Name: Bestimmung des Zetapotentials über Nanoparticle Translokation Geschwindigkeiten durch eine Tunable Nanopore: Die Verwendung von DNA-modifizierten Partikel als Beispiel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Charakterisierung der Oberflächenchemie von Nanopartikeln mittels TRPS zur Bestimmung des Zetapotentials. Diese Methode ermöglicht die partikelweise Analyse DNA-modifizierter Nanopartikel.

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Die Autoren danken Izon Science Ltd für ihre Unterstützung. Die Arbeit wurde von der Europäischen Kommission für Forschung (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio) unterstützt.

1. Herstellung der Phosphat-gepufferte Saline mit Tween-20 (PBST) Puffer <ol><li> Auflösen einer Tablette PBS (0,01 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid, 0,137 M Natriumchlorid, pH 7,4) in 200 ml deionisiertem Wasser (18,2 M &amp; OHgr; cm). </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l (0,05 (v / v)%) Tween-20 in die 200 ml Pufferlösung als Tensid. </li></ol> 2. Vorbereitung Carboxylende Polystyrolteilchengröße Standards <ol><li> Vortexen die Kalibrierungspartikeln für 30 sec vor der Beschallung für 2 min bei 80 Watt Monodispersität der Teilchen zu erzeugen. </li><li> Verdünnen Sie die Kalibrierung Partikel 1 in 100 bis zu einer Konzentration von 1x10 10 Teilchen / ml in PBST - Puffer und Vortex für 30 Sekunden. </li></ol> 3. Vorbereitung Streptavidin beschichtete Teilchen <ol><li> Vortexen die Partikel für 30 sec vor der Beschallung für 2 min bei 80 Watt Monodispersität zu gewährleisten. </li><li> Verdünnen Sie die Streptavidin-beschichteten Teilchen 1 in 100 in PBST Puffer achieve eine resultierende Konzentration von 1x10 9 Teilchen / ml und Vortex für 30 Sekunden. Hinweis: Ein typisches Probenvolumen 200 ul ist. Wenn beispielsweise die Untersuchung von fünf DNA-Konzentrationen vorzubereiten 1 ml verdünntes Streptavidin beschichteten Teilchen. </li></ol> 4. Herstellung von Oligonucleotiden <ol><li> Rekonstituieren Oligonukleotiden mit deionisiertem Wasser bis zu einer resultierenden Konzentration von 100 uM. </li></ol> 5. Die Zugabe von Fänger-Sonde (CP) DNA an die Streptavidin beschichtete Teilchen <ol><li> Vor der DNA-Bindung, vortex die Streptavidin-beschichteten Teilchen (200 &amp; mgr; l Probenvolumen) für 30 sec mit einem 80 Watt Beschallung 2 min gefolgt. </li><li> Auf der Basis der Bindungskapazität des Lieferanten (4.352 pmol / mg) versehen ist, fügt die entsprechende Konzentration an DNA auf die Teilchen zur resultierenden Konzentrationen von 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 und 210 nM DNA. </li><li> Vortex, um die Proben für 10 Sekunden und auf ein Drehrad bei Raumtemperaturfür 30 min für die DNA zu erlauben, über eine Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung an die Partikeloberflächen zu binden. </li><li> Sobald der Fänger-DNA mit den Streptavidin-beschichteten Teilchen wurde zugegeben und inkubiert, das überschüssige DNA in Lösung durch magnetische Trennung, indem die Proben auf einem Magnetzahnstange Plazieren für 30 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, kümmert sich nicht um die neu gebildete Gruppe von Teilchen der Nähe des Magneten zu stören, und ersetzen mit dem gleichen Volumen an neuen PBST-Puffer. </li></ol> 6. Hybridisierende Complementary DNA an die CP-Teilchen <ol><li> Die erforderliche Menge an Ziel-DNA (im Überschuß bei 500 nM), um die maximal mögliche Ziel sicherzustellen Bindung erreicht wurde. </li><li> Vortex die Proben 10 sec und auf ein Drehrad bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, entfernen Sie das überschüssige Ziel-DNA über magnetische Trennung, indem die Proben auf einem Magnet Rack platzieren für 30 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, Kümmert sich nicht um die neu gebildete Gruppe von Teilchen der Nähe des Magneten, und ersetzen mit dem gleichen Volumen neuer PBST Puffer zu stören. