Name: Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Reprogrammierung von Maus-Fruchtwasserzellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Transposon-System. Diese nicht-virale Methode ermöglicht patientenspezifische Therapien vor der Geburt.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die CARIPARO Stiftung Stipendium Nummer 13/04 und die Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Stipendium Nummer 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin und Michela Pozzobon werden von der Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza gefördert. Enrica Bertin wird durch die CARIPARO Stiftung Fördernummer 13/04 gefördert. Paolo De Coppi wird von der Great Ormond Street Hospital Children's Charity finanziert.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem italienischen Gesetz. Murine AF-Proben wurden von schwangeren Mäusen bei 13,5 Tage nach coitum (DPC) von C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J-Mäuse genannt GFP geerntet. 1. Transposon Produktion HINWEIS: Transposon-Expressionsvektoren wurden unter Verwendung von Standard-Klonierungsverfahren erzeugt. Die Plasmid-DNA für Maus AF-Zellen Transfektion wurde mit kommerziellen Kits bereit. <ol><li> Mischungs 10 ng der Plasmid-DNA mit 50 ul DH5a Bakterien in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 20 min. </li><li> Hitzeschock bei 42 ° C für 40 sec. </li><li> Legen Sie Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 2 min. </li><li> Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; l vorgewärmtes (37 ° C) LB-Medium (LB) Brühe. Schütteln (300 rpm) bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Verbreiten 30 ul jeder Transformation auf LB-Platten mit 0,1 mg / ml Ampicillin. Platten erlauben zu trocknen und inkubieren bei 37 ° C ov invertierternight. </li><li> Am nächsten Tag, am Nachmittag, Pick 3 Kolonien mit sterilen 200 ul-Tipps, von jeder Transformation und Übertragung auf 0,1 mg / ml LB amp. </li><li> Schütteln (300 rpm) Bakterien über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Für Plasmidaufreinigung kommerzielle Kits verwenden. Stock Plasmiden bei -20 ° C. </li></ol> 2. Maus embryonale Fibroblasten (MEF) Kultur <ol><li> Die Beschichtung der 6-Well - Platten mit 0,1% Gelatine <ol><li> Coat Platten unter der Haube Zugabe von 1 ml steriler 0,1% Gelatine auf jede der sechs Bohrungen. Lassen Sie die Gelatine auf dem Inkubator (37 ° C) für 1 h polymerisieren. </li><li> Entsorgen Sie das überschüssige, und trocknen Sie die Platten für 1 Stunde. </li><li> Verwenden Parafilm abgedichtet und Speicherplatten bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Die Inaktivierung von MEF mit Mitomycin C <ol><li> Tauen Sie ein Fläschchen mit 4 x 10 6 MEF - Zellen ein 37 ° C - Bad verwenden. </li><li> Seed MEF in der Haube auf einer Petrischale (150 mm) mit MEF Medium. </li><li> Kultivieren Zellen , bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> (Vorsicht) hinzufügen Mitomycin C (5 mg / ml), wenn die Zellen konfluent sind. </li><li> Ortszellen in einen Inkubator (37 ° C und 5% CO 2) für 3 h. </li><li> Entfernen Mittel mit Mitomycin C. Wasche die Zellen dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> 2 ml der kommerziellen Trypsin und Ortszellen in das 37 ° C-Inkubator für 5 min. Nach dem Fügen Sie 18 ml Medium der Blockierung der Trypsin Reaktion zu stoppen. </li><li> Zähle die Zellen mit einem Burker-Kammer unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 145 xg für 5 min. Überstand verwerfen. </li><li> Seed 60.000 Zellen / cm 2 von inaktivierten MEF auf 0,1% Gelatine beschichtete Platten. </li><li> Kultivieren Zellen für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2, vor der Aussaat AF und / oder iPS-AF - Zellen. </li></ol></li></ol> 3. Maus AF Zellisolierung <ol><li> Richten Sie timed Paarungen