Name: Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Lernen Sie einen modifizierten Lackmus-Test zur schnellen Detektion von E. coli mittels RNA-spaltender DNAzym und Urease-basierter Signaltransduktion. Diese einfache Methode ermöglicht eine sichtbare Farbänderung für Point-of-Care-Anwendungen.

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Die Finanzierung für dieses Forschungsprojekt wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) über einen Discovery Grant an YL bereitgestellt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Übersetzung von der Wirkung der RNA - Spaltungsaktivität eines Bakteriums-responsive DNAzyme zu einer Lackmus - Test wird möglich gemacht durch die Verwendung von Urease und magnetische Trennung, wie 1 durch veranschaulicht ist . Obwohl der Nachweis des modifizierten Lackmus - Test für Bakteriendetektion mit einem E. getan coli -abhängigen RNA-Spaltung DNAzyme, 5,19,20 das Design im Allgemeinen für jede RNA-Spaltung DNAzyme erweitert werden kann. Angesic...

Bakterielle Krankheitserreger sind eine der Hauptursachen für weltweite Morbidität und Mortalität. Ausbrüche von Krankenhausinfektionen, durch Lebensmittel übertragene Krankheitserreger und bakterielle Schadstoffe in der Umwelt stellen eine ernsthafte und anhaltende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit und Sicherheit dar. Um diese Ausbrüche zu verhindern, sind wirksame Instrumente erforderlich, die einen rechtzeitigen Nachweis von Krankheitserregern unter einer Vielzahl von Bedingungen ermöglichen. Einfache, aber dennoch effektive Tests, die tragbar und kostengünstig sind, sind sehr begehrt, insbesondere in Regionen, die anfällig für Ausbrüche sind, sich aber keine teuren Testeinrichtungen leisten können. 1-3 Obwohl es eine Vielzahl von Methoden zum Nachweis von Bakterien gibt, eignen sich viele von ihnen nicht als Screening- oder Vor-Ort-Testwerkzeuge, da sie lange Testzeiten, teure Instrumente und komplizierte Testverfahren erfordern. 
Kolorimetrische Tests sind besonders attraktiv für Point-of-Care- oder Feldanwendungen, da Farbveränderungen mit bloßem Auge leicht erkannt werden können. Der Lackmustest für den pH-Wert ist einfach, schnell und effektiv. Obwohl es sich um eine sehr alte Technologie handelt, ist sie aufgrund ihrer Einfachheit und Wirksamkeit auch heute noch weit verbreitet. Überraschenderweise war dieser einfache Test noch nie modifiziert worden, um den Nachweis anderer Analyten zu erreichen, bevor wir kürzlich einen Ansatz entwickelt haben, diesen Test für E. coli-Tests zu modifizieren. 4
Der erweiterte Lackmustest für E. coli verwendet drei zusätzliche Komponenten: ein E. coli-aktiviertes RNA-spaltendes DNAzym (EC1), 5 Urease und magnetische Kügelchen. DNAzyme beziehen sich auf synthetische einzelsträngige DNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität. 6 Sie können mittels In-vitro-Selektion aus DNA-Pools mit Zufallssequenz isoliert werden. 7,8 Sie sind sehr stabil und können durch hocheffiziente automatisierte DNA-Synthese kostengünstig hergestellt werden. 9 Aus diesen Gründen wurden DNAzyme, insbesondere RNA-spaltende DNAzyme, umfassend für Biosensorik-Anwendungen untersucht. 6,10,11 RNA-spaltende DNAzyme-Sensoren wurden entwickelt, um Metallionen,12-16 kleine Moleküle,17,18 bakterielle Krankheitserreger5,19-21 und Krebszellen zu detektieren. 22 Angesichts der großen Verfügbarkeit von zielinduzierten RNA-spaltenden DNAzymen kann jeder Assay, der ein DNAzym verwendet, potenziell erweitert werden, um eine Vielzahl von Analyten zu detektieren.
Urease wird aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, Harnstoff zu Ammoniak zu hydrolysieren,23,24, was zu einer Erhöhung des pH-Werts führt. Urease ist außerdem hocheffizient, stabil und für die Konjugation mit anderen Biomolekülen geeignet. Daher postulierten wir, dass ein Konjugat eines RNA-Spaltungs-DNAzyms mit Urease die Verwendung von Lackmustests zum Nachweis anderer Ziele ermöglichen würde. 5
Die Wirkung des RNA-spaltenden DNAzyms wird auf eine Urease-vermittelte Erhöhung des pH-Werts durch die Verwendung von magnetischen Kügelchen übertragen, die mit dem DNAzyme-Urease-Konjugat immobilisiert sind. Da die Aktivität des untersuchten DNAzyms streng von E. coli abhängt, führt das Vorhandensein dieses Bakteriums in der Testlösung zur Freisetzung von Urease aus den magnetischen Kügelchen an die Lösung, die dann entnommen und zur Hydrolyse von Harnstoff in einer Reporterlösung verwendet wird, die einen pH-empfindlichen Farbstoff enthält. Das Endergebnis dieses Verfahrens ist eine Farbveränderung, die bequem durch den Farbstoff oder das pH-Papier gemeldet werden kann.

