synthetischen Peptide gemäß den Anweisungen des Herstellers auf eine Stammkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter. Bereiten Sie eine von 10 Verdünnungen des Peptids aus der Stammkonzentration vor und poolen Sie 1.000 Picomole jedes Peptids in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung. Trocknen Sie die gepoolte Peptidprobe in einem SpeedVac-Konzentrator.

Wenn die Probe fertig ist, lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Als nächstes aliquotieren Sie 100 Mikroliter Liquor in Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung. Die Liquorproben werden gefriergetrocknet.

Resuspendieren Sie ein Aliquot der gepoolten Peptidprobe in Aufschlusspuffer, um Konzentrationen von 10 und ein Picomol pro Mikroliter zu erhalten. Stecken Sie nun die gepoolte Peptidprobe in die gefriergetrockneten 100-Mikroliter-Aliquots von Liquor bei null, eins, zwei, fünf, 10 und 15 picomolaren Konzentrationen. Fügen Sie dann 20 Nanogramm intaktes, nicht verwandtes Protein hinzu, um als interner Standard zu fungieren und die Verdauungseffizienz von Trypsin zu kontrollieren.

Geben Sie Digest-Puffer zu den Liquoraliquoten bis zu einem Endvolumen von 20 Mikrolitern und wirbeln Sie die Proben vortex. Anschließend verdauen Sie die Proben gemäß dem Standardprotokoll, indem Sie 1,5 Mikroliter Dithiothreitol hinzufügen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur schütteln. Geben Sie anschließend drei Mikroliter Jodacetamid zu den Proben und schütteln Sie sie 45 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Fügen Sie dann 165 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzu. Geben Sie 10 Mikroliter einer modifizierten Trypsinlösung von 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter in Sequenzierqualität, die in 50-Millimolar-Ammoniumbicarbonat-Puffer resuspendiert ist. Inkubieren Sie die Proben über Nacht in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Stoppen Sie dann den Aufschluss, indem Sie die Proben einfrieren. Nach dem Auftauen wird der Liquor auf Eis verdaut, 10 Minuten lang bei 16.000 g zentrifugiert. Wenn Sie fertig sind, geben Sie 60 Mikroliter jedes Aufschlusses in einen 300-Mikroliter-Glaseinsatz.

Unter Verwendung eines LC-MS-Systems, das mit einer C18-UPLC-Säule ausgestattet ist, injizieren Sie die höchste Konzentration aus dem Standardkurvenpunkt mit einem 10-minütigen linearen Gradienten von einem bis 40 % Acetonitril. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, öffnen Sie das resultierende Chromatogramm in der Software und notieren Sie sich die Retentionszeit und die beiden intensivsten Übergänge pro Peptid. Aktualisieren Sie auf der Grundlage dieser Informationen eine zuvor erstellte MRM-Methode (Multiple Reaction Monitoring) mit zeitgesteuerten Kanälen zur Messung von Peptiden.

Um die Empfindlichkeit zu erhalten, halten Sie jeden Kanal mit Punkten pro Peak größer als acht und einer Verweilzeit von mehr als 0,01 Sekunden für mindestens einen Übergang für jedes Peptid. Beziehen Sie Lösungsmittelverzögerungen in die MRM-Methode ein, indem Sie Lösungsmittelverzögerungen in Methodenereignissen in der MS-Methodendatei auswählen. Es ist entscheidend, den richtigen Peak in einer kurzen HPLC-Methode korrekt zu treffen.

Dies kann unter Verwendung der gespickten Peptide in der Matrix erfolgen, die für eine Standardkurve verwendet werden, und unter Beobachtung der multiplen Übergänge während der Methodenentwicklung. Überprüfen Sie abschließend die Datenanmerkung manuell, um die Genauigkeit sicherzustellen. Analysieren Sie jedes Peptid und jedes Verhältnis zu einem geeigneten stabilen isotopenmarkierten internen Standard.

Hier ist ein Chromatogramm der signifikanten Peptidmarker aus dem Hochdurchsatz-CSF-Assay dargestellt. Die Daten liefern standardisierte Verhältnisse zum relevanten stabilen isotopenmarkierten internen Standard, der zur Bestimmung absoluter Liquorkonzentrationen und statistisch auf Veränderungen in klinischen Proben analysiert werden kann. Die Quantifizierung der 74 Peptide, die in diesem Liquor-Assay enthalten waren, zeigte, dass 25 im Liquor von Demenzpatienten signifikant verändert waren, und die Ergebnisse der Demenzmarker Pro-Orexin und YKL-Chitinase-3-ähnliches Protein sind hier dargestellt.

ApoE4 ist ein bekannter Risikofaktor für die Alzheimer-Krankheit, und der Nachweis von ApoE-Isoformen basiert auf dem Nachweis der entsprechenden Peptide für die Aminosäureveränderungen für die Isoformen E2 und E4. Das für jede Isoformkombination erwartete Peakmuster ist hier dargestellt. Sobald die Methode eingerichtet ist, kann der Assay an einem Tag durchgeführt werden, wenn er richtig durchgeführt wird. Nach der Entwicklung dieser Methode war es möglich, einen neuen Satz von Biomarkern mit hoher analytischer Sensitivität und Spezifität zu messen, was es den Forschern ermöglichen wird, neurodegenerative Erkrankungen auf eine neue Art und Weise zu beurteilen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen MRM-Assay im Hinblick auf Sensitivität und Spezifität entwerfen und optimieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DTE, Termiten, Ameisensäure und menschlichem Gewebe äußerst gefährlich sein kann und während dieses Eingriffs Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.