und prüfen vaginale plugs nach 24 h co-Gehäuse. </li><li> Beachten Sie, bis 13,5 dpc und Opfer schwanger Damm durch Genickbruch. </li><li> Reinigen Sie die Bauchdecke des Tieres unter Verwendung von 70% igem Ethanol. </li><li> Mit einer Schere, führen Sie eine Mittellinie Laparotomie die Länge der Bauchdecke Einschneiden Zugang in die Bauchhöhle zu gewinnen. </li><li> Setzen Sie die Gebärmutter mit einer Pinzette. Entfernen Sie die Gebärmutter Schere und Transfer in eine 100 mm Petrischale mit gefüllt mit sterilem 1x PBS auf Eis gestellt. </li><li> Verwenden Sie ein Stereomikroskop die AF bei 10-facher Vergrößerung zu sammeln. </li><li> Halten Sie die Gebärmutter mit einer Zange und entfernen Sie die Gebärmutterwand mit einer Schere. Seien Sie vorsichtig, um eine Beschädigung der fötalen Membranen und damit Fruchtwasser Leckage zu vermeiden. </li><li> Sammeln Sie Föten in eine 100 mm Petrischale gefüllt mit sterilem 1x PBS und auf Eis. </li><li> Fassen Sie die Plazenta eines Fötus mit einer feinen Spitze Zange und in einem sauberen 100 mm Petrischale. </li><li> Entfernen Sie den Dottersack feinen Spitze einer Pinzette. </li><li&gt; Disrupt die Eihaut feinen Spitze einer Pinzette und für jeden Fötus 30 ul AF sammeln eine Insulin-Spritze in einem 15 ml konischen Fläschchen mit. </li><li> Nach AF Sammlung, wasche jeden Fetus mit sterilem 1x PBS, ergänzt mit 1% fötalem Rinderserum (FBS) und zu sammeln in die 15 ml konischen Röhrchen die AF enthält. </li><li> Zentrifuge AF bei 145 xg für 5 min. Entfernen Sie den Überstand unter der Haube und das Seeding von pelletierten AF-Zellen. </li></ol> 4. Maus AF Zellkultur <ol><li> Seeding von Maus - AF - Zellen <ol><li> Einen Tag vor der Aussaat vorbereiten eine 0,1% Gelatine beschichtete 6-Well-Platte mit Mitomycin C-behandelten MEF. </li><li> Nach dem AF - Sammlung, Samen , die von einer Amniozentese gewonnenen Zellen auf die mitotisch inaktivierten MEF unter Verwendung von AF - Kulturmedium (etwa 1 x 10 7 Zellen aus 6 Föten gewonnen). </li><li> Kultivieren Zellen , bei 37 ° C und 5% CO 2, Ändern des Mediums jeden zweiten Tag. </li><li> Nach 7 Tagen Kultur, transfekt AF-Zellen nach dem unten beschriebenen Verfahren. </li></ol></li></ol> 5. Transfektion, iPS-AF Zellgeneration und Kultur HINWEIS: Mouse AF-Zellen wurden mit dem PB-tetO2-IRES-OKMS Transposon-Plasmid transfiziert, in Verbindung mit einem Transposase-Expressionsplasmid (mPBase) und mit dem Rückwärts Tetracyclin-Transaktivator (PB-CAG-rtTA) Transposon-Plasmid. Alle Plasmide wurden von Professor Andras Nagy 33 zur Verfügung gestellt. <ol><li> Mix 1 &amp; mgr; g PB-tetO2-IRES-OKMS mit 0,5 ug mPBase und 0,5 &amp; mgr; g PB-CAG-rtTA (Gesamt DNA: 2 &amp; mgr; g) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Verdünne die DNA auf 100 &amp; mgr; l mit serumfreiem Medium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium - DMEM). </li><li> Aus 8 &amp; mgr; l des Transfektionsreagenz (zB Fugene) (im Verhältnis von Plasmid - DNA: Transfektionsmittel von 2 &amp; mgr; g (DNA) bis 8 &amp; mgr; l Transfektionsmittel) in die 1,5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen , das DNA. </li><li> Inkubieren Transfektionsreagenz / DNA Gemisch 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Tropfenweise 100 ul des Transfektionsreagenz / DNA-Gemisch pro Vertiefung einer 6-Well-Platte mit AF-Zellen der Maus und verteilen leicht schwenken, mit einem Gesamtvolumen von 2 ml / Vertiefung. Lassen Sie für 24 Stunden. </li><li> Am Tag danach induzieren die Expression des Yamanaka Faktoren (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2), indem die Zellen mit frischem iPS-AF-Medium mit 1,5 ug / ml Doxycyclin (2 ml Medium für jede Vertiefung) ergänzt Fütterung. </li><li> Feed-Zellen jeden Tag, ohne Durchgang, mit frischen Dox-haltiges Medium (halten Zellen in