Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test
17. September 2016
Wir beschreiben ein Protokoll zum kolorimetrischen Nachweis von E. coli unter Verwendung eines modifizierten Lackmustests, der ein RNA-spaltendes DNAzym, Urease und magnetische Beads nutzt.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, einen einfachen modifizierten Lackmustest für den Bakteriennachweis zu demonstrieren. Diese Methode beschreibt, wie ein E.coli-aktiviertes RNA-spaltendes DNA-Enzym mit einer Urease-basierten Signalübertragungsplattform gekoppelt werden kann, um eine Farbänderung als Reaktion auf E.coli zu erzeugen. Die beiden Hauptvorteile dieser Technik sind die Einfachheit des Tests und seine Anwendbarkeit auf andere analyt-responsive RNA-spaltende DNA-Enzyme.
Seperh Manchehry und Dingran Chang, Doktoranden aus dem Labor von Dr. Yingfu Li an der McMaster University, werden das Verfahren vorführen. Nach der Herstellung von Reagenzien und Puffern gemäß dem Textprotokoll wird eine Stammlösung aus Succinimidyl-4-cyclohexan-1-carboxylat oder SMCC hergestellt, indem ein Milligramm SMCC in 676 Mikrolitern DMSO gelöst wird. Vortexen und bis zur Verwendung auf Eis legen.
Lösen Sie ein Milligramm Urease in Milliliter 1x PBS auf und legen Sie dieses bis zur Verwendung ebenfalls auf Eis. Um Urease-DNA oder UrDNA zu synthetisieren, geben Sie 10 Mikroliter 100 mikromolare LD1 in ein 2,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Fügen Sie dann 140 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser und 40 Mikroliter 10x PBS hinzu und wirbeln Sie es vortexen.
Fügen Sie als Nächstes 80,5 Mikroliter SMCC-Aktien und 159,5 Mikroliter DMSO hinzu. Dann erneut wirbeln und mit einer Tischzentrifuge kurz drehen. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator oder einem Heizblock für 60 Minuten.
Nach der Inkubation geben Sie 200 Mikroliter 1x PBS, 60 Mikroliter dreimolares Natriumacetat und 1,5 Milliliter kaltes 100%iges Ethanol in das Röhrchen. Mischen Sie durch Vortexen und inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 20.000 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Entfernen Sie dann den Überstand und trocknen Sie das Pellet unter Vakuum. Zu dem getrockneten Pellet 400 Mikroliter Ureasebrühe geben und 5 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie 200 Mikroliter Rohkonjugat auf eine vorgewaschene Zentrifugalfiltersäule mit einem Cutoff-Gehalt von 100.000 Molekulargewichten.
Die Säule wird fünf Minuten lang bei 14.000 g zentrifugiert. Die restlichen 200 Mikroliter Rohkonjugat werden in die Säule gegeben und fünf Minuten lang bei 14.000 g zentrifugiert. Entfernen Sie dann die Säule und legen Sie sie kopfüber in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrofugensammelröhrchen.
Die umgedrehte Säule und das Röhrchen werden zwei Minuten lang bei 1.000 g zentrifugiert. Nachdem Sie das Sammelröhrchen entfernt haben, geben Sie 30 Mikroliter 1x PBS in die Zentrifugalsäule, um die Membran für eine zusätzliche Rückgewinnung von Konjugaten zu waschen. Drehen Sie die Säule wieder um und setzen Sie sie wieder in das Auffangrohr ein.
Die Säule wird zwei Minuten lang bei 1.000 g zentrifugiert. Entfernen und entsorgen Sie die Säule. Lagern Sie die UrDNA bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius.
Um ein E.coli-aktiviertes RNA-spaltendes DNAzym oder EC1 und UrDNA auf magnetischen Beads zu montieren, mischen Sie das magnetische Beadsmaterial gut und geben Sie 100 Mikroliter Bead-Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Legen Sie dann das Rohr auf einen magnetischen Halterung, um die Perlen zu isolieren. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und geben Sie 150 Mikroliter Bindungspuffer oder BB in das Röhrchen.