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.4 für Doppelproben und legen diese Proben auf einem Drehrad bei Raumtemperatur für 16 Stunden DNA Hybridisierungszeiten zu untersuchen. </li></ol> 7. TRPS-Setup <ol><li> Stecken Sie das Gerät in ein Computersystem mit Software vorhanden. </li><li> Kalibrieren Sie die Anfangsstrecke mit einer Schieblehre. <ol><li> Den Abstand zwischen der Außenseite von zwei parallelen Klemmbacken. </li><li> Eingang in die Software, indem Sie die Strecke in der &quot;Strecke&quot; Feld in der &quot;Geräteeinstellungen&quot; Registerkarte und klicken Sie &quot;Kalibrieren Stretch &#39;unter der Registerkarte. </li></ol></li><li> Lateral passen ein Polyurethan Nanopore Membran geeigneter Dimensionierung für die Analyse auf die Backen mit der Nanopore-ID-Nummer nach oben. Dann strecken die Backen auf der Strecke benötigt für die Analyse unter Verwendung derstretch Einstellgriff an der Seite des Instruments. Strecken Sie die Backen zwischen 43 und 48 mm. Hinweis: Der genaue Wert der Strecke entlang der angelegten Spannung bestimmt wird, so dass eine Kalibrierung Partikel Blockaden mindestens 0,3 nA groß sind. Die Strecke ist bereits in die Software in Schritt eingegeben 7.2 und werden automatisch angepasst, wie die Backen gespannt sind. </li><li> Legen Sie 80 ul PBST-Puffer in der unteren Fluidzelle unterhalb der Nanopore, um sicherzustellen, gibt es keine Blasen vorhanden, die die Messung beeinflussen können. Wenn es Blasen gesehen sind, zu entfernen und den Puffer zu ersetzen. </li><li> Klicken Sie auf die obere Flüssigkeitszelle in Position und platzieren 40 ul Puffer hinein, wieder zu gewährleisten gibt es keine Blasen vorhanden. Wenn Blasen in der oberen Fluidzelle sind, entfernen Sie sie durch die Flüssigkeit zu ersetzen. </li><li> Wenn eine reproduzierbare Basisstrom hat sich von Ersetzen der oberen Flüssigkeitszelle mit Puffer erreicht, dann werden 40 ul der Probe in die obere Fluidzelle und messen, indem Sie auf &quot;stKunst &quot;in der&quot; Data Acquisition &quot;Tab auf der Software-Bildschirm. Hinweis: Die Datenerfassung bei einer Frequenz von 50 kHz mit einer Blockade Größenordnung untere Grenze von 0,05 nA abgeschlossen ist, obwohl dies geändert werden kann die Software über die &quot;Analyse Daten&quot; Reiter (unter &quot;Analyseeinstellungen&quot; und &quot;Resistive Sperrungen &#39;) . </li><li> Platzieren einen Faradayschen Käfig über die Oberseite des Fluidzellensystems auf elektrische Hintergrundrauschen auf die Messung reduzieren. </li><li> Verwenden Sie einen variablen Druckmodul (VPM) einen Druck oder ein Vakuum auf die Proben anzuwenden. <ol><li> Um sich ein äußerer Druck die Düse in die obere Fluidzelle verbinden, drehen Sie dann den Druck Arm und einrasten (je nachdem, ob ein positiver Druck (PRE) oder ein Vakuum (VAC) wird angewendet werden). </li><li> Wenden Sie Druck in einem &quot;cm&quot; oder &quot;mm&quot; Skala der Druckstufe Knopf auf der Oberseite des VPM gelegen verwenden. Drücken Sie den Knopf nach unten Druck auf die &#39;cm&#39; Maßstab anwenden und ziehen Sie sie nach oben to gelten Druck auf die &quot;mm&quot; Skala. </li></ol></li></ol> 8. Vorbereiten von Beispielen für TRPS Analyse <ol><li> Vortex Proben 30 sec und beschallen für 2 min bei 80 Watt vor TRPS Analyse. </li></ol> 9. Kalibrieren des Nanopore für Zeta-Analyse <ol><li> 40 ul Eichpartikel (1x10 10 Teilchen / ml) in die obere Fluidzelle Nach der Platzierung, füllen Sie eine TRPS Messung (Setup wie in Kapitel 7) bei 3 Spannungen angelegt. Ändern Sie die Spannung, die durch einen Klick auf das &quot;+&quot; und &quot;-&quot; Tasten