Ein In Vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen bei der Interaktion mit aktivierten T-Zellen zu untersuchen. Diese Methode hilft bei der Beantwortung wichtiger Fragen im Bereich der Neuroimmunologie, z. B. wie sich die direkte Interaktion zwischen T-Zellen und Endothelzellen auf die Integrität und Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke auswirkt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine automatisierte Echtzeit-Bewertung der Barrierefunktion bei gezielter Modulation der Interaktion zwischen T-Zellen und Endothelzellen ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Autoimmunerkrankungen des ZNS, da sie Einblicke in den durch T-Zellen vermittelten Abbau der Blut-Hirn-Schranke bietet, ein entscheidender Schritt in die Pathogenese solcher Krankheiten. Diese Methode konzentriert sich auf die Eigenschaften der marinen Blut-Hirn-Schranke während der EAE. Es kann aber auch auf Modelle der roten oder menschlichen Blut-Hirn-Schranke sowie auf Studien zu anderen autoimmunen ZNS-Erkrankungen angewendet werden.

Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund möglicher Schwierigkeiten mit dem optimalen Timing der kombinierten primären Endothelzellkultur und der T-Zell-Aktivierung Schwierigkeiten haben. Wir haben diese Methode erstmals entwickelt, als wir uns aufmachten, die Auswirkungen verschiedener T-Zell-Aktivierungsniveaus auf die Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke während der EAE, einem Tiermodell der Multiplen Sklerose, zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Einrichtung von T-Zell- und Endothelzell-Cokulturen schwer zu erlernen ist, da anfängliche Schwankungen des T-Werts zwischen den Vertiefungen zu späteren Fehldarstellungen der Ergebnisse führen können.

Um dieses Verfahren zu beginnen, beschichten Sie die durchlässigen Einsätze am fünften Tag nach der MBMEC-Isolierung mit 80 Mikrolitern MBMEC-Beschichtungslösung pro Einlage. Inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nachdem Sie die MBMEC-Beschichtungslösung von den Einlegeeinsätzen entfernt haben, waschen Sie MBMECs, indem Sie zwei Milliliter PBS bei Raumtemperatur in jede Vertiefung geben und nach einer Minute ansaugen, und wiederholen Sie diesen Vorgang dann erneut.

Fügen Sie anschließend 0,05 % Trypsin EDTA in einer Menge von 300 Mikrolitern pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie es fünf bis zehn Minuten lang. Geben Sie anschließend zwei Milliliter MBMEC-Medium in jede Vertiefung, um die Trypsinisierung zu stoppen. Übertragen Sie dann die gesammelten Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugationsröhrchen und zentrifugieren Sie die Probe acht Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 700 mal g.

Nach acht Minuten wird der Überstand verworfen und die Zellen in einem Milliliter MBMEC-Medium ohne Puromycin resuspendiert. Um die Zellen zu zählen, mischen Sie 90 Mikroliter 0,04% Trypanblau. Pipettieren Sie mit 10 Mikrolitern Zellsuspension 10 Mikroliter der Mischung zwischen dem Glasdeckel und dem Hämozytometer.

Geben Sie dann zwei mal 10 an die vierte zelle pro insert ab. Geben Sie 810 Mikroliter MBMEC-Medium in das untere Fach jeder Vertiefung und legen Sie die Platte mit den Einsätzen in den Inkubator, bis Sie mit der TEER-Messung fortfahren können. Um CD4-positive T-Zellen zu stimulieren, beschichten Sie eine 96-Well-Platte mit rundem Boden mit gereinigtem Anti-Maus-CD3-Antikörper in einer gewünschten Endkonzentration für drei Stunden bei 37 Grad Celsius.

Nach der Isolierung der T-Zellen wird die vorbeschichtete Platte zweimal mit PBS gewaschen. Geben Sie anschließend gereinigte Anti-CD28-Antikörper in einer gewünschten Endkonzentration zu den isolierten T-Zellen und mischen Sie sie gut. Geben Sie dann die T-Zellen ab und lassen Sie sie zwei bis drei Tage lang bei 37 Grad Celsius.

Um die TEER-Messung einzurichten, setzen Sie das 24-Well-Modul des TEER-Instruments in die Laminar-Flow-Haube ein. Nehmen Sie die Deckel ab und setzen Sie die Einsätze mit MBMECs mit einer Pinzette in das Instrument ein. Pipettieren Sie anschließend 810 Mikroliter des frischen Mediums in das untere Fach der Modulvertiefungen und fügen Sie es vorsichtig zwischen dem Einsatz und der Wand der Modulvertiefung hinzu.

Schließen Sie danach die Deckel und legen Sie das Instrument in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät an den Computer an. Schalten Sie dann den Gerätecontroller ein und öffnen Sie die Software.