Nehmen Sie das Röhrchen aus der Halterung und klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um die Kügelchen wieder in eine homogene Lösung zu suspendieren. Nachdem Sie die BB-Wäsche noch zwei weitere Male mit den Kügelchen in Suspension mit BB wiederholt haben, fügen Sie 10 Mikroliter 10 mikromolare EC1 hinzu. Vorsichtig mischen, indem Sie auf die Tube klopfen.
Inkubieren Sie die Lösung unter leichtem Schütteln 30 Minuten lang. Um eine Aggregation der Kügelchen zu vermeiden, klopfen Sie alle zwei bis drei Minuten auf die Tube. Setzen Sie dann das Mikrofuge-Röhrchen wieder auf das Magnetgestell, um die Kügelchen zu isolieren und den Überstand durch Pipettieren zu entfernen.
Verwenden Sie dann 150 Mikroliter BB, um die Kügelchen dreimal zu waschen. Sobald der Waschvorgang abgeschlossen ist, suspendieren Sie die Kügelchen in insgesamt 150 Mikrolitern BB.To dieser Lösung, fügen Sie 15 Mikroliter UrDNA hinzu und erhitzen Sie die Probe zwei Minuten lang auf 45 Grad Celsius, kühlen Sie die Lösung dann auf Raumtemperatur ab und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang. Setzen Sie das Mikrofuge-Röhrchen wieder auf das Magnetgestell, um die Kügelchen zu isolieren und den Überstand durch Pipettieren zu entfernen.
Fügen Sie 100 Mikroliter Reaktionspuffer oder RB hinzu, nehmen Sie dann das Röhrchen aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie die Kügelchen vorsichtig wieder. Nach der Vorbereitung der E.coli-Zellen gemäß dem Textprotokoll wird ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen vorgewaschen, indem 100 Mikroliter RB hinzugefügt und vortexiert werden. Verwerfen Sie dann den Puffer. Geben Sie 15 Mikroliter zusammengesetztes EC1 in das gewaschene Röhrchen, legen Sie das Röhrchen auf das Magnetgestell und saugen Sie den Überstand an.
Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Gestell, fügen Sie 100 Mikroliter RB hinzu und hängen Sie die magnetischen Kügelchen vorsichtig wieder auf. Nachdem Sie die Kügelchen noch zwei weitere Male mit RB gewaschen und den RB entfernt haben, geben Sie 10 Mikroliter der E.coli-Probe in das Röhrchen und mischen Sie den Inhalt vorsichtig, indem Sie auf das Röhrchen klopfen. Inkubieren Sie die Reaktion dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur.
Fügen Sie nach der Inkubation 90 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzu und stellen Sie das Röhrchen auf das Magnetgestell. Nach etwa drei Minuten magnetischer Trennung werden vorsichtig 85 Mikroliter des Überstands in ein 0,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen überführt. Es ist sehr wichtig, die Lösung vorsichtig zu pipettieren, ohne die magnetischen Kügelchen aufzunehmen.
Diese Kügelchen sind mit Urease beladen und erzeugen ein falsch positives Signal. Fügen Sie 15 Mikroliter 0,04 % Phenolrot und 100 Mikroliter Substratlösung hinzu. Nehmen Sie dann in bestimmten Zeitintervallen Fotos auf, um eine Farbänderung aufzuzeichnen.
Die Ausgangsfarbe des Lackmustests muss gelb sein und einen pH-Wert der Lösung unter 5,5 widerspiegeln. Falls erforderlich, kann der Ausgangs-pH-Wert des Lackmustests mit einem schwachen Puffer eingestellt werden, z. B. mit einem millimolaren Natriumacetat-Puffer bei pH fünf. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse des bakteriellen Lackmustests, bei dem E.coli-aktiviertes RNA-spaltendes DNAzyme EC1 als DNAzym und Phenolrot als pH-Indikator verwendet wurde.
Wie die fehlende Farbänderung in Abwesenheit von E.coli zeigt, ist EC1 hochspezifisch und zeigt eine minimale Aktivität gegenüber anderen Bakterien. Die Tiefe der Farbänderung hängt sowohl von der Anzahl der E.coli-Zellen ab, die im DNAzym-Aktivierungsschritt verwendet werden, als auch von der Zeit, die für den Harnstoffhydrolyseschritt zur Verfügung steht. Mehr E.coli-Zellen führen zu einer stärkeren Farbveränderung, und eine längere Zeit für die Harnstoffhydrolyse ermöglicht den Nachweis einer geringeren Anzahl von Zellen.