<table><tbody><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH) Pellets</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamid / Bisacrylamid (29:1) Lösung</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Bioshop Kanada Inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol blau</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xylolcyanol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% Natriumdodecylsulfat</td><td>Bioshop Canada Inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Bioshop Canada Inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (II)-hexahydrat</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin-Triphospahte (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ethanol Kommerzielle Alkohole</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylenethylendiamin (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0,04% Phenolrot</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 Polynukleotidkinase Reaktionspuffer</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA-Ligase-Reaktionspuffer</td><td>Bio Basics Kanada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase (5 U/&#956; l)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Bouillon</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase (10 U/&#956; l)</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Glasplatten</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>0,75 mm dicke Abstandhalter</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Kamm</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>UV-Lampe</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metallplatte</td><td>CBS wissenschaftlich</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophoresegerät</td><td>CBS wissenschaftlich</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO Zentrifugalfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Kugel (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Magnetisches Trenngestell</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofuge-Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter (0,22 &#956; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Kulturröhrchen</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultraschallreiniger</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kamera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Röhrchen</td><td>VWR Deutschland</td><td>Tel.: 89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

kolorimetrischen nachweis von bakterien mit lackmus-test

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Es gibt eine steigende Nachfrage nach einfachen, aber dennoch effektiven Methoden, die zum Nachweis spezifischer Krankheitserreger für Point-of-Care- oder Feldanwendungen verwendet werden können. Solche Methoden müssen benutzerfreundlich sein und zuverlässige Ergebnisse liefern, die sowohl von Fachleuten als auch von Laien leicht interpretiert werden können. Der Lackmustest für den pH-Wert ist einfach, schnell und effektiv, da er den pH-Wert einer Testprobe über eine einfache Farbänderung anzeigt. Wir haben einen Ansatz entwickelt, um den Lackmustest für den Bakteriennachweis zu nutzen. Die Methode nutzt ein bakteriumspezifisches RNA-spaltendes DNAzym, um zwei Funktionen zu erreichen: die Erkennung eines interessierenden Bakteriums und die Bereitstellung eines Mechanismus zur Steuerung der Urease-Aktivität. Durch die Verwendung von magnetischen Kügelchen, die mit einem DNAzym-Urease-Konjugat immobilisiert sind, wird das Vorhandensein von Bakterien in einer Testprobe auf die Freisetzung von Urease aus den Kügelchen in die Lösung übertragen. Die freigesetzte Urease wird in eine Testlösung überführt, um Harnstoff zu Ammoniak zu hydrolysieren, was zu einer Erhöhung des pH-Werts führt, die mit dem klassischen Lackmustest sichtbar gemacht werden kann.

Das Prinzip des bakteriellen Lackmus - Test ist in Abbildung 1 erläutert Der Test verwendet drei Schlüsselmaterialien. Ein RNA - spaltender DNAzyme die von einem bestimmten Bakterium, Urease und magnetische Kügelchen aktiviert. Die DNAzyme wird als molekulares Erkennungselement verwendet hochspezifischen Nachweis eines Bakteriums von Interesse zu erreichen. Urease und magnetische Kügelchen verwendet werden Signaltransduktion der RNA-Spaltungsaktivität der DNAzyme zu erre...

