Mit Multi-fluorierten Bile Acids und

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Gallensäuren mit natürlich vorkommendem, nicht radioaktivem Fluor zu markieren, um deren Konzentration im Gallenblasen mittels MRT zu messen und so den Gallensäuretransport in lebenden Tieren zu untersuchen. Dieser Ansatz bietet das Potenzial, Personen mit chronischem Durchfall zu identifizieren, die aufgrund einer Gallensäure-Malabsorption behandelt werden sollten. Die wesentlichen Vorteile dieses Ansatzes liegen darin, dass keine Exposition gegenüber ionisierender Strahlung erforderlich ist und dass er eine hohe Übertragbarkeit sowohl für die klinische Forschung als auch für die klinische Praxis besitzt.

Die Idee zu dieser Methode entstand, als uns bewusst wurde, dass es in den Vereinigten Staaten keine praktischen klinischen Tests zur Erkennung einer gestörten intestinalen Gallensäuretransportfunktion gibt. Füllen Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Spritze mit dem geeigneten Volumen der fluorhaltig markierten Gallensäure-Stammlösung und befestigen Sie eine 20-Gauge-, 1,5-Zoll-, gebogene Magensonde mit Kugelspitze. Greifen Sie dann mit Daumen und Zeigefinger das Maus hinter dem Nacken an der losen Haut fest und mit den übrigen Fingern die Haut am unteren Rücken und am Schwanz.

Halten Sie das Tier aufrecht und führen Sie die Magensonde entlang der Seiten- und Gaumenseite in die Speiseröhre und weiter in den Magen ein. Zum geeigneten experimentellen Endpunkt hin führen Sie einen medianen Bauchschnitt durch die Haut vom Schambein bis zum Xiphoid fort, gefolgt von einem entsprechenden Schnitt durch das Peritonealepithel, um die Bauchorgane freizulegen, ohne das Zwerchfell zu verletzen. Heben Sie anschließend mit einer fünf Zoll langen Klemme den Xiphoidfortsatz an, um die obere Bauchhöhle freizulegen.

Unter Verwendung von Pinzette und einem stumpfen Instrument die Leber dissezieren und beiseite bewegen, um die Gallenblase freizulegen. Anschließend eine vier Zoll lange Klemme über den Ductus choledochus legen und das Ligament durchtrennen, das den oberen Pol der Gallenblase mit dem Zwerchfell verbindet, sodass die Gallenblase zur rechten Seite der Bauchhöhle verlagert werden kann. Sorgfältig vorgehen und den Ductus choledochus so bald wie möglich nach der Laparotomie klemmen, um eine Verletzung der Leber oder ein unbeabsichtigtes Leerlaufen der Gallenblase zu vermeiden.

Nach der Exsanguination das gewonnene Blut in ein 1,5-Milliliter-Heparinröhrchen zur Zentrifugation überführen. Das Plasma mit vier Teilen Acetonitril ausfällen und die Blutprobe erneut zentrifugieren. Anschließend den Überstand mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektroskopie analysieren.

Um die Gallenblase freizulegen, wird das umgebende Gewebe stumpf disseziert und anschließend der Ductus choledochus unterhalb der Klemme durchtrennt. Wiegen Sie die gewonnene Gallenblase, geben Sie das Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie die Leber. Zum Extrahieren der Gewebe geben Sie 75 % Acetonitril und 25 % Wasser hinzu und homogenisieren etwa 100 Milligramm der Leber sowie die gesamte Gallenblase einzeln in 21 Glas-Gewebemörsern auf Eis.

Überführen Sie die Proben in ein 1,5-Milliliter-Eppendorf-Gefäß und zentrifugieren Sie diese. Verdünnen Sie anschließend die Extrakte entsprechend und quantifizieren Sie den Gehalt an Gallensäuren mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektroskopie. Zum geeigneten experimentellen Zeitpunkt reinigen Sie die innere linke Oberschenkelregion der anästhesierten Maus und führen einen 24-Gauge-mal-0,75-Zoll-Nadelkatheter subkutan durch den Oberschenkel in die Bauchhöhle ein.