Medien, ergänzt mit Doxycyclin, bis der Punkt 5.13). </li><li> Beobachten Zellen innerhalb von 24 h für mCherry Expression und täglich für die Koloniebildung (Kolonien erscheinen typischerweise zwischen 20 und 30 Tage nach der Transfektion). </li><li> Einen Tag vor der Kolonie Kommissionierung, bereiten eine 96-Well-Gewebekulturplatte mit Mitomycin C-behandelten MEF. </li><li> Wählen Sie einzelne Kolonien in 50 ul Volumen usinga 200 ul Pipette, und übertragen sie nacheinander in eine 96-Well-Platte in den einzelnen Vertiefungen. </li><li> Am Tag nach distanzieren jede Kolonie in einzelne Zellen von 50 &amp; mgr; l des kommerziellen Trypsin Zugabe und für 5 min bei 37 ° C inkubiert. </li><li> Pipette nach oben und unten die Kolonie aufzuschlüsseln. </li><li> Transfer 50 ul des Trypsins das dissoziierte Kolonie in eine neue gut mit inaktivierten MEF auf einem 0,1% Gelatine 96 Well-Platte mit 100 &amp; mgr; l frischem iPS-AF-Medium, ergänzt mit Doxycyclin gefüllt beschichtet enthält. </li><li> Wenn die Zellen 60-70% Konfluenz erreichen, aufgeteilt in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. </li><li> Wenn die Zellen 60-70% Konfluenz erreichen, geteilt 1: 2 bis zwei Brunnen, eine mit Doxycyclin und das andere ohne Doxycyclin, um zu überprüfen, ob Kolonien auch in dem Zustand ohne Doxycyclin erscheinen. </li><li> Weiter iPS-AF-Klone zu erhalten, Doxycyclin unabhängig, auf inaktivierten MEF in der iPS-AF Medium. </li><li> Kultivieren Zellen , bei 37 ° C und 5% CO 2, CHtäglich Anging Medium. </li></ol> 6. Alkalische Phosphatase-Färbung <ol><li> Führen alkalischen Phosphatase-Färbung gemäß dem Protokoll des Herstellers, wenn es das Auftreten von Doxycyclin unabhängigen iPS-AF-Zellen ist. </li></ol> 7. Immunofluoreszenz <ol><li> Immer , wenn es das Auftreten von Doxycyclin unabhängigen iPS-AF - Zellen, 150.000 Zellen / cm 2 auf eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen mit inaktivierten MEF Samen und wachsen Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> (Vorsicht) Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 300 &amp; mgr; l pro Vertiefung von 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen von 300 ul 0,1% NP-40-Zellen zu permeabilisieren. </li><li> Spülen Sie die Zellen mit 300 ul 0,1% PBS-Tween 20. </li><li> Hinzufügen von 300 &amp; mgr; l Blockierungspuffer (10% Pferdeserum in 1x PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Verwenden Sie die folgenden primären Antikörper: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) und SSEA1 (1:80). Verdünnte SSEA1 mit 1% Rinderserumalbumin (BSA), 10% normales Ziegenserum, 0,3 M Glycin in 0,1% PBS-Tween-20. Verdünne alle anderen Antikörper mit 10% Pferdeserum in 1x PBS. </li><li> Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Spülen Sie mit 300 ul 0,1% PBS-Tween-20. </li><li> Verwenden Sie die Sekundär in 10% Pferdeserum verdünnt Antikörper in 1x PBS: Alexa594-konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG (1: 200), Alexa594-konjugierten Huhn anti-Ziege IgG (1: 200), Alexa594-konjugierten Huhn anti-Kaninchen-IgG (1: 200), Alexa568-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgM (1: 200). Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie mit 1x PBS. </li><li> Stain Kerne mit Hoechst-Lösung (1: 10.000) in 1x PBS. </li></ol> 8. In - vitro - Zelldifferenzierung <ol><li> hängenden Tropfen Embryoidkörpern (EVG) zu bilden, einzelne Tropfen (2000 Zellen / 20 ul) auf den Deckel der Petrischalen, mit dem Differenzierungsmedium kultivieren. </li><li> Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° Cund 5% CO 2 für 4 Tage. </li><li> Übertragen EBs in 100 mm Bakterien-Grade-Gerichte in der Suspensionskultur für 3 Tage in Differenzierungsmedium. </li><li> Platte EBs in 24-Well-Platten mit Basalmembranmatrix beschichtet (1:10 verdünnt in DMEM) für weitere 