Name: Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Lernen Sie einen modifizierten Lackmus-Test zur schnellen Detektion von E. coli mittels RNA-spaltender DNAzym und Urease-basierter Signaltransduktion. Diese einfache Methode ermöglicht eine sichtbare Farbänderung für Point-of-Care-Anwendungen.

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Die Finanzierung für dieses Forschungsprojekt wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) über einen Discovery Grant an YL bereitgestellt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Übersetzung von der Wirkung der RNA - Spaltungsaktivität eines Bakteriums-responsive DNAzyme zu einer Lackmus - Test wird möglich gemacht durch die Verwendung von Urease und magnetische Trennung, wie 1 durch veranschaulicht ist . Obwohl der Nachweis des modifizierten Lackmus - Test für Bakteriendetektion mit einem E. getan coli -abhängigen RNA-Spaltung DNAzyme, 5,19,20 das Design im Allgemeinen für jede RNA-Spaltung DNAzyme erweitert werden kann. Angesic...

Bakterielle Krankheitserreger sind eine der Hauptursachen für weltweite Morbidität und Mortalität. Ausbrüche von Krankenhausinfektionen, durch Lebensmittel übertragene Krankheitserreger und bakterielle Schadstoffe in der Umwelt stellen eine ernsthafte und anhaltende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit und Sicherheit dar. Um diese Ausbrüche zu verhindern, sind wirksame Instrumente erforderlich, die einen rechtzeitigen Nachweis von Krankheitserregern unter einer Vielzahl von Bedingungen ermöglichen. Einfache, aber dennoch effektive Tests, die tragbar und kostengünstig sind, sind sehr begehrt, insbesondere in Regionen, die anfällig für Ausbrüche sind, sich aber keine teuren Testeinrichtungen leisten können. 1-3 Obwohl es eine Vielzahl von Methoden zum Nachweis von Bakterien gibt, eignen sich viele von ihnen nicht als Screening- oder Vor-Ort-Testwerkzeuge, da sie lange Testzeiten, teure Instrumente und komplizierte Testverfahren erfordern. 
Kolorimetrische Tests sind besonders attraktiv für Point-of-Care- oder Feldanwendungen, da Farbveränderungen mit bloßem Auge leicht erkannt werden können. Der Lackmustest für den pH-Wert ist einfach, schnell und effektiv. Obwohl es sich um eine sehr alte Technologie handelt, ist sie aufgrund ihrer Einfachheit und Wirksamkeit auch heute noch weit verbreitet. Überraschenderweise war dieser einfache Test noch nie modifiziert worden, um den Nachweis anderer Analyten zu erreichen, bevor wir kürzlich einen Ansatz entwickelt haben, diesen Test für E. coli-Tests zu modifizieren. 4
Der erweiterte Lackmustest für E. coli verwendet drei zusätzliche Komponenten: ein E. coli-aktiviertes RNA-spaltendes DNAzym (EC1), 5 Urease und magnetische Kügelchen. DNAzyme beziehen sich auf synthetische einzelsträngige DNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität. 6 Sie können mittels In-vitro-Selektion aus DNA-Pools mit Zufallssequenz isoliert werden. 7,8 Sie sind sehr stabil und können durch hocheffiziente automatisierte DNA-Synthese kostengünstig hergestellt werden. 9 Aus diesen Gründen wurden DNAzyme, insbesondere RNA-spaltende DNAzyme, umfassend für Biosensorik-Anwendungen untersucht. 6,10,11 RNA-spaltende DNAzyme-Sensoren wurden entwickelt, um Metallionen,12-16 kleine Moleküle,17,18 bakterielle Krankheitserreger5,19-21 und Krebszellen zu detektieren. 22 Angesichts der großen Verfügbarkeit von zielinduzierten RNA-spaltenden DNAzymen kann jeder Assay, der ein DNAzym verwendet, potenziell erweitert werden, um eine Vielzahl von Analyten zu detektieren.
Urease wird aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, Harnstoff zu Ammoniak zu hydrolysieren,23,24, was zu einer Erhöhung des pH-Werts führt. Urease ist außerdem hocheffizient, stabil und für die Konjugation mit anderen Biomolekülen geeignet. Daher postulierten wir, dass ein Konjugat eines RNA-Spaltungs-DNAzyms mit Urease die Verwendung von Lackmustests zum Nachweis anderer Ziele ermöglichen würde. 5
Die Wirkung des RNA-spaltenden DNAzyms wird auf eine Urease-vermittelte Erhöhung des pH-Werts durch die Verwendung von magnetischen Kügelchen übertragen, die mit dem DNAzyme-Urease-Konjugat immobilisiert sind. Da die Aktivität des untersuchten DNAzyms streng von E. coli abhängt, führt das Vorhandensein dieses Bakteriums in der Testlösung zur Freisetzung von Urease aus den magnetischen Kügelchen an die Lösung, die dann entnommen und zur Hydrolyse von Harnstoff in einer Reporterlösung verwendet wird, die einen pH-empfindlichen Farbstoff enthält. Das Endergebnis dieses Verfahrens ist eine Farbveränderung, die bequem durch den Farbstoff oder das pH-Papier gemeldet werden kann.