auf der Spannungsskala in der Registerkarte &quot;Geräteeinstellungen&quot; auf der Software. </li><li> Überprüfen Sie, ob die drei Spannungen Hintergrund Ströme von ca. 140, 110 und 80 nA zurück. Sicherzustellen, dass die Kalibrierungs Partikel erzeugen eine durchschnittliche Blockade Größenordnung von mindestens 0,3 nA an der Mittelspannung. </li><li> Einen Druck so die durchschnittliche Halbwertsbreite (FWHM) Dauer der Kalibrierungs Partikel zumindest0,15 ms. Tun Sie dies manuell den Druckarm mit auf den variablen Druckmodul befestigt. Wählen Sie den Druck (PRE) oder Vakuum (VAC) durch Drehen des Armes, bis es in der gewünschten Position einrastet und entsprechend Anweisungen in Schritt 7.8.2 einrichten gelten nach. Sobald diese Bedingungen erreicht wurden, den Lauf starten, indem Sie &quot;Start&quot; auf der Software in der &quot;Data Acquisition&quot; Registerkarte klicken. </li><li> Füllen Sie den Lauf von &quot;Stop&quot; in der &quot;Data Acquisition&quot; Tab drücken, wenn mindestens 500 Teilchen gemessen wurden (siehe &quot;Particle Count &#39;am unteren Rand der Software-Bildschirm während der Messung) und der Lauf wurde 30 Sekunden überschritten wird (siehe&#39; Run Time &#39;auch in Richtung der Unterseite des Bildschirms). </li><li> Kalibrieren Sie das System durch einen Kalibrierungslauf abgeschlossen, wie jedes Mal, wenn ein neues Nanopore beschrieben eingeführt wird oder für jeden neuen Tag der Analyse von 9,1-9,4 Schritt vervollständigt. </li></ol> 10. eine Probe Lauf <ol><li> Führen Sie die Proben mit der höchsten oderzweithöchste Spannung wie die Kalibrierungsproben auf einem ähnlichen (± 10 nA) gewährleistet, wenn sie nicht gleich sind, Basisstrom. <ol><li> Sobald die geeignete Basisstrom erreicht wird, ersetzen Sie den Elektrolyt in der oberen Fluidzelle mit 40 ul der Probe. Wenn eine Probe eingeführt wird, Blockaden auf der Signalspur zu sehen. Starten Sie das Beispiel ausführen, indem Sie auf &quot;Start&quot; in der &quot;Data Acquisition&quot; Tab und notieren Sie mindestens 500 Teilchen (check &#39;Particle Count&#39; unter der Signalspur befindet) und sorgen für die Laufzeit mindestens 30 sec ist (siehe &#39;Run Time &#39;auch unterhalb der Signalspur befindet). </li><li> Um die Messung abgeschlossen ist, klicken Sie auf &quot;Stopp&quot; in der &quot;Data Acquisition Registerkarte &#39;und die Datendatei speichern. </li></ol></li><li> die Datei, geben Sie die Dateiinformationen in folgendem Format zu speichern; &quot;Untersuchung&quot; ist der Ordner, die Datei gespeichert werden soll in &quot;Nanopore ID&quot; ist die Seriennummer der Pore verwendet wird, &#39;Part #&#39; is die Art der Poren (dh NP150 / NP200), &quot;Proben - ID&quot; der Name der Probe vorhanden ist, &quot;Kalibrierung oder Probe&quot; Details , ob es sich um eine Kalibrierung oder Probenmessung ist, &quot;Verwässerung&quot; wird verwendet, wenn die Probe wurde verdünnt ( Typ 100, wenn die Probe verdünnt wurde 100-fach), &quot;Druck&quot; ist der ausgeübte Druck auf die Probe (in cm - siehe Abschnitt 7.8), &#39;Electrolyte-ID&#39; ist der Name des Puffers wird die Probe aus in und &#39; Hinweise &#39;sind jegliche persönliche Notizen über die Probe oder laufen. </li><li> Zwischen jedem Probelauf, waschen Sie das System mit 40 ul PBST Platzierung mehrmals Puffer in die obere Fluidzelle und verschiedene Drücke (in der Regel bei -10, -5 cm (Vakuum), und 5 und 10 cm (Überdruck)) Aufbringen bis nicht mehr Blockade Ereignisse vorhanden sind, um sicherzustellen, gibt es im System verbleiben keine Restpartikel sind und daher keine Kreuzkontamination zwischen den Proben. Führen Proben in dreifacher Ausfertigung mit diesem Waschschritt zwischen jeder Wiederholung Probe abgeschlossen als wel laufenl zwischen verschiedenen Proben. </li></ol>