Wir beschreiben ein Protokoll zum kolorimetrischen Nachweis von E. coli unter Verwendung eines modifizierten Lackmustests, der ein RNA-spaltendes DNAzym, Urease und magnetische Beads nutzt.

Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, einen einfachen, modifizierten Lackmustest zur bakteriellen Detektion zu demonstrieren. Diese Methode beschreibt, wie eine durch E.coli aktivierte RNA-spaltende DNA-Enzym mit einer auf Urease basierenden Signaltransduktionsplattform gekoppelt werden kann, um eine Farbänderung als Reaktion auf E.coli zu erzeugen. Die beiden Hauptvorteile dieser Technik sind die Einfachheit des Tests und ihre Anwendbarkeit auf andere analytenempfindliche RNA-spaltende DNA-Enzyme.Den Versuch werden Seperh Manchehry und Dingran Chang, Doktoranden aus dem Labor von Dr. Yingfu Li an der McMaster University, demonstrieren. Nachdem die Reagenzien und Puffer gemäß dem schriftlichen Protokoll vorbereitet wurden, stellen Sie eine Stammlösung von Succinimidyl-4-cyclohexan-1-carboxylat, oder SMCC, her, indem Sie ein Milligramm SMCC in 676 Mikrolitern DMSO auflösen. Vortexen Sie die Lösung und stellen Sie sie anschließend bis zur Verwendung auf Eis.Lösen Sie ein Milligramm Urease in einem Milliliter 1x PBS und stellen Sie dies bis zur Verwendung auf Eis. Um Urease-DNA (UrDNA) herzustellen, geben Sie 10 Mikroliter einer 100-Mikromolar-Lösung von LD1 in ein 2,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie anschließend 140 Mikroliter zweifach destilliertes Wasser und 40 Mikroliter 10x PBS hinzu und wirbeln Sie die Mischung kurz im Vortex. Fügen Sie anschließend 80,5 µL SMCC-Standardlösung und 159,5 µL DMSO hinzu. Vortexen Sie erneut und zentrifugieren Sie kurzzeitig mit einem Tischzentrifugen. Inkubieren Sie die Reaktion 60 Minuten lang bei 37 °C in einem Inkubator oder einem Wärmesblock.Nach der Inkubation 200 Mikroliter 1x PBS, 60 Mikroliter dreimolarer Natriumacetat und 1,5 Milliliter kalten 100 %igen Ethanol in das Gefäß geben. Durch Vortexen mischen und die Reaktion 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius inkubieren. Die Lösung bei 20.000 × g und 4 Grad Celsius 20 Minuten lang zentrifugieren.Entfernen Sie anschließend den Überstand und trocknen Sie das Pellet im Vakuum. Geben Sie zum getrockneten Pellet 400 Mikroliter Harnstoffase-Stammlösung hinzu und inkubieren Sie fünf Stunden bei Raumtemperatur. Überführen Sie 200 Mikroliter der rohen Konjugatlösung in eine vorher gewaschene Zentrifugalfilterkolonne mit einer Molekulargewichts-Cutoff-Grenze von 100.000.Zentrifugieren Sie die Säule bei 14.000 × g für fünf Minuten. Übertragen Sie die verbleibenden 200 µL des rohen Konjugats auf die Säule und zentrifugieren Sie erneut bei 14.000 × g für fünf Minuten. Entfernen Sie anschließend die Säule und stellen Sie sie verkehrt herum in ein neues 2-mL-Mikrozentrifugen-Sammelröhrchen.Zentrifugieren Sie die umgedrehte Säule und den Behälter bei 1.000 × g für zwei Minuten. Nach dem Entfernen des Sammelrohrs 30 µL 1x PBS zur Waschung der Membran hinzufügen, um eine zusätzliche Rückgewinnung der Konjugate zu ermöglichen. Die Säule erneut umdrehen und zurück in das Sammelrohr stellen.Zentrifugieren Sie die Säule bei 1.000 × g für zwei Minuten. Entfernen und entsorgen Sie die Säule. Lagern Sie die UrDNA bei vier Grad Celsius bis zur Verwendung. Um einen E.coli-aktivierten, RNA-spaltenden DNAzymen, oder EC1, und UrDNA an magnetische Kügelchen zu binden, mischen Sie die Lagerlösung der magnetischen Kügelchen gut durch und übertragen 100 µL der Kügelchensuspension in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie dann das Röhrchen in einen Magnetständer, um die Kügelchen zu isolieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und geben Sie 150 µL Bindungspuffer, oder BB, hinzu. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Halter und klopfen Sie vorsichtig darauf, um die Perlen in eine homogene Lösung zurückzususpendieren. Nachdem Sie die BB-Wäsche insgesamt dreimal mit den suspendierten Perlen durchgeführt haben, geben Sie 10 Mikroliter einer 10-Mikromolar-EC1-Lösung hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Antippen des Röhrchens.Die Lösung unter leichtem Schütteln 30 Minuten lang inkubieren. Um eine Aggregation der Kügelchen zu vermeiden, alle zwei bis drei Minuten leicht auf das Röhrchen klopfen. Danach das Mikrozentrifugenröhrchen erneut auf den Magnetrack stellen, um die Kügelchen zu isolieren, und den Überstand mit einer Pipette abnehmen.Danach die Kügelchen dreimal mit jeweils 150 Mikrolitern BB waschen. Nach