Entfernen Sie die Nadel und lassen Sie den intraperitonealen Katheter an Ort und Stelle. Überführen Sie die Maus auf die Tierliege des MRT-Scanners und befestigen Sie eine temperaturgesteuerte Wärmematte. Schließen Sie den Katheter an ein 72 Zoll langes Stück steriler Schlauchleitung an und verbinden Sie die Leitung mit einer sterilen 1-Milliliter-Spritze, um die Anästhesie während des gesamten Verfahrens aufrechtzuerhalten.

Nachdem bestätigt wurde, dass sich keine Metalle in der Nähe des Scanners befinden, verwenden Sie eine dualabgestimmte lineare Volumen-MRT-Spule für Fluor und Protonen, um die Hochfrequenzsignale zu senden und zu empfangen. Verwenden Sie anschließend eine schnelle Low-Angle-Shot-Sequenz, um dreischichtige Kopfhautbilder zu erhalten, um das System zu kalibrieren und die Position des Tieres zu überprüfen. Um das Experiment zu starten, klicken Sie auf die Ampel-Schaltfläche, um mehrschichtige Protonen-Magnetresonanzbilder mittels der Rapid-Acquisition-with-Relaxation-and-Enhancement-Sequenz im Querschnitt des Probenstücks aufzuzeichnen.

Klicken Sie abschließend im Steuerungsfenster des Spektrometers auf die GOP-Taste, um Fluor-Bilder mithilfe einer zweiten schnellen Low-Angle-Shot-Sequenz in derselben Region aufzuzeichnen. Mit dieser Methode kann eine hochselektive Konzentration von mehrfachfluorierten Gallensäuren, oder MFBA, in der Gallenblase gemessen werden, die um eine Größenordnung von tausendfach höher liegt als die in Leber oder Plasma beobachteten Werte, was nicht mit physiologischen Gallensäurekonzentrationen vereinbar ist. Wie für die physiologische Verbindung des enterohepatischen Kreislaufs von Gallensäuren erwartet, sind die maximalen Konzentrationen von MFBA in der Gallenblase vier bis sieben Stunden nach oraler Gabe erkennbar.

Tatsächlich werden zweiinhalb bis vier Stunden nach oraler Gabe von MFBA Fluor-Signale detektiert, die scheinbar aus dem Ductus choledochus stammen, sowie ein stärkeres Signal aus der Gallenblase. Sieben bis achtinhalb Stunden später ist das Signal des Ductus choledochus nicht mehr nachweisbar, und das Fluor-Signal der Gallenblase steigt auf dieselbe Intensität wie das Signal aus dem benachbarten MFBA-Phantom an. Bei Mäusen mit Defizit des apikalen, natriumabhängigen Gallensäuretransporters, die eine verminderte intestinale Aufnahme von Gallensäuren aufweisen, tritt im Vergleich zu kontrollierten Wildtyp-Tieren eine etwa 22-fach reduzierte Konzentration von MFBA auf.

Tatsächlich wird ein starker Fluor-Signal in den Gallenbläschen von Wildtyp-Mäusen nachgewiesen, während bei Tieren mit Defizit des apikalen, natriumabhängigen Gallensäuretransporters kein entsprechendes Fluor-Signal zu beobachten ist, was bestätigt, dass MFBA ähnlich wie physiologische Gallensäuren verarbeitet werden und dass die MFBA-MRT zur Detektion einer beeinträchtigten intestinalen Aufnahme von Gallensäuren eingesetzt werden kann. Sobald die Technik beherrscht und korrekt durchgeführt wird, können die Laparotomie, die Blutentnahme sowie die Inzision von Gallenblase und Leber innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen werden. Die Signalerfassung während der MRT dauert anderthalb bis zwei Stunden.

Nach ihrer Entwicklung und kommerziellen Einführung könnte diese Technik den Weg für die Erforschung der Rolle des intestinalen Gallensäuretransports in der Physiologie und bei Erkrankungen sowohl bei kleinen Tieren als auch beim Menschen ebnen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man markierte Gallensäuren bei kleinen Tieren verabreicht und deren Aufnahme in Leber und Gallenblase mittels MRT oder Organpräparation misst.