14 Tage. </li><li> Für die Immunfluoreszenzanalysen verwenden primäre Antikörper: T (1: 100), αfp (1: 200) und Tubb3 (1: 500) 37. </li></ol> 9. In Vivo Teratoma Formation <ol><li> Injizieren von 100 &amp; mgr; l 1x PBS , enthaltend 1 x 10 6 iPS-AF - Zellen in den Muskel der Hinterlauf von Rag2 - / - yc - / - Mäusen. </li><li> Sacrifice Mäuse durch Genickbruch 6 Wochen nach der Zellinjektion. </li><li> Entfernen Sie die Tumormassen, die sich durch ihre Größe von der hinteren Gliedmaßen der Mäuse für die folgenden Analysen. </li><li> Schneiden Sie 7-10 um dicke Querschnitte des Isopentan gefrorenen Tumor unter Verwendung eines Kryostats. </li><li> Für Hämatoxylin eind Eosin (HE) Stain: <ol><li> Fleck mit HE das Tumorgewebe Zusammensetzung zu bewerten, nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Für Immunperoxidase Stain: <ol><li> Fix Teratom Abschnitte mit 4% PFA für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Permeabilisieren mit 0,1% Triton X-100. </li></ol></li><li> Inkubieren mit den folgenden Antikörpern: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) und αSMA (1: 100) in 1x PBS in 1% BSA verdünnt. Inkubieren für 1 Stunde bei 37 ° C (für Tubb3) oder über Nacht bei 4 ° C (für die anderen Antikörper). </li><li> Block-Peroxidase unter Verwendung von 100% Methanol für 20 min. </li><li> Inkubieren für 45 min bei 37 ° C mit sekundären Antikörper anti-Maus-HRP-konjugiertem (1: 150). </li><li> Spülen Sie mit 1x PBS. </li><li> Inkubieren mit Peroxidase (HRP) -Substrat (siehe Materialien Table) für 5 min. </li><li> Spülen mit Leitungswasser für 5 min. </li><li> Fleck mit Hämatoxylin QS für 9 Sek. </li><li> Spülen mit Leitungswasser. </li></ol&gt; 10. RNA-Extraktion aus Zellen <ol><li> Verwenden Sie einen kommerziellen RNA-Extraktions-Kits gemäß der empfohlenen Protokoll des Herstellers. </li></ol> 11. RNA-Extraktion aus Teratoma <ol><li> Homogenisieren teratoma einen Stößel und Mörser und flüssigem Stickstoff unter Verwendung der Probe zu vermeiden Auftauen. </li><li> Wiegen 25 mg Gewebe. </li><li> 1 ml handelsüblicher Reagenzien zur RNA-Extraktion und 200 &amp; mgr; l Chloroform. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 xg und 4 ° C für 15 min. </li><li> Übertragung der geklärte Überstand in ein neues Röhrchen. </li><li> Zur Reinigung verwenden Sie die RNA eine kommerzielle RNA-Extraktions-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 12. Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion-Analyse <ol><li> Synthetisieren der Erststrang-cDNA, die eine reverse Transkriptase für die reverse Transkription (RT) -Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Oligo (dT) unter Verwendung according dem Protokoll des Herstellers, 50 ng / &amp; mgr; l cDNA zu erhalten. Verdünnte cDNA mit RNase-freiem Wasser bei einer Konzentration von 10 ng / &amp; mgr; l. </li><li> Führen RT-PCR unter Verwendung der DNA-Polymerase nach Herstellerprotokoll unter Verwendung von 1 ng / &amp; mgr; l cDNA. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die gewählte Methode, die Induktion von Pluripotenz zu erhalten, ist relevant für die Zell klinische Sicherheit in Bezug auf langfristige Transplantation. Heutzutage gibt es mehrere Verfahren geeignet für die Umprogrammierung. Unter den nicht-integrative Verfahren wird die virale Sendai (SeV) Vektor ist ein RNA - Virus , das große Mengen an Protein 40 ohne die Integration in den Zellkern der infizierten Zellen produzieren kann und könnte eine Strategie sein , um iPS - Zellen erhalten. SeV-Vektore...