Abschluss der Waschschritte die Kügelchen in insgesamt 150 Mikrolitern BB suspendieren. Zu dieser Lösung 15 Mikroliter UrDNA hinzufügen und die Probe zwei Minuten lang bei 45 Grad Celsius erhitzen, anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen und zwei Stunden inkubieren. Das Mikrozentrifugenröhrchen erneut auf den Magnetrack stellen, um die Kügelchen zu isolieren, und den Überstand mit einer Pipette abziehen.Gebe 100 µL Reaktionspuffer, oder RB, hinzu, dann entferne das Röhrchen vom Magnetrack und resuspendiere die Perlen vorsichtig. Nachdem die E. coli-Zellen gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, spüle ein 1,5-mL-Microfuge-Röhrchen vor, indem du 100 µL RB hinzufügst und vortexst. Danach entsorge den Puffer. Füge 15 µL des zusammengesetzten EC1 dem gewaschenen Röhrchen hinzu, stelle das Röhrchen dann auf den Magnetrack und aspirations die Überstände.Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Gestell, geben Sie 100 Mikroliter RB hinzu und resuspendieren Sie die magnetischen Partikel vorsichtig. Nachdem Sie die Partikel noch zweimal mit RB gewaschen und das RB entfernt haben, fügen Sie 10 Mikroliter der E.coli-Probe zum Röhrchen hinzu und mischen den Inhalt vorsichtig durch leichtes Antippen des Röhrchens. Inkubieren Sie danach die Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur.Nach der Inkubation 90 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzufügen und das Gefäß auf den Magnetrack stellen. Nach etwa drei Minuten magnetischer Trennung vorsichtig 85 Mikroliter des Überstandes in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Es ist äußerst wichtig, die Lösung vorsichtig mit der Pipette zu handhaben, wobei keiner der magnetischen Kügelchen mitaufgenommen werden darf.Diese Kügelchen enthalten Harnstoffabbauendes Enzym (Urease) und erzeugen ein falsch-positives Signal. Geben Sie 15 µL 0,04 % Phenolrot und 100 µL Substratlösung hinzu. Nehmen Sie anschließend Aufnahmen in bestimmten Zeitabständen vor, um die Farbänderung zu dokumentieren.Die Ausgangsfarbe des Lackmustests muss gelb sein, was einen Lösungs-pH-Wert unter 5,5 widerspiegelt. Gegebenenfalls kann der Ausgangs-pH-Wert des Lackmustests mit einem schwachen Puffer angepasst werden, beispielsweise mit einem einmillimolaren Natriumacetat-Puffer bei pH 5. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse des bakteriellen Lackmustests, bei dem der von E.coli-aktivierter RNA-spaltender DNAzyme EC1 als DNAzyme und Phenolrot als pH-Indikator verwendet wurde.Wie der fehlende Farbumschlag in Abwesenheit von E.coli zeigt, ist EC1 hochspezifisch und weist minimale Aktivität gegenüber anderen Bakterien auf. Die Intensität des Farbumschlags hängt sowohl von der Anzahl der E.coli-Zellen ab, die im Aktivierungsschritt des DNAzyms verwendet werden, als auch von der für die Harnstoffhydrolyse zur Verfügung stehenden Zeit. Eine größere Anzahl an E.coli-Zellen führt zu einem stärkeren Farbumschlag, und eine längere Reaktionszeit für die Harnstoffhydrolyse ermöglicht den Nachweis einer geringeren Zellanzahl.Dieses Diagramm zeigt die pH-Änderung, die mithilfe eines handelsüblichen pH-Messgeräts überwacht wurde. Das Vorhandensein von 10 hoch 7 E.coli-Zellen führte innerhalb von 10 Minuten zu einer allmählichen Erhöhung des pH-Werts um drei Einheiten. Im Gegensatz dazu verursachte das Fehlen von E.coli unter denselben Bedingungen keine nachweisbaren pH-Änderungen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass Urease sehr aktiv ist und eine unzureichende Wäsche oder Kontamination zu einem falsch positiven Ergebnis führen kann. Nach diesem Verfahren kann diese Methode angewendet werden, um E. coli unter relevanteren Bedingungen zu testen, beispielsweise bei der Untersuchung der Qualität von Umwasser.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie ein einfacher Lackmus-Test für die E.coli-Prüfung genutzt werden kann. Vergessen Sie nicht, dass dieser Test zur Detektion pathogener E.coli eingesetzt werden kann, was äußerst gefährlich ist. Sie müssen eine Schulung zur Biosicherheit absolvieren, bevor Sie irgendwelche Tests mit pathogenen Bakterien durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine einfache Methode zur Identifizierung der prioritären bakteriellen Erregern ist gentechnisch Reporter Phagen verwenden. Diese Reporter-Phagen, die spezifisch für ihre besonderen Wirtsarten sind, sind in der Lage schnell Transduktion eines Biolumineszenz-Signal Antwort auf Wirtszellen. Hier beschreiben wir die Verwendung von Reporter Phagen für den Nachweis...