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<html> Die Berechnung für das Zeta - Potential verwendet , um eine Kalibrierung basierte Methode verwandt von Arjmandi arbeiten et al. 21. Die Dauer der Translokation von Teilchen, wie sie eine Nanopore durchqueren, als eine Funktion der angelegten Spannung gemessen wird, eine mittlere elektrische Feld und Partikelgeschwindigkeiten über die Gesamtheit eines regelmäßigen konischen Pore verwenden. Die elektrophoretische Mobilität ist die Ableitung von 1 / T in Bezug auf die Spannung (wobei T die Dauer B...

Funktionalisierte Nanopartikel werden immer beliebter als Biosensoren sowohl in medizinischen und ökologischen Bereich. Die Fähigkeit , eine Nanopartikel der Oberflächenchemie, die mit DNA, beispielsweise zu verändern, erweist sich nützlich für die gezielte Arzneimittelverabreichungssysteme 1 und Überwachung DNA-Protein - Wechselwirkungen 2-4. Eine zunehmend verbreitete Nanopartikel Eigenschaft wird in Biotests verwendet und bei der Bereitstellung von Therapeutika ist Superpara 5. Superparamagnetische Partikel (SPPS) sind äußerst nützlich bei der Identifizierung und spezifischen Analyten aus komplexen Mischungen zu entfernen und kann so mit der einfachen Verwendung eines einzigen Magneten tun. Einmal entfernt, kann der Analyt-gebundenen Teilchen charakterisiert und analysiert werden, für den Zweck geeignet. Frühere Verfahren verwendet zum Nachweis und zur Charakterisierung von Nanoteilchen umfassen optische Techniken, wie beispielsweise dynamische Lichtstreuung (DLS), die auch als Photonenkorrelationsspektroskopie bekannt. Obwohl ein hallogh Durchsatz Technik wird DLS beschränkt zu sein , eine Mittelungs basierte Technik und bei der Analyse von multimodalen Proben ohne die Zugabe von Spezialsoftware, die größeren Teilchen eine viel dominanter Signal, produzieren einige der kleineren Teilchen völlig unbemerkt 6,7 zu verlassen. Particle-by-Teilchen sind Charakterisierungstechniken daher wesentlich günstiger Nanopartikel und funktionalisierte Nanopartikel-Systeme zu analysieren. RPS basierten Technologien basieren auf ein elektrisches Feld an eine Probe Aufbringen und Überwachen des Transportmechanismus der Partikel durch einen synthetischen oder biologischen Nanopore. Eine relativ neue Nanopartikel - Detektion und Charakterisierung Technik basiert auf RPS ist abstimmbaren Widerstandspulserkennung (TRPS) 16.08. TRPS ist ein Zwei-Elektrodensystem durch ein elastomeres, abstimmbaren Porenmembran getrennt. Abstimmbarer Poren Verfahren ermöglicht Analyten aus einer Reihe von Form 17 und eine Größe über ihre trans zu messPort-Mechanismen durch die Pore. Abstimmbaren Poren wurden zuvor für die Detektion von kleinen Partikeln (70-95 nm Durchmesser) Herstellung vergleichbare Ergebnisse zu anderen Techniken , wie beispielsweise Transmissionselektronenspektroskopie (TEM) 10 verwendet. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wird ein Ionenstrom beobachtet und als Partikel / Moleküle durch die Poren passieren, sie vorübergehend die Poren blockieren, eine Verringerung der Strom zu verursachen, die als &quot;Blockade Ereignis&quot; definiert werden kann. Jede Blockade Ereignis ist repräsentativ für ein einzelnes Teilchen , so dass jedes Teilchen in einer Probe einzeln auf der Blockade Größe basierend charakterisiert werden kann, Δ <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54577/54577eq1.jpg" /> Halb Maximum und voller Breite, FWHM, sowie andere Blockade Eigenschaften. Analysieren von einzelnen Teilchen, wie sie durch eine Nanopore passieren ist vorteilhaft für die multimodale Proben als TRPS erfolgreich und effektiv eine Reihe unterscheiden von Partikelgrößen amongst eine einzelne Probe. Tunable resistive Pulserfassungs vervollständigt Größe 10, Zetapotential 12,18 und Konzentration 15 Messungen gleichzeitig in einem einzigen Durchlauf und kann daher noch unterscheiden Proben ähnlich, wenn nicht die gleiche Größe durch ihre Oberflächenladung 19; ein Vorteil gegenüber alternativen Sizing-Techniken. Zeta - Potential ist als das elektrostatische Potential an der Scherebene 20 definiert ist , und wird aus Partikelgeschwindigkeiten berechnet , da sie eine Pore 19 durchqueren. Zeta-Potential-Messungen einzelner Partikel gibt damit einen Einblick in die Translokation Mechanismen und das Verhalten der Nanopartikel-Systemen in Lösung, wertvolle Informationen für die Zukunft von Nanopartikel-Assay-Designs für eine Vielzahl von Anwendungen. Particle-by-Partikelanalyse solcher Art, ermöglicht auch die Verbreitung und Verteilung von Zetapotentialwerte unter einer Stichprobe untersucht werden, um weitere Informationen erlauben on Reaktionskinetik (einzelsträngig zu doppelsträngiger DNA, zum Beispiel) und Partikelstabilitäten in Lösung erreicht werden. Hier beschreiben wir eine Technik, und charakterisiert Oberflächen sowohl unmodifizierte und DNA-modifizierten SPP erkennt. Das beschriebene Protokoll ist hier anwendbar auf eine Reihe von anorganischen und biologischen Nanopartikel, aber wir demonstrieren das Verfahren DNA-modifizierten Oberflächen aufgrund ihrer breiten Palette von Anwendungen. Die Technik ermöglicht es dem Benutzer, zwischen einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA-Ziele auf einer Nanopartikeloberfläche zu unterscheiden, basierend auf Partikel Translokation Geschwindigkeiten durch ein Porensystem und somit deren Zeta-Potentiale.