Dieses Diagramm zeigt die pH-Änderung, die mit einem tragbaren pH-Messgerät überwacht wurde. Das Vorhandensein von 10 bis sieben E.coli-Zellen führte zu einem allmählichen Anstieg des pH-Werts um drei Einheiten innerhalb von 10 Minuten. Im Gegensatz dazu verursachte das Fehlen von E.coli unter den gleichen Bedingungen keine nachweisbaren pH-Veränderungen.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Urease sehr aktiv ist und schlechtes Waschen oder Kontamination zu einem falsch positiven Ergebnis führt. Nach diesem Verfahren kann diese Methode durchgeführt werden, um unter relevanteren Bedingungen, wie z. B. bei der Prüfung der Wasserqualität in der Umgebung, auf E.coli zu testen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen einfachen Lackmustest für E.coli-Tests nutzen können. Vergessen Sie nicht, dass dieser Test zum Nachweis von pathogenen E.coli verwendet werden kann, die äußerst gefährlich sind. Sie müssen eine Biosicherheitsschulung absolvieren, bevor Sie einen der Tests auf pathogene Bakterien durchführen können.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt einen einfachen, modifizierten Lackmustest zur Detektion von E. coli-Bakterien vor. Die Methode nutzt einen auf E. coli spezifischen, RNA-spaltenden DNAzymen in Verbindung mit einer auf Urease basierenden Signaltransduktionsplattform, um bei Vorhandensein des Zielbakteriums eine sichtbare Farbänderung zu erzeugen. Der Ansatz ist benutzerfreundlich, schnell und für Point-of-Care- oder Feldanwendungen anpassbar konzipiert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Molekulare Diagnostik
- Mikrobiologie
- Bettseitentestung
Hintergrund
- Es besteht ein wachsender Bedarf an einfachen und effektiven Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern, die für Laien und den Einsatz vor Ort geeignet sind.
- Herkömmliche Lackmuspapiere liefern eine unkomplizierte kolorimetrische Anzeige von pH-Änderungen.
- RNA-spaltende DNAzyme können so konstruiert werden, dass sie eine hohe Spezifität gegenüber bestimmten bakteriellen Zielstrukturen aufweisen.
- Urease katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff, wodurch Ammoniak gebildet wird und der pH-Wert der Lösung ansteigt, was durch eine Farbänderung detektiert werden kann.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines schnellen und einfach anzuwendenden Nachweises von Bakterien, der auf einem modifizierten Lackmus-Test basiert.
- Nachweis der Spezifität und Empfindlichkeit eines E. coli-aktivierten RNA-spaltenden DNAzyms in diesem System.
- Bereitstellung einer Methode, die für andere analytenempfindliche DNAzyme angepasst werden kann.
Verwendete Methoden
- Synthese eines DNAzym-Urease-Konjugats (UrDNA) unter Verwendung chemischer Vernetzung und Reinigungsschritte.
- Immobilisierung des DNAzym-Urease-Konjugats und eines E. coli-spezifischen DNAzyms (EC1) auf magnetischen Kügelchen.
- Inkubation des Kügelchen-Komplexes mit Testproben, die E. coli enthalten, um die Aktivierung des DNAzyms und die Freisetzung von Urease auszulösen.
- Übertragung der freigesetzten Urease in eine Testlösung, die Harnstoff und einen pH-Indikator (Phenolrot) enthält, gefolgt von der Überwachung des Farbumschlags und der pH-Änderung.
Hauptergebnisse
- Der Test zeigt eine sichtbare Farbänderung (von Gelb nach Rot) bei Anwesenheit von E. coli an, die einem Anstieg des pH-Werts entspricht.
- Keine Farbänderung wird bei Abwesenheit von E. coli oder bei nicht-zielgerichteten Bakterien beobachtet, was auf eine hohe Spezifität hinweist.