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Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

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Kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung von Laktat in Testproben

Dieses Video demonstriert eine kolorimetrische E. coli-Nachweismethode, bei der ein E. coli-Biomarker ein DNAzym aktiviert, was zur Spaltung der RNA-Bindung und zur Ablösung eines DNAzym-Urease-Konjugats führt. Ein anschließender kolorimetrischer Assay weist den E. coli-Biomarker durch ammoniakinduzierte pH-Änderungen nach.

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Dieses Video demonstriert den quantitativen Multiplex-Bakteriennachweis mit carboxylierten magnetischen Polystyrol-Mikrosphären, die in unterschiedliche Sätze eingefärbt sind. Das Verfahren umfasst die Bildung von Kügelchen-Bakterien-Komplexen, die magnetische Trennung und die flussbasierte Analyse, die eine präzise und gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Bakterien in derselben Reaktionsvertiefung ermöglicht.

Quantitativer Multiplex-Bakteriennachweis mit Farbstoff-markierten magnetischen Mikrosphären

Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren.

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Anders als bei Eukaryonten zu sehen, gibt es nur wenig Untersuchungen, die detailliert Membrandepolarisation und Ionenkonzentrationsänderungen in Bakterien, in erster Linie ihrer geringen Größe macht herkömmliche Messverfahren schwierig. Hier haben wir ausführlich Protokolle zur Überwachung solcher Veranstaltungen in der deutlichen Gram-positive Erreger Streptococcus pneumoniae Verwendung Fluoreszenztechniken.

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Ein Protokoll, das die integrierte Konzentration, Anreicherung und den kolorimetrischen Endpunktnachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern in großen Mengen landwirtschaftlichen Wassers beinhaltet, wird hier vorgestellt.  Das Wasser wird durch modifizierte Moore-Tupfer (MMS) gefiltert, die mit selektiven oder nicht-selektiven Medien angereichert sind, und der Nachweis erfolgt mit papierbasierten Analysegeräten (μPAD), die in bakterienindizierte kolorimetrische Substrate eingebettet...

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Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion vor. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfacher auszuwerten und genauer ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert.

Visualisierung der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion

Lernen Sie einen modifizierten Lackmus-Test zur schnellen Detektion von E. coli mittels RNA-spaltender DNAzym und Urease-basierter Signaltransduktion. Diese einfache Methode ermöglicht eine sichtbare Farbänderung für Point-of-Care-Anwendungen.

Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

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