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>P4417</td><td>1 Tablette aufgelöst in 200&nbsp; ml deionisiertes Wasser zur Herstellung einer Pufferlösung.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>P1379</td><td>0,05 % (v/v) in PBS-Puffer als Tensid</td></tr><tr><td>Carboxylpolystyrol-Nanopartikel</td><td>Bangs Laboratories, US</td><td>CPC200</td><td>Nenndurchmesser von 220&nbsp; nm, Rohkonzentration von 1 x 1012 Partikel/ml, spezifische Oberflächenladung von 86 &micro; eq/g (entspricht einer Oberflächenladungsdichte von 3,2 x 1019 C/nm2.</td></tr><tr><td>Mit Streptavidin beschichtete Nanopartikel</td><td>Ademtech, Frankreich</td><td>3121</td><td>Batch hatte eine Bindungskapazität von 4.352 pmol/mg (188 nM theoretische DNA-Bindungskapazität) bei einer Rohkonzentration von 1,1 x 1011 Partikeln/ml.</td></tr><tr><td>Biotinylierte Oligonukleotide</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>VC00001</td><td>Lieferantenspezifikation: Reverse Phase 1 Aufreinigung (0,05 Skala); Biotin-Modifikation am 3'-Ende; Lyophilisierte Pulver, rekonstituiert auf 100&nbsp; &Mikro; M mit entionisiertem Wasser und nach Bedarf verdünnt. Sequenzen: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC
GCGTGGC[Btn]</td></tr><tr><td>3'Standard-Olignonukleotide</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>VC00001</td><td>Lieferantenspezifikation: Umgekehrte Phase-1-Reinigung (0,05-Skala); Lyophilisierte Pulver, rekonstituiert auf 100 &; Mikro; M mit entionisiertem Wasser und nach Bedarf verdünnt. Sequenzen von DNA-Zielen: Vollständig komplementär - 5'GCCACGCGTAGTGA
GGTTTAACCAT3', Mittelbindung - 5'GTAGTGAGGT3', Endbindung - 5'GTTTAACCAT3', Teilweise komplementärer Überhang - 5'GTGAGGTTTAACCAT
TTTTTTTTTTTTTTT3".</td></tr><tr><td>Izon qNano</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>Inhärenter Druck auf das System von 47&nbsp; Pa</td></tr><tr><td>Izon Variable Pressure Module (VPM)</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>Jeder "cm" Druck entspricht ca. 100 Pa.</td></tr><tr><td>Polyurethan-Nanoporenmembranen</td><td>Izon Science, NZ</td><td>NP150</td><td>Analytgrößenbereich 60-480 nm, Porendurchmesser berechnet auf 799 nm bei einer Dehnung von 45 mm.</td></tr><tr><td>Magrack 6</td><td>GE Healthcare, Großbritannien</td><td>28-9489-64</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Bath</td><td>Fisher Scientific, Großbritannien</td><td>10692353</td><td>80 Watt</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>IKA, Deutschland</td><td>0003365000</td><td></td></tr><tr><td>Drehrad&nbsp;</td><td>Labnet International, US</td><td>H5500-230 V</td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung des zetapotentials über nanoparticle translokation geschwindigkeiten durch eine tunable nanopore: die verwendung von dna-modifizierten partikel als beispiel

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Nanopore Technologien, die zusammen als Resistive Pulssensoren (RPS) bekannt ist, werden verwendet, um Proteine, Moleküle und Nanopartikel zu erkennen, zu quantifizieren und zu charakterisieren. Tunable resistive Pulserkennung (TRPS) ist eine relativ neue Anpassung an RPS, die einen abstimmbaren Poren enthält, die in Echtzeit verändert werden kann. Hier wir TRPS verwenden , um die Translokation Zeiten von DNA-modifizierten Nanopartikel zu überwachen , da sie die abstimmbaren Porenmembran als Funktion der DNA - Konzentration und Struktur (dh einzelsträngig zu doppelsträngiger DNA) durchqueren. TRPS basiert auf zwei Ag / AgCl Elektroden durch eine elastomere Porenmembran getrennt, die eine stabile Ionenstrom auf ein angelegtes elektrisches Feld aufbaut. Im Gegensatz zu verschiedenen optisch-basierten Partikelcharakterisierung Technologien können TRPS charakterisieren einzelnen Partikel unter einer Probenpopulation, so dass für multimodale Proben mit Leichtigkeit analysiert werden. Hier zeigen wir, Zetapotentialmessungenüber Partikel Translokation Geschwindigkeiten von bekannten Standards und wenden diese Analyten Translokation mal abzutasten, wodurch sich das Zetapotential dieser Analyten zu messen. Sowie Mittel zeta Potentialwerte Erfassen werden die Proben alle unter Verwendung eines Partikel-by-Teilchen Perspektive zeigen weitere Informationen auf einer gegebenen Probe durch die Probenpopulation Verteilungen, zum Beispiel. Von solchen, zeigt dieses Verfahren Potential in Sensoranwendungen für beide medizinischen und ökologischen Bereich.