- Das Ausmaß der Farbänderung korreliert mit der Anzahl der E. coli-Zellen und der Dauer des Harnstoff-Hydrolyseschritts.
- Der Nachweis von lediglich 107 E. coli-Zellen ist innerhalb von 10 Minuten möglich, wobei der pH-Wert um bis zu drei Einheiten ansteigen kann.
Schlussfolgerungen
- Dieser modifizierte Indikator-Test bietet eine einfache, schnelle und spezifische Methode zur E. coli-Detektion.
- Die Plattform lässt sich an andere DNAzym-basierte Biosensoren anpassen, die auf unterschiedliche Krankheitserreger abzielen.
- Eine sorgfältige Waschung und Handhabung ist entscheidend, um falsch positive Ergebnisse aufgrund einer Urease-Kontamination zu vermeiden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Ein schneller und benutzerfreundlicher Nachweis von Krankheitserregern ist eine zentrale Anforderung in der translationale Forschung und in biopharmazeutischen Arbeitsabläufen vor Ort. Der farbige Lackmuspapier-Test, der RNA-spaltende DNAzyme und die Harnstoffabbau-vermittelte Signaltransduktion nutzt, ermöglicht den spezifischen, visuellen Nachweis von Bakterien wie E.coli und unterstützt so die Früherkennung und Umweltüberwachung. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit und betriebliche Effizienz an entscheidenden Wendepunkten in der Entdeckungs- und Entwicklungsphase.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung des Vorhandenseins von Bakterien unter Verwendung analytenreaktiver DNAzyme zur funktionellen Zielvalidierung.
- Unterstützt die biologische Risikominderung, indem eine hohe Spezifität für E. coli gegenüber Nicht-Zielbakterien geboten wird.
- Erleichtert schnelle Go/No-Go-Entscheidungen bei der Untersuchung von Umwelt- und präklinischen Proben.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte, quantitative kolorimetrische Assays zur weiteren Evaluierung von Verbindungen oder Proben vor.
- Liefert standardisierte, reproduzierbare Ergebnisse durch sichtbare, pH-abhängige Farbänderung.
- Ermöglicht skalierbare, vor-Ort-einsetzbare Screening-Plattformen für den Nachweis von Pathogenen.
Translationale und präklinische Forschung
- Entspricht den krankheitsrelevanten Nachweisanforderungen in der Wasserqualität und Umwelt-Biosurveillance.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem schnelle, vor-Ort-Pathogenanalysen unterstützt werden.
- Verringert das Risiko biologischer Mehrdeutigkeiten in späteren Stadien durch robuste, spezifische Nachweisverfahren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie eine hypothesengetriebene Pathogendetektion ermöglicht und die Bereitschaft von Assays für den Einsatz im Feld und im Labor unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Wegen durch die Spezifität von DNAzymen gegenüber bakteriellen Zielstrukturen.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative farbmetrische Ausgaben zur schnellen Probenvorauswahl.
- Analytik: Liefert messbare pH-Änderungen und visuelle Ergebnisse zum Vergleich von Probenbedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Labor- und Feldabläufe für die Untersuchung von Umwelt- und klinischen Proben.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine modulare Plattform, die an andere, auf DNAzymen basierende Pathogennachweisanwendungen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Pathogendetektion.
- Operationaler Wert: Fördert Standardisierung, Reproduzierbarkeit und schnelle Einführung in unterschiedlichen Umgebungen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht effiziente Go/No-Go-Entscheidungen und reduziert biologische Risiken in späteren Phasen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Detektionsplattformen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Nukleinsäurechemie und der enzymatischen Assay-Herstellung.
- Benötigt Zugang zu grundlegenden Instrumenten der Molekularbiologie und Werkzeugen zur farbmetrischen Detektion.
- Erfordert strikte Wasch- und Handhabungsprotokolle, um falsch positive Ergebnisse durch Urease-Kontamination zu vermeiden.
- Einsatzmöglichkeiten bestehen bei verschiedenen DNAzym-Zielsequenzen für unterschiedliche Bakterienspezies.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeitsschwellen sowie die Notwendigkeit einer Ausbildung im Umgang mit infektiösen Proben im Rahmen der Biologischen Sicherheit.
