Bestimmung des Zetapotentials über Nanoparticle Translokation Geschwindigkeiten durch eine Tunable Nanopore: Die Verwendung von DNA-modifizierten Partikel als Beispiel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Oberflächenchemie von Nanopartikeln mit Hilfe von Tunable Resistant Post Sensing (TRPS) zu charakterisieren und das Zetapotenzial des Materials zu bestimmen. Dies wird durch die Charakterisierung von DNA-modifizierten Nanopartikeln demonstriert. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Charakterisierung von Nanomaterialien und der Entwicklung von Bioassays zu beantworten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die Partikel-für-Partikel-Analyse durchführen können. Jedes DNA-Partikelsignal wird in eine Zetapotenzialmessung übersetzt, die ein vollständiges Bild der zu analysierenden Probe liefert. Die älteste Methode könnte Aufschluss über die Charakterisierung von Materialien geben.

Es kann auch für andere Anwendungen eingesetzt werden, wie z. B. die Entwicklung von Bioassays für den Nachweis von Zellen, Viren, DNA und Proteinen. Im Allgemeinen werden Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es nicht einfach ist, den Stempel zu injizieren und dann auf die Antwort zu warten. Es ist ein gewisser Input des Wissenschaftlers erforderlich.

Um dieses Verfahren zu beginnen, werden mit Streptavidin beschichtete Partikel 30 Sekunden lang vortex, bevor sie zwei Minuten lang bei 80 Watt beschallt werden, um die Monodispersität sicherzustellen. Verdünnen Sie die mit Streptavidin überzogenen Partikel eins zu hundert in PBST-Puffer, um eine resultierende Konzentration von eins mal zehn auf neun Partikel pro Milliliter zu erreichen. Dann die Partikel 30 Sekunden lang vortexen.

Basierend auf einer Bindungskapazität von 4.352 Picomolen pro Milligramm bei der entsprechenden Konzentration von DNA zu den Partikeln für resultierende Konzentrationen von 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 und 210 Nanomolaren. Nachdem Sie die Proben 10 Sekunden lang vortexiert haben, legen Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf ein Drehrad, damit die DNA über eine Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung an die Partikeloberflächen binden kann. Sobald die eingefangene DNA hinzugefügt und mit den Partikeln inkubiert wurde, entfernen Sie die überschüssige DNA und die Lösung durch magnetische Trennung, indem Sie die Proben 30 Minuten lang auf ein Magnetgestell legen.

Entfernen Sie anschließend den Überstand und achten Sie darauf, den neu gebildeten Teilchenhaufen, der dem Magneten am nächsten ist, nicht zu stören. Ersetzen Sie dann den Überstand durch das gleiche Volumen frischen PBST-Puffers. Fügen Sie nun jeder Probe die erforderliche Menge an Ziel-DNA hinzu, um sicherzustellen, dass die maximal mögliche Zielbindung erreicht wurde.

Die Proben 10 Sekunden lang vortexen. Und legen Sie sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf das Drehrad. Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die überschüssige Ziel-DNA durch magnetische Trennung, indem Sie die Proben für 30 Minuten auf das Magnetgestell legen.

Entfernen Sie anschließend den Überstand und achten Sie darauf, den neu gebildeten Teilchenhaufen, der dem Magneten am nächsten ist, nicht zu stören. Ersetzen Sie dann den Überstand durch das gleiche Volumen frischen PBST-Puffers. Nachdem Sie die vorherigen Schritte für doppelte Proben wiederholt haben, legen Sie die Proben 16 Stunden lang bei Raumtemperatur auf das Drehrad, um die DNA-Hybridisierungszeiten zu untersuchen.

Schließen Sie an diesem Punkt ein TRPS-Gerät an ein Computersystem an, auf dem die Software installiert ist. Messen Sie mit Messschiebern den Abstand zwischen der Außenseite zweier paralleler Backen. Geben Sie den Abstand in das Dehnungsfeld auf der Registerkarte "Instrumenteneinstellungen" ein und klicken Sie unter der Registerkarte auf "Dehnung kalibrieren".