<img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54577/54577fig1.jpg" /> Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Prozesse der magnetischen Reinigung und einer TRPS Messung. A) Beispiel für magnetische Reinigung von Probe mit einer Probe ausgehend enthält überschüssige, nicht gebundene Einfang - Sonde DNA. B) trpS Meßbeispiel i) Partikel durch die Nanopore vorbei und ii) Blockade Ereignis von Teilchen vorübergehend verschließenden Io...

Hier verwenden wir ein Polyurethan abstimmbaren Nanopore in eine resistive Pulserfassungstechnik integriert Nanoteilchen Oberflächenchemie über die Messung der Partikelgeschwindigkeiten Translokation zu charakterisieren, die verwendet werden können, das Zeta-Potential der einzelnen Nanopartikel zu bestimmen.

Bestimmung des Zetapotentials über Nanoparticle Translokation Geschwindigkeiten durch eine Tunable Nanopore: Die Verwendung von DNA-modifizierten Partikel als Beispiel

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Oberflächenchemie von Nanopartikeln mittels der abstimmbaren resistiven Nanopartikel-Detektion (TRPS) zu charakterisieren und das Zeta-Potential des Materials zu bestimmen. Dies wird anhand der Charakterisierung von DNA-modifizierten Nanopartikeln veranschaulicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bei der Charakterisierung von Nanomaterialien und der Entwicklung von Bioassays zu beantworten.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Sie eine Analyse partikelweise durchführen können. Jedes Signal eines DNA-Partikels wird in eine Zeta-Potential-Messung umgewandelt, wodurch ein vollständiges Bild der untersuchten Probe entsteht. Die älteste Methode konnte Einblicke in die Charakterisierung von Materialien liefern.Es kann auch auf andere Anwendungen angewendet werden, beispielsweise auf die Entwicklung von Bioassays zum Nachweis von Zellen, Viren, DNA und Proteinen. In der Regel haben Anfänger Schwierigkeiten mit dieser Methode, da sie nicht so einfach ist, dass man lediglich die Probe injiziert und dann auf die Antwort wartet. Es ist ein gewisser Beitrag seitens des Wissenschaftlers erforderlich.Um dieses Verfahren zu beginnen, wirbeln Sie die mit Streptavidin beschichteten Partikel 30 Sekunden lang, bevor Sie sie zwei Minuten lang bei 80 Watt beschallen, um eine mono-disperse Verteilung sicherzustellen. Verdünnen Sie die mit Streptavidin beschichteten Partikel im Verhältnis 1:100 in PBST-Puffer, um eine Endkonzentration von 1 × 10⁹ Partikeln pro Milliliter zu erreichen. Anschließend wirbeln Sie die Partikel erneut 30 Sekunden lang.Basierend auf einer Bindungskapazität von 4.352 Pikomol pro Milligramm bei der geeigneten DNA-Konzentration zu den Partikeln für resultierende Konzentrationen von 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 und 210 Nanomolar. Nach dem Vortexen der Proben für 10 Sekunden werden diese 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf ein rotierendes Rad gestellt, um die Bindung der DNA an die Partikeloberflächen über eine Streptavidin-Biotin-Interaktion zu ermöglichen. Sobald die gebundene DNA hinzugefügt und mit den Partikeln inkubiert wurde, wird die überschüssige DNA und Lösung durch magnetische Trennung entfernt, indem die Proben 30 Minuten lang auf einen Magnetrack gestellt werden.Entfernen Sie danach den Überstand, wobei darauf zu achten ist, den neu gebildeten Partikelverbund in der Nähe des Magneten nicht zu stören. Ersetzen Sie anschließend den Überstand durch das gleiche Volumen frischen PBST-Puffers. Geben Sie nun die erforderliche Menge an Ziel-DNA zu jeder Probe hinzu, um sicherzustellen, dass die maximale mögliche Bindung des Targets erreicht wurde.Versetzen Sie die Proben 10 Sekunden lang im Vortex. Stellen Sie sie anschließend 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf das Rotationsrad. Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die überschüssige Ziel-DNA mittels magnetischer Trennung, indem Sie die Proben 30 Minuten lang auf den Magnetständer stellen.Entfernen Sie anschließend den Überstand, wobei darauf geachtet werden muss, den neu gebildeten Partikelcluster, der der Magnetenoberfläche am nächsten liegt, nicht zu stören. Ersetzen Sie dann den Überstand durch das gleiche Volumen frischen PBST-Puffers. Nachdem die vorherigen Schritte für die Duplikatproben wiederholt wurden, stellen Sie die Proben 16 Stunden lang bei Raumtemperatur auf das Rotationsrad, um die DNA-Hybridisierungszeiten zu untersuchen.Schließen Sie zu diesem Zeitpunkt ein TRPS-Gerät an ein Computersystem mit installierter Software an. Messen Sie mithilfe eines Messschiebers den Abstand zwischen den Außenseiten der beiden parallelen Backen. Geben Sie den Abstand im Feld „Stretch“ unter der Registerkarte „Geräteeinstellungen“ ein und klicken Sie unterhalb der Registerkarte auf „Stretch kalibrieren“.Danach seitlich eine Polyurethan-Nanoporenmembran mit geeigneter Größe für die Analyse auf die Backen aufsetzen, wobei die Nanoporen-ID-Nummer nach oben zeigen soll. Anschließend die Backen mit Hilfe des Dehnungsverstellhebels an der Seite des Instruments auf die für die Analyse erforderliche Dehnung ausdehnen. 