Eine vorgeburtliche Diagnostik ist ein wichtiges klinisches Werkzeug , um genetische Krankheiten zu bewerten (dh Chromosomenaberrationen, monogenetische oder polygenetische / multifaktoriellen Erkrankungen) und angeborene Fehlbildungen (zB Zwerchfellhernie, zystische Lungenläsionen, Exomphalos, gastroschisis). Nachwasser (AF) Zellen sind einfach von routinemäßig geplanten Prozeduren während des zweiten Trimesters der Schwangerschaft (dh Amniozentese und amnioreduction) oder Kaiserschnitte 1, 2 zu erhalten. Die Verfügbarkeit von AF - Zellen aus der pränatalen oder Neugeborenen Patienten bietet die Möglichkeit , diese Quelle für die regenerative Medizin und mehrere Forscher untersuchten die Möglichkeit , verschiedene Gewebeschäden oder Krankheiten zu behandeln , um eine Stammzellpopulation mit getrennt von AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Die Möglichkeit, leicht AF-Zellen aus erkrankten Patienten erhalten wird, in einem Zeitfenster, in dem die Krankheit oft stationär ist, öffnet den Weg für die Idee der Verwendung dieser Zellquelle für eine Neuprogrammierung Zwecke. Tatsächlich induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) aus AF - Zellen abgeleiteten Zellen könnten für in vitro Drogentests oder für das Tissue Engineering Ansätze in den Zellen von Interesse unterschieden werden, um eine ausreichende patientenspezifischen Therapie vor der Geburt vorzubereiten. Viele Studien haben bereits die Fähigkeit der AF - Zellen nachgewiesen , in einem weiten Bereich von Zelltypen 13, 14, 15, 16, 17 und umprogrammiert zu unterscheiden &lt;/ sup&gt;, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. Seit der Entdeckung von Takahashi und Yamanaka 28 reprogrammierter somatischen Zellen durch die erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, cMyc und Klf4) wurden Fortschritte auf dem Gebiet der Reprogrammierung gemacht. die verschiedenen Methoden unter Berücksichtigung, können wir zwischen viralen und nicht-viralen Methoden unterscheiden. Die erste erwartet, dass die Verwendung von viralen Vektoren (Retroviren und Lentiviren), die einen hohen Wirkungsgrad besitzen, aber in der Regel unvollständige silencing des retroviralen Transgen, sowohl mit der Folge einer teilweise umprogrammiert Zelllinie und das Risiko vonInsertionsmutagenese 29, 30, 31. Die nicht-virale Verfahren verwendet verschiedene Strategien: dh Plasmide, Vektoren, mRNA, Protein, Transposons. Die Ableitung von iPS-Zellen frei von transgenen Sequenzen zielt darauf ab, die potenziell schädlichen Auswirkungen von undichten Transgen-Expression und Insertionsmutagenese zu umgehen. Unter all den oben genannten nicht-viralen Strategien, die PiggyBac (PB) Transposon / Transposase System benötigt nur die invertierten terminalen Wiederholungen ein Transgen und eine transiente Expression der Transposase - Enzym flankieren 32 Insertion oder Exzision Ereignisse zu katalysieren. Der Vorteil in Transposons gegenüber anderen Verfahren für iPS Zellgeneration Verwendung ist die Möglichkeit des Erhalts vektorfreien iPS-Zellen mit einem nicht-viralen Vektor Ansatz, der die gleiche Effizienz von retroviralen Vektoren zeigt. Dies ist möglich durch die Spur-less Exzision des integrierten Transposons Codierung für die reprogramming Faktoren nach einer neuen transiente Expression der Transposase in den iPS - Zellen 33. Da PB in verschiedenen Zelltypen effizient 34, 35, 36, 37, ist besser geeignet für einen klinischen Ansatz bezüglich viraler Vektoren und erlaubt die Herstellung von xeno freien iPS - Zellen im Gegensatz zu derzeitigen Protokolle virale Produktion , die xenobiotischen verwenden Bedingungen wird dieses System verwendet iPS-Zellen aus Maus-AF zu erhalten. Hier schlagen wir ein detailliertes Protokoll folgende bereits veröffentlichten Arbeiten die Herstellung von pluripotenten iPS - Klone zu zeigen , von der Maus AF - Zellen (iPS-AF - Zellen) 38.