<table><tbody><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH) Pellets</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamid / Bisacrylamid (29:1) Lösung</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Bioshop Kanada Inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol blau</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Xylolcyanol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% Natriumdodecylsulfat</td><td>Bioshop Canada Inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Bioshop Canada Inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (II)-hexahydrat</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin-Triphospahte (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ethanol Kommerzielle Alkohole</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylenethylendiamin (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0,04% Phenolrot</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 Polynukleotidkinase Reaktionspuffer</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA-Ligase-Reaktionspuffer</td><td>Bio Basics Kanada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase (5 U/&#956; l)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Bouillon</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase (10 U/&#956; l)</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Glasplatten</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>0,75 mm dicke Abstandhalter</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Kamm</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>UV-Lampe</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metallplatte</td><td>CBS wissenschaftlich</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophoresegerät</td><td>CBS wissenschaftlich</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO Zentrifugalfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Kugel (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Magnetisches Trenngestell</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofuge-Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter (0,22 &#956; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Kulturröhrchen</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultraschallreiniger</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kamera (Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Röhrchen</td><td>VWR Deutschland</td><td>Tel.: 89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

kolorimetrischen nachweis von bakterien mit lackmus-test

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Es gibt eine steigende Nachfrage nach einfachen, aber dennoch effektiven Methoden, die zum Nachweis spezifischer Krankheitserreger für Point-of-Care- oder Feldanwendungen verwendet werden können. Solche Methoden müssen benutzerfreundlich sein und zuverlässige Ergebnisse liefern, die sowohl von Fachleuten als auch von Laien leicht interpretiert werden können. Der Lackmustest für den pH-Wert ist einfach, schnell und effektiv, da er den pH-Wert einer Testprobe über eine einfache Farbänderung anzeigt. Wir haben einen Ansatz entwickelt, um den Lackmustest für den Bakteriennachweis zu nutzen. Die Methode nutzt ein bakteriumspezifisches RNA-spaltendes DNAzym, um zwei Funktionen zu erreichen: die Erkennung eines interessierenden Bakteriums und die Bereitstellung eines Mechanismus zur Steuerung der Urease-Aktivität. Durch die Verwendung von magnetischen Kügelchen, die mit einem DNAzym-Urease-Konjugat immobilisiert sind, wird das Vorhandensein von Bakterien in einer Testprobe auf die Freisetzung von Urease aus den Kügelchen in die Lösung übertragen. Die freigesetzte Urease wird in eine Testlösung überführt, um Harnstoff zu Ammoniak zu hydrolysieren, was zu einer Erhöhung des pH-Werts führt, die mit dem klassischen Lackmustest sichtbar gemacht werden kann.

Das Prinzip des bakteriellen Lackmus - Test ist in Abbildung 1 erläutert Der Test verwendet drei Schlüsselmaterialien. Ein RNA - spaltender DNAzyme die von einem bestimmten Bakterium, Urease und magnetische Kügelchen aktiviert. Die DNAzyme wird als molekulares Erkennungselement verwendet hochspezifischen Nachweis eines Bakteriums von Interesse zu erreichen. Urease und magnetische Kügelchen verwendet werden Signaltransduktion der RNA-Spaltungsaktivität der DNAzyme zu erre...

Wir beschreiben ein Protokoll zum kolorimetrischen Nachweis von E. coli unter Verwendung eines modifizierten Lackmustests, der ein RNA-spaltendes DNAzym, Urease und magnetische Beads nutzt.

Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, einen einfachen, modifizierten Lackmustest zur bakteriellen Detektion zu demonstrieren. Diese Methode beschreibt, wie eine durch E.coli aktivierte RNA-spaltende DNA-Enzym mit einer auf Urease basierenden Signaltransduktionsplattform gekoppelt werden kann, um eine Farbänderung als Reaktion auf E.coli zu erzeugen. Die beiden Hauptvorteile dieser Technik sind die Einfachheit des Tests und ihre Anwendbarkeit auf andere analytenempfindliche RNA-spaltende DNA-Enzyme.Den Versuch werden Seperh Manchehry und Dingran Chang, Doktoranden aus dem Labor von Dr. Yingfu Li an der McMaster University, demonstrieren. Nachdem die Reagenzien und Puffer gemäß dem schriftlichen Protokoll vorbereitet wurden, stellen Sie eine Stammlösung von Succinimidyl-4-cyclohexan-1-carboxylat, oder SMCC, her, indem Sie ein Milligramm SMCC in 676 Mikrolitern DMSO auflösen. Vortexen Sie die Lösung und stellen Sie sie anschließend bis zur Verwendung auf Eis.Lösen Sie ein Milligramm Urease in einem Milliliter 1x PBS und stellen Sie dies bis zur Verwendung auf Eis. Um Urease-DNA (UrDNA) herzustellen, geben Sie 10 Mikroliter einer 100-Mikromolar-Lösung von LD1 in ein