80 Mikroliter PBST-Puffer in die untere Flüssigkeitszelle unterhalb der Nanopore geben und sicherstellen, dass keine Blasen vorhanden sind, die die Messung beeinträchtigen könnten.Klicken Sie nun die obere Flüssigkeitszelle ein und geben Sie 40 µL Puffer hinzu, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Blasen vorhanden sind. Anschließend platzieren Sie eine Faraday-Käfig über dem System und legen einen externen Druck an, wie im textlichen Protokoll beschrieben. Nachdem 40 µL der Kalibrierpartikel in die obere Flüssigkeitszelle gegeben wurden, führen Sie eine TRPS-Messung bei drei angelegten Spannungen durch.Ändern Sie die Spannung, indem Sie in der Software auf den Plus- und Minus-Button an der Spannungsskala im Register Instrumenteneinstellungen klicken. Prüfen Sie, ob die drei Spannungen die entsprechenden Hintergrundströme liefern. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Kalibrierpartikel bei mittlerer Spannung eine durchschnittliche Blockadegröße von mindestens 0,3 Nanoampere erzeugen.Wenn die im Textprotokoll beschriebenen Bedingungen erreicht wurden, starten Sie den Durchlauf, indem Sie im Reiter „Datenerfassung“ in der Software auf „Start“ klicken. Um die Messung abzuschließen, klicken Sie im Reiter „Datenerfassung“ auf „Stop“ und speichern Sie die Datendatei. Spülen Sie das System, indem Sie mehrmals die Kalibrierpartikel durch 40 µL PBST-Puffer in die oberen Fluidzellen ersetzen.Und durch Anwendung verschiedener Drücke, bis keine Blockadeereignisse mehr auftreten, wodurch sichergestellt wird, dass keine Restpartikel und keine Kreuzkontamination vorhanden sind. Nach Erreichen des geeigneten Basisstroms den Elektrolyten in der oberen Flüssigkeitszelle durch 40 Mikroliter Probe ersetzen. Die Probenmessung starten, indem im Register „Datenerfassung“ auf „Start“ geklickt wird.Zeichnen Sie mindestens 500 Teilchen auf und stellen Sie sicher, dass die Messdauer mindestens 30 Sekunden beträgt. Klicken Sie im Register Datenerfassung auf „Stop“, um die Messung abzuschließen, und speichern Sie die Datendatei. Ein Beispiel für die Größen- und Zeta-Potential-Analyse von mit Streptavidin beschichteten Teilchen ohne Modifikationen sowie von mit Streptavidin beschichteten Teilchen, die an der Oberfläche mit einzelsträngiger DNA gesättigt sind, ist hier dargestellt.Obwohl beide Proben eine ähnliche Größe aufwiesen, war das Zetapotential signifikant unterschiedlich und deutlich größer, wenn DNA an die Partikeloberfläche gebunden war. Die hier dargestellten Größen- und Zetapotentialdaten beziehen sich auf Proben mit der niedrigsten und höchsten Konzentration an an die mit Streptavidin beschichteten Partikel hybridisierter DNA. Ein größerer Zetapotentialwert wird für Partikel registriert, die mit einer höheren DNA-Konzentration hybridisiert wurden.Die hier gezeigte Änderung des Zeta-Potentials wurde für die reine Erfassung von DNA-Sonden, eine vollständig komplementäre DNA-Zielsequenz, eine mittlere Bindungs-DNA-Zielsequenz, eine End-Bindungs-DNA-Zielsequenz und eine überstehende DNA-Zielsequenz gemessen. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von 20 Minuten durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, einen Nanopflock zwischen jeder Kalibrierung und jeder Probe gründlich zu waschen, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben auszuschließen und ein Verstopfen des Nanopflocks zu verhindern.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Biosensoren den Weg, um Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen in Multiplex-Assays zu untersuchen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Zeta-Potential mittels TRPS bestimmt und DNA-modifizierte Partikel für Bioassays vorbereitet.

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Eine Methode der Verwendung von Solid-State-Nanoporen, die unspezifische Adsorption von Proteinen auf einer anorganischen Oberfläche überwachen beschrieben. Die Methode nutzt die resistive-Puls-Prinzip, so dass für die Adsorption in Echtzeit und in der Einzel-Molekül-Ebene untersucht werden. Da der Prozess der einzelnen Protein-Adsorption ist fern vom Gleichgewicht, schlagen wir den Einsatz von parallel Arrays von synthetischen Nanoporen, so dass für die quantitative Bestimmung der scheinbaren...