Anschließend wird eine Polyurethan-Nanoporenmembran mit geeigneter Größe für die Analyse seitlich auf die Kiefer aufgesetzt, wobei die Nanoporen-ID-Nummer nach oben zeigt. Dehnen Sie dann die Backen mit dem Dehnungsverstellgriff an der Seite des Instruments auf die für die Analyse erforderliche Dehnung. Geben Sie 80 Mikroliter PBST-Puffer in die untere Flüssigkeitszelle unter der Nanopore und stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind, die die Messung beeinträchtigen könnten.

Klicken Sie nun die obere Flüssigkeitszelle ein und fügen Sie 40 Mikroliter Puffer hinzu, um sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind. Platzieren Sie dann einen Faradayschen Käfig über das System und üben Sie einen externen Druck aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem Sie 40 Mikroliter der Kalibrierpartikel in die obere Flüssigkeitszelle gegeben haben, führen Sie eine TRPS-Messung bei drei angelegten Spannungen durch.

Ändern Sie die Spannung, indem Sie auf die Plus- und Minus-Schaltflächen auf der Spannungsskala auf der Registerkarte Geräteeinstellungen in der Software klicken. Prüfen Sie, ob die drei Spannungen die entsprechenden Hintergrundströme zurückgeben. Und stellen Sie sicher, dass die Kalibrierpartikel bei der Mittelspannung eine durchschnittliche Blockadegröße von mindestens 0,3 Nanoampere erzeugen.

Sobald die im Textprotokoll beschriebenen Bedingungen erfüllt sind, starten Sie den Lauf, indem Sie in der Software auf der Registerkarte Datenerfassung auf Start klicken. Um die Messung abzuschließen, klicken Sie auf der Registerkarte "Datenerfassung" auf "Stopp" und speichern Sie die Datendatei. Waschen Sie das System, indem Sie die Kalibrierpartikel mit 40 Mikrolitern mit PBST-Puffer mehrmals in die oberen Flüssigkeitszellen austauschen.

Und das Ausüben verschiedener Drücke, bis keine Blockadeereignisse mehr vorhanden sind, um sicherzustellen, dass keine Restpartikel und keine Kreuzkontamination vorhanden sind. Nachdem der entsprechende Ausgangsstrom erreicht ist, ersetzen Sie den Elektrolyten in der oberen Flüssigkeitszelle durch 40 Mikroliter Probe. Starten Sie den Beispiellauf, indem Sie auf der Registerkarte Data Acquisition auf Start klicken.

Nehmen Sie mindestens 500 Partikel auf und stellen Sie sicher, dass die Laufzeit mindestens 30 Sekunden beträgt. Um die Messung abzuschließen, klicken Sie auf der Registerkarte "Datenerfassung" auf "Stopp" und speichern Sie die Datendatei. Ein Beispiel für die Größen- und Zetapotenzialanalyse von Streptavidin-beschichteten Partikeln ohne Modifikationen und Streptavidin-beschichteten Partikeln, die mit einzelsträngiger DNA auf der Oberfläche gesättigt sind, ist hier dargestellt.

Obwohl beide Proben ähnlich groß waren, war das Zetapotenzial signifikant unterschiedlich und viel größer, wenn die DNA auf die Partikeloberfläche funktionalisiert wurde. Die Daten zur Größe und zum Zetapotenzial, die für Proben mit den niedrigsten und höchsten Konzentrationen an DNA, die mit den Streptavidin-beschichteten Partikeln hybridisiert sind, angezeigt werden. Ein größerer Zeta-Potentialwert wird für Partikel aufgezeichnet, die mit einer höheren DNA-Konzentration hybridisiert wurden.

Hier ist die Veränderung des Zetapotenzials dargestellt, die nur für die eingefangene sondierte DNA, ein vollständig komplementäres DNA-Ziel, ein mittleres bindendes DNA-Ziel, ein endbindendes DNA-Ziel und ein überhängendes DNA-Ziel gemessen wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, einen Nanopol zwischen jeder Kalibrierung und Probe gründlich zu waschen, um sicherzustellen, dass es keine Kreuzkontamination zwischen den Proben gibt und eine Verstopfung der Nanopole verhindert wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biosense, um Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen in Multiplex-Assays zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit TRPS das Zetapotenzial ermitteln und DNA-modifizierte Partikel für Bioassays vorbereiten können.