Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, einen einfachen, modifizierten Lackmustest zur bakteriellen Detektion zu demonstrieren. Diese Methode beschreibt, wie eine durch E.coli aktivierte RNA-spaltende DNA-Enzym mit einer auf Urease basierenden Signaltransduktionsplattform gekoppelt werden kann, um eine Farbänderung als Reaktion auf E.coli zu erzeugen. Die beiden Hauptvorteile dieser Technik sind die Einfachheit des Tests und ihre Anwendbarkeit auf andere analytenempfindliche RNA-spaltende DNA-Enzyme.

Den Versuch werden Seperh Manchehry und Dingran Chang, Doktoranden aus dem Labor von Dr. Yingfu Li an der McMaster University, demonstrieren. Nachdem die Reagenzien und Puffer gemäß dem schriftlichen Protokoll vorbereitet wurden, stellen Sie eine Stammlösung von Succinimidyl-4-cyclohexan-1-carboxylat, oder SMCC, her, indem Sie ein Milligramm SMCC in 676 Mikrolitern DMSO auflösen. Vortexen Sie die Lösung und stellen Sie sie anschließend bis zur Verwendung auf Eis.

Lösen Sie ein Milligramm Urease in einem Milliliter 1x PBS und stellen Sie dies bis zur Verwendung auf Eis. Um Urease-DNA (UrDNA) herzustellen, geben Sie 10 Mikroliter einer 100-Mikromolar-Lösung von LD1 in ein 2,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie anschließend 140 Mikroliter zweifach destilliertes Wasser und 40 Mikroliter 10x PBS hinzu und wirbeln Sie die Mischung kurz im Vortex.

Fügen Sie anschließend 80,5 µL SMCC-Standardlösung und 159,5 µL DMSO hinzu. Vortexen Sie erneut und zentrifugieren Sie kurzzeitig mit einem Tischzentrifugen. Inkubieren Sie die Reaktion 60 Minuten lang bei 37 °C in einem Inkubator oder einem Wärmesblock.

Nach der Inkubation 200 Mikroliter 1x PBS, 60 Mikroliter dreimolarer Natriumacetat und 1,5 Milliliter kalten 100 %igen Ethanol in das Gefäß geben. Durch Vortexen mischen und die Reaktion 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius inkubieren. Die Lösung bei 20.000 × g und 4 Grad Celsius 20 Minuten lang zentrifugieren.

Entfernen Sie anschließend den Überstand und trocknen Sie das Pellet im Vakuum. Geben Sie zum getrockneten Pellet 400 Mikroliter Harnstoffase-Stammlösung hinzu und inkubieren Sie fünf Stunden bei Raumtemperatur. Überführen Sie 200 Mikroliter der rohen Konjugatlösung in eine vorher gewaschene Zentrifugalfilterkolonne mit einer Molekulargewichts-Cutoff-Grenze von 100.000.

Zentrifugieren Sie die Säule bei 14.000 × g für fünf Minuten. Übertragen Sie die verbleibenden 200 µL des rohen Konjugats auf die Säule und zentrifugieren Sie erneut bei 14.000 × g für fünf Minuten. Entfernen Sie anschließend die Säule und stellen Sie sie verkehrt herum in ein neues 2-mL-Mikrozentrifugen-Sammelröhrchen.

Zentrifugieren Sie die umgedrehte Säule und den Behälter bei 1.000 × g für zwei Minuten. Nach dem Entfernen des Sammelrohrs 30 µL 1x PBS zur Waschung der Membran hinzufügen, um eine zusätzliche Rückgewinnung der Konjugate zu ermöglichen. Die Säule erneut umdrehen und zurück in das Sammelrohr stellen.

Zentrifugieren Sie die Säule bei 1.000 × g für zwei Minuten. Entfernen und entsorgen Sie die Säule. Lagern Sie die UrDNA bei vier Grad Celsius bis zur Verwendung.

Um einen E.coli-aktivierten, RNA-spaltenden DNAzymen, oder EC1, und UrDNA an magnetische Kügelchen zu binden, mischen Sie die Lagerlösung der magnetischen Kügelchen gut durch und übertragen 100 µL der Kügelchensuspension in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie dann das Röhrchen in einen Magnetständer, um die Kügelchen zu isolieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und geben Sie 150 µL Bindungspuffer, oder BB, hinzu.

Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Halter und klopfen Sie vorsichtig darauf, um die Perlen in eine homogene Lösung zurückzususpendieren. Nachdem Sie die BB-Wäsche insgesamt dreimal mit den suspendierten Perlen durchgeführt haben, geben Sie 10 Mikroliter einer 10-Mikromolar-EC1-Lösung hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Antippen des Röhrchens.

Die Lösung unter leichtem Schütteln 30 Minuten lang inkubieren. Um eine Aggregation der Kügelchen zu vermeiden, alle zwei bis drei Minuten leicht auf das Röhrchen klopfen. Danach das Mikrozentrifugenröhrchen erneut auf den Magnetrack stellen, um die Kügelchen zu isolieren, und den Überstand mit einer Pipette abnehmen.