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Ein Protokoll für Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) und High-Throughput-Durchflusszytometrie, polymere Gentransfer Nanopartikel evaluieren beschrieben. NTA eingesetzt wird, um die Nanopartikel Teilchengrößenverteilung und das Plasmid pro Teilchenverteilung charakterisieren. High-throughput Durchflusszytometrie erlaubt die quantitative Transfektion Wirksamkeitsnachweis für eine Bibliothek der Gentransfer Biomaterialien.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Eine Methodik zur Herstellung von Festkörper-Nanoporen in Lösung für biomolekulare Translokation Experimente vorgestellt. Durch Anlegen kurzer Impulse hoher elektrischer Felder kann die Nanoporendurchmesser steuerbar mit Sub-Nanometergenauigkeit vergrößert und seine elektrischen Rauscheigenschaften deutlich verbessert. Dieses Verfahren wird in situ unter Verwendung von Standard-Laborausrüstung unter experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Feinabstimmung der Größe und Minimierung der Lärm von Solid-State-Nanoporen

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Analyse des Membranprotein-vermittelten Transports auf Einzeltransporterebene unter Verwendung von porenübergreifenden, lösungsmittelfreien Lipiddoppelschichten. Dies wird durch die Herstellung von in großen Mengen hergestellten Nanoporen-Array-Chips in Kombination mit einer hochparallelen Datenerfassung und -analyse erreicht, die die zukünftige Etablierung von Membranprotein-Effektor-Screenings ermöglicht.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Wir schlagen eine einfache Selbstorganisationstechnik von kolloidalen Siliziumdioxid-Nanopartikeln vor, um eine nanofluidische Verbindung zwischen zwei Mikrokanälen in Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erzeugen. Mit dieser Technik wurde eine nanoporöse Kügelchenmembran mit einer Porengröße von bis zu ~45 nm in einem Mikrokanal aufgebaut und auf die elektrokinetische Vorkonzentration von DNA-Proben aufgebracht.

Erstellen von Unter 50 Nm nanofluidische Junctions in PDMS mikrofluidischen Chip über Selbstorganisation von kolloidalen Teilchen

Semiflexiblen Polymere zeigen einzigartige mechanische Eigenschaften, die ausgiebig von Lebewesen angewendet werden. Systematische Studien über Biopolymere sind jedoch beschränkt, da Eigenschaften wie Polymer Steifigkeit nicht zugänglich sind. Dieses Manuskript wird beschrieben, wie diese Einschränkung durch programmierbare DNA-Nanoröhren, experimentelle Studien über die Auswirkungen der Glühfaden Steifigkeit ermöglicht umgangen wird.

DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von magnetischen Partikeln und Bewertung ihrer DNA-bindende Eigenschaften über dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung. Diese Methode konzentriert sich auf die Überwachung von Änderungen der Partikelgröße, ihre Polydispersität und Zeta-Potential der Partikeloberfläche die spielen wichtige Rolle bei der Bindung von Materialien wie DNA.

DNA-Magnetpartikel verbindlich Analyse durch dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Detektion diskreter Metallsauerstoffcluster, Polyoxometallate (POMs) an der Grenze zu einzelnen Molekülen, mithilfe einer biologischen Nanoporen-basierten elektronischen Plattform vor. Die Methode bietet einen komplementären Ansatz zu traditionellen analytischen Chemiewerkzeugen, die bei der Untersuchung dieser Moleküle verwendet werden.

Physikalische Charakterisierung einzelner metallischer Nanopartikel in hoher Auflösung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Fertigung einer Elektrode geschlossen Typ drahtlose Nanopore und elektrochemische Folgebewertung des einzigen Nanopartikel Kollisionen.

Eine geschlossene drahtlose Nanopore Elektrode für die Analyse von einzelnen Nanopartikel

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Plasmonische Nanopinzetten nutzen die lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz in Goldnanostrukturen, um einzelne Nanopartikel, einschließlich Proteine, in einem optischen Feld im Nanometerbereich einzufangen. Veränderungen im Streusignal zeigen das Vorhandensein von Proteinen und die Konformationsdynamik und ermöglichen eine Überwachung ohne Fluorophormodifikationen oder Oberflächenbindung.

Überwachung der Konformationsdynamik einzelner unmodifizierter Proteine mit einer plasmonischen Nanopinzette

Erfahren Sie die Charakterisierung der Oberflächenchemie von Nanopartikeln mittels TRPS zur Bestimmung des Zetapotentials. Diese Methode ermöglicht die partikelweise Analyse DNA-modifizierter Nanopartikel.

Bestimmung des Zetapotentials über Nanoparticle Translokation Geschwindigkeiten durch eine Tunable Nanopore: Die Verwendung von DNA-modifizierten Partikel als Beispiel (Video) | JoVE Journal

Bestimmung des Zetapotentials über Nanoparticle Translokation Geschwindigkeiten durch eine Tunable Nanopore: Die Verwendung von DNA-modifizierten Partikel als Beispiel

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