Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Antikörper mit fluoreszenten Farbstoffen aus gereinigten Proben oder direkt aus Zellkulturmedium mithilfe magnetischer Protein-A- oder Protein-G-Kügelchen zu markieren. Diese Methode kann verwendet werden, um die Markierungschemie auch geringer Mengen von Antikörpern im Zellkulturmedium zu optimieren. Dies führt zu einer besseren Anwendung der Antikörper in nachgeschalteten Verfahren.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass die Antikörper keine Reinigung erfordern, Amin- oder Thiolchemie verwendet werden kann und die Methode automatisiert oder manuell durchgeführt werden kann. Beginnen Sie damit, die Kügelchen durch vorsichtiges Schütteln gleichmäßig erneut aufzuschwemmen. Geben Sie anschließend 50 µL der Kügelchen in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.

Danach den Probengefäß in einen Magnethalter stellen. Nach 10 Sekunden vorsichtig den Lagerungspuffer durch 250 Mikroliter Antikörper-Bindungspuffer ersetzen und die Kügelchen gut mischen. Nach weiteren 10 Sekunden den Bindungspuffer vorsichtig durch ein Milliliter des gewünschten Antikörpers ersetzen.

Und mischen Sie die Probe 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation bringen Sie die Röhrchen erneut auf das Magnetgestell und entfernen Sie das Überstand, sobald sich die Perlen an den Seiten des Röhrchens abgelagert haben. Anschließend waschen Sie das Gemisch aus Perlen und Antikörper durch zwei 10-sekündige Waschschritte mit jeweils 250 Mikrolitern Antikörper-Bindungspuffer.

Um die Antikörper mittels Aminchemie zu markieren, ersetzen Sie nach der zweiten Waschung den Waschpuffer durch 100 µL Amin-Konjugationspuffer und geben 2,5 µL frisch zubereiteter aminreaktiver Farbstofflösung pro 100 µg Antikörper hinzu. Vortexen Sie die Probe 60 Minuten bei Raumtemperatur, um die Perlen während der Markierung in Suspension zu halten. Danach stellen Sie das Gefäß erneut auf den Magneten für 10 Sekunden und entfernen den Überstand.

Die Kügelchen zwei Mal mit dem Puffer zum Binden des Antikörpers waschen, wie gerade gezeigt. Dann den Waschpuffer durch 50 Mikroliter Elutionspuffer ersetzen und die Kügelchen fünf Minuten lang mischen. Das Röhrchen erneut 10 Sekunden lang auf den Magneten stellen und den eluierten Antikörper in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen, das fünf Mikroliter Neutralisierungspuffer enthält.

Eluieren Sie den Antikörper ein weiteres Mal, wie gerade gezeigt, und sammeln Sie die eluierten Proben. Anschließend messen Sie die Absorption des Antikörper-Farbstoff-Konjugats bei 280 Nanometern sowie bei der Lambda max des Farbstoffs. Um die Antikörper mittels Thiolchemie zu markieren, ersetzen Sie nach der zweiten Waschung den Waschpuffer durch 250 Mikroliter Thiol-Konjugationspuffer und mischen die Kügelchen vorsichtig durch Pipettieren.

Nach 10 Sekunden waschen Sie die Kügelchen zwei Mal mit Antikörper-Bindungsspülpuffer. Anschließend ersetzen Sie den Spülpuffer durch 100 Mikroliter Thiol-Konjugationspuffer und geben DTT bis zu einer Endkonzentration von 2,5 Millimolar hinzu. Mischen Sie die Kügelchen weitere 60 Minuten.

Danach die Kügelchen erneut auf dem Magneten für 10 Sekunden abstellen und den Puffer verwerfen. Anschließend 250 µL Thiol-Konjugationspuffer unter vorsichtiger Mischung zu den Kügelchen geben. Nach 10 Sekunden die Kügelchen zwei Mal mit Antikörper-Bindungsspülpuffer waschen und den zweiten Waschschritt durch 100 µL frischen Thiol-Konjugationspuffer ersetzen.

Fügen Sie nun 2,5 µL frisch zubereitete thiolreaktive Farbstofflösung pro 100 µg Antikörper hinzu und mischen die Kügelchen 60 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation stellen Sie das Röhrchen erneut für 10 Sekunden auf den Magneten. Ersetzen Sie dann den Überstand durch 250 µL frisches Thiol-Konjugationspuffer unter vorsichtigem Mischen.

Nach 10 Sekunden waschen Sie die Perlen zwei Mal. Ersetzen Sie dann den Waschpuffer durch 50 Mikroliter Elutionspuffer und eluieren Sie den konjugierten Antikörper zwei Mal, wie gerade gezeigt. Anschließend messen Sie die Absorption des Antikörper-Farbstoff-Konjugats bei 280 Nanometern sowie bei der Lambda max für den Farbstoff.

Die starke Affinität zwischen den Antikörpern und Protein G, die robuste Affinität des Magneten zu den Kügelchen sowie die Optimierung der Methode vor der Kügelchenreinigung führen gemeinsam zu einem vernachlässigbaren Verlust an Antikörpern während der Markierungsreaktion, wie durch die effiziente Rückgewinnung von drei verschiedenen mausischen Antikörperisotypen nach fluoreszenter Doppelmarkierung im Vergleich zur einfachen Reinigung belegt wird. Diese Rückgewinnung zeigt sich ebenfalls in Coomassie-Gelelektrophorese, wo die geringen unspezifischen Bindungseigenschaften der magnetischen Protein-G-Kügelchen zu hochreinen, fluoreszent doppelt markierten schweren und leichten Ketten führen. Die Markierung an Kügelchen mit magnetischen Protein-A-Kügelchen ist ebenfalls mit mehreren fluoreszenten Farbstoffen kompatibel und führt zu hoher Rückgewinnung und guten Farbstoff-zu-Antikörper-Verhältnissen.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Dadurch ist es möglich, mehrere Proben manuell oder mithilfe einer automatisierten Plattform mit verbesserter Durchsatzleistung zu bearbeiten. Während des Verfahrens ist es wichtig, stets darauf zu achten, dass die magnetischen Partikel in Suspension bleiben.

Wählen Sie das geeignete Volumen an magnetischen Kügelchen für die Probe aus und optimieren Sie die Menge des fluoreszierenden Farbstoffs für den gewünschten Antikörper. Nach Durchführung dieses Verfahrens sollten die markierten Antikörper mithilfe relevanter biologischer Tests wie ELISA, FACS oder zellbasierten Assays auf ihre Funktionalität überprüft werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gereinigte und ungereinigte Antikörper mit fluoreszenten Markern oder anderen kleinen Molekülen wie Biotin oder zytotoxischen Wirkstoffen unter Verwendung magnetischer Protein A- oder G-Perlen markiert.