Danach die Kügelchen dreimal mit jeweils 150 Mikrolitern BB waschen. Nach Abschluss der Waschschritte die Kügelchen in insgesamt 150 Mikrolitern BB suspendieren. Zu dieser Lösung 15 Mikroliter UrDNA hinzufügen und die Probe zwei Minuten lang bei 45 Grad Celsius erhitzen, anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen und zwei Stunden inkubieren. Das Mikrozentrifugenröhrchen erneut auf den Magnetrack stellen, um die Kügelchen zu isolieren, und den Überstand mit einer Pipette abziehen.

Gebe 100 µL Reaktionspuffer, oder RB, hinzu, dann entferne das Röhrchen vom Magnetrack und resuspendiere die Perlen vorsichtig. Nachdem die E. coli-Zellen gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, spüle ein 1,5-mL-Microfuge-Röhrchen vor, indem du 100 µL RB hinzufügst und vortexst. Danach entsorge den Puffer. Füge 15 µL des zusammengesetzten EC1 dem gewaschenen Röhrchen hinzu, stelle das Röhrchen dann auf den Magnetrack und aspirations die Überstände.

Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Gestell, geben Sie 100 Mikroliter RB hinzu und resuspendieren Sie die magnetischen Partikel vorsichtig. Nachdem Sie die Partikel noch zweimal mit RB gewaschen und das RB entfernt haben, fügen Sie 10 Mikroliter der E.coli-Probe zum Röhrchen hinzu und mischen den Inhalt vorsichtig durch leichtes Antippen des Röhrchens. Inkubieren Sie danach die Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation 90 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzufügen und das Gefäß auf den Magnetrack stellen. Nach etwa drei Minuten magnetischer Trennung vorsichtig 85 Mikroliter des Überstandes in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Es ist äußerst wichtig, die Lösung vorsichtig mit der Pipette zu handhaben, wobei keiner der magnetischen Kügelchen mitaufgenommen werden darf.

Diese Kügelchen enthalten Harnstoffabbauendes Enzym (Urease) und erzeugen ein falsch-positives Signal. Geben Sie 15 µL 0,04 % Phenolrot und 100 µL Substratlösung hinzu. Nehmen Sie anschließend Aufnahmen in bestimmten Zeitabständen vor, um die Farbänderung zu dokumentieren.

Die Ausgangsfarbe des Lackmustests muss gelb sein, was einen Lösungs-pH-Wert unter 5,5 widerspiegelt. Gegebenenfalls kann der Ausgangs-pH-Wert des Lackmustests mit einem schwachen Puffer angepasst werden, beispielsweise mit einem einmillimolaren Natriumacetat-Puffer bei pH 5. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse des bakteriellen Lackmustests, bei dem der von E.coli-aktivierter RNA-spaltender DNAzyme EC1 als DNAzyme und Phenolrot als pH-Indikator verwendet wurde.

Wie der fehlende Farbumschlag in Abwesenheit von E.coli zeigt, ist EC1 hochspezifisch und weist minimale Aktivität gegenüber anderen Bakterien auf. Die Intensität des Farbumschlags hängt sowohl von der Anzahl der E.coli-Zellen ab, die im Aktivierungsschritt des DNAzyms verwendet werden, als auch von der für die Harnstoffhydrolyse zur Verfügung stehenden Zeit. Eine größere Anzahl an E.coli-Zellen führt zu einem stärkeren Farbumschlag, und eine längere Reaktionszeit für die Harnstoffhydrolyse ermöglicht den Nachweis einer geringeren Zellanzahl.

Dieses Diagramm zeigt die pH-Änderung, die mithilfe eines handelsüblichen pH-Messgeräts überwacht wurde. Das Vorhandensein von 10 hoch 7 E.coli-Zellen führte innerhalb von 10 Minuten zu einer allmählichen Erhöhung des pH-Werts um drei Einheiten. Im Gegensatz dazu verursachte das Fehlen von E.coli unter denselben Bedingungen keine nachweisbaren pH-Änderungen.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass Urease sehr aktiv ist und eine unzureichende Wäsche oder Kontamination zu einem falsch positiven Ergebnis führen kann. Nach diesem Verfahren kann diese Methode angewendet werden, um E. coli unter relevanteren Bedingungen zu testen, beispielsweise bei der Untersuchung der Qualität von Umwasser.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie ein einfacher Lackmus-Test für die E.coli-Prüfung genutzt werden kann. Vergessen Sie nicht, dass dieser Test zur Detektion pathogener E.coli eingesetzt werden kann, was äußerst gefährlich ist. Sie müssen eine Schulung zur Biosicherheit absolvieren, bevor Sie irgendwelche Tests mit pathogenen Bakterien durchführen.