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Biology

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Eine einfache Methode zur Identifizierung der prioritären bakteriellen Erregern ist gentechnisch Reporter Phagen verwenden. Diese Reporter-Phagen, die spezifisch für ihre besonderen Wirtsarten sind, sind in der Lage schnell Transduktion eines Biolumineszenz-Signal Antwort auf Wirtszellen. Hier beschreiben wir die Verwendung von Reporter Phagen für den Nachweis...

&quot;Bioluminescent &#39;Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Wir beschreiben einen elektrochemischen Sensor Testverfahren zum schnellen Nachweis von Bakterien und Identifikation. Der Test umfasst eine Sensoranordnung mit DNA-Oligonukleotid-Capture-Sonden für die ribosomale RNA (rRNA) artspezifische Sequenzen funktionalisiert. Sandwich-Hybridisierung der Ziel-rRNA mit dem Capture-Sonde und einem Meerrettichperoxidase-linked DNA-Oligonukleotid Detektorsonde erzeugt eine messbare amperometrischen Strom.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Dieses Video beschreibt einen kolorimetrischen Assay zur Laktatmessung in Zelllysaten unter Verwendung des Enzyms Laktatdehydrogenase. Dieses Enzym wandelt Laktat in Pyruvat um, zusammen mit der Umwandlung von NAD in NADH, das mit Tetrazoliumfarbstoffen reagiert und ein farbiges Produkt ergibt, das spektrophotometrisch gemessen werden kann, um das Laktat zu quantifizieren.

Kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung von Laktat in Testproben

Dieses Video demonstriert eine kolorimetrische E. coli-Nachweismethode, bei der ein E. coli-Biomarker ein DNAzym aktiviert, was zur Spaltung der RNA-Bindung und zur Ablösung eines DNAzym-Urease-Konjugats führt. Ein anschließender kolorimetrischer Assay weist den E. coli-Biomarker durch ammoniakinduzierte pH-Änderungen nach.

Kolorimetrischer Nachweis eines bakteriellen Biomarkers mittels eines modifizierten Lackmustests

Dieses Video demonstriert den quantitativen Multiplex-Bakteriennachweis mit carboxylierten magnetischen Polystyrol-Mikrosphären, die in unterschiedliche Sätze eingefärbt sind. Das Verfahren umfasst die Bildung von Kügelchen-Bakterien-Komplexen, die magnetische Trennung und die flussbasierte Analyse, die eine präzise und gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Bakterien in derselben Reaktionsvertiefung ermöglicht.

Quantitativer Multiplex-Bakteriennachweis mit Farbstoff-markierten magnetischen Mikrosphären

Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren.

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Anders als bei Eukaryonten zu sehen, gibt es nur wenig Untersuchungen, die detailliert Membrandepolarisation und Ionenkonzentrationsänderungen in Bakterien, in erster Linie ihrer geringen Größe macht herkömmliche Messverfahren schwierig. Hier haben wir ausführlich Protokolle zur Überwachung solcher Veranstaltungen in der deutlichen Gram-positive Erreger Streptococcus pneumoniae Verwendung Fluoreszenztechniken.

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Ein Protokoll, das die integrierte Konzentration, Anreicherung und den kolorimetrischen Endpunktnachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern in großen Mengen landwirtschaftlichen Wassers beinhaltet, wird hier vorgestellt.  Das Wasser wird durch modifizierte Moore-Tupfer (MMS) gefiltert, die mit selektiven oder nicht-selektiven Medien angereichert sind, und der Nachweis erfolgt mit papierbasierten Analysegeräten (μPAD), die in bakterienindizierte kolorimetrische Substrate eingebettet...

Farbmetrische Papierbasierte Erkennung von<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonellen</em&gt; Spp. Und<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Von großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion vor. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfacher auszuwerten und genauer ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert.

Visualisierung der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion

Lernen Sie einen modifizierten Lackmus-Test zur schnellen Detektion von E. coli mittels RNA-spaltender DNAzym und Urease-basierter Signaltransduktion. Diese einfache Methode ermöglicht eine sichtbare Farbänderung für Point-of-Care-Anwendungen.

Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

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