Wählen Sie im Popup-Fenster die Kontrollkästchen Neue Messung, "Aktivieren Sie die Option "TER anzeigen" und "Ccl" aus. Drücken Sie dann auf Start. Wählen Sie nach Abschluss der ersten Messung auf der Registerkarte "Ergebnisse" die Option "Alle Wells überprüfen" aus, um alle TEER- und Ccl-Werte anzuzeigen.

Speichern Sie dann die Datei. Wählen Sie als Nächstes den Zeitpunkt für die Co-Kultivierung von MBMECs mit T-Zellen, wenn Ccl stabil und niedriger als ein Mikrofarad pro Quadratzentimeter ist und TEER seinen Höchstwert erreicht hat. Überprüfen Sie die absoluten TEER- und Ccl-Werte sorgfältig und schließen Sie die Vertiefungen aus, in denen MBMECs keine ausreichend konfluenten Monoschichten entwickelt haben, indem Sie die Häkchen bei solchen Vertiefungen entfernen.

Gruppieren Sie die restlichen Vertiefungen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Vertiefungen klicken und Bohrloch zu neuem durchschnittlichen Bohrloch hinzufügen auswählen"Benennen Sie es im Popup-Fenster, und machen Sie dasselbe für alle einzelnen Bohrungen, die gruppiert werden sollen. Überprüfen Sie dann alle durchschnittlichen Vertiefungen, um sicherzustellen, dass alle die gleichen Anfangsbedingungen vor der Co-Kultur haben. Drücken Sie auf der Registerkarte "Experiment" auf Pause.

Trennen Sie das Gerät und nehmen Sie es aus dem Inkubator. Entfernen Sie dann die Deckel in der Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie anschließend einen Teil des Mediums aus dem Einsatz im oberen Vertiefungsfach.

Fügen Sie T-Zellen zu MBMECs hinzu, indem Sie vorsichtig 150 Mikroliter Medium pipettieren. Schließen Sie dann das Gerät wieder an und drücken Sie auf Messung fortsetzen. Drücken Sie nach 24 Stunden auf der Registerkarte "Experiment" auf "Stopp" und speichern Sie die Datei.

Hier ist die spindelförmige Morphologie in der Immunfluoreszenzfärbung von PECAM-1 und Cldn-5 fünf Tage nach der MBMEC-Isolierung dargestellt. Hier sind die TEER- und Ccl-Werte vor und nach der Gruppierung einzelner Wells vor der Zugabe von T-Zellen. Die blaue Kurve wird für das Experiment nicht verwendet, da die MBMECs in dieser Vertiefung den TEER nicht so hoch entwickelt haben wie in anderen Vertiefungen.

In diesem Experiment wurden markierte 35 bis 55 spezifische CD4-positive T-Zellen fünf Tage lang antigenspezifisch stimuliert. Naive T-Zellen und proinflammatorische Zytokine, Interferon gamma und TNF-alpha dienten als Negativ- bzw. Positivkontrolle. Hier wurden T-Zellen mit der gleichen Menge an Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern stimuliert, und diejenigen, die drei Tage lang kultiviert wurden, zeigten eine größere Neigung zur Störung der Barriere als die T-Zellen, die nur zwei Tage lang kultiviert wurden.

Die Ergebnisse zeigen, dass stimulierte T-Zellen, aber nicht ihre Überstände, eine erhebliche Schädigung der MBMECs verursachten, was darauf hindeutet, dass der direkte Kontakt zwischen T-Zellen und MBMECs entscheidend für die Störung der Barriere ist. Auf der anderen Seite stellte die Zugabe von Granzym-b-Inhibitor zwei zur T-Zellkultur die MBMEC-Integrität in größerem Maße wieder her, was darauf hindeutet, dass das zytolytische Molekül eine wichtige Rolle bei der Verursachung von MBMEC-Schäden und der anschließenden Abnahme der TEER spielt. Einmal gemeistert, kann dieses Experiment in 12 Tagen durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den richtigen Zeitpunkt für die Einrichtung der Co-Kultur von T-Zellen und Endothelzellen zu wählen.

Nach diesem Verfahren können andere Aufsätze verwendet werden, wie z. B. Immunfluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie und Wahrscheinlichkeitsaufsätze. Um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. Wie wirkt sich diese Wechselwirkung auf die Expressionspermeabilität von Tight-Junction-Molekülen und das Ausmaß der T-Zell-Transmigration aus? Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neuroimmunologie den Weg, Autoimmunerkrankungen des ZNS bei Mäusen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie die direkten Auswirkungen zwischen aktivierten T-Zellen und Endothelzellen in Bezug auf die Integrität und Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke beurteilen können.