<table><tbody><tr><td>100 mm Petrischalen in Bakterienqualität</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>Für in vitro Differenzierung</td></tr><tr><td>von 2-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Für Maus-AF, iPS-AF-Zellen und Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>Alexa568-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>Sekundärantikörper (Immunfluoreszenz)</td></tr><tr><td>Alexa594-konjugiertes Hühnchen-Anti-Ziegen-IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>Sekundärantikörper (Immunfluoreszenz)</td></tr><tr><td>Alexa594-konjugiertes Hühnchen-Anti-Kaninchen-IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>Sekundärantikörper (Immunfluoreszenz)</td></tr><tr><td>Alexa594-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>Sekundärantikörper (Immunfluoreszenz)</td></tr><tr><td>Alkalisches Phosphatase-Kit&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>Alkalische Phosphatase&nbsp; Färbung</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Für die Bakterienselektion</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, zur Verstopfung der Lösung. Verdünnt in PBS 1x</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Für die RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>DH5&alpha-Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>Bakterien für das Klonierungsverfahren</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>Für MEF, Maus-AF, iPS-AF-Zellen und Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>Doxycyclin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>Für die Expression exogener Faktoren</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) &nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.706</td><td>Für PB-Produktion&nbsp;</td></tr><tr><td>ES FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 10439024</td><td>Für Maus-Vorhofflimmern, iPS-AF-Zellen und Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>Für MEF mittel</td></tr><tr><td>Zange mit feiner Spitze</td><td>F.S.T</td><td>Dumont #5&nbsp;</td><td>AF-Isolierung</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td><td>Verwendet 0,1%, verdünnt in PBS 1x</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td>Zur Blockierungslösung. Verdünnt in PBS 1x</td></tr><tr><td>Hämatoxylin QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>Zellkernnachweis</td></tr><tr><td>HE&nbsp;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>Histologische Analyse von Teratomen</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific H3570</td><td>Zellkernnachweis</td></tr><tr><td>Pferdeserum&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>Zur Blockierungslösung</td></tr><tr><td>HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>Sekundärantikörper (Immunperoxidase)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>Peroxidase-Substrat</td></tr><tr><td>Insulinspritze mit Nadel (25 g)</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>Amniozentese-Verfahren</td></tr><tr><td>Klf4&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>Kaninchen polyklonales IgG</td></tr><tr><td>L-Glutamin &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>Für Maus-Vorhofflimmern, iPS-AF-Zellen und Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>LB-Bouillon (Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Für Bakterienwachstum</td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>Für Maus-AF- und iPS-AF-Zellen medium</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Für die in vitro Differenzierung. Verdünnt 1:10 in DMEM</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>Peroxidase-blockierende</td></tr><tr><td>MULTIWELL 24-Well-Platte</td><td>BD Falcon 353047</td><td></td><td>Für die Differenzierung von in vitro</td></tr><tr><td>MULTIWELL 6-Well-Platte</td><td>BD Falcon 353046</td><td></td><td>Für MEF-, Maus-AF- und iPS-AF-Zellkulturen</td></tr><tr><td>Nanog&nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>Kaninchen polyklonales IgG</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Für Maus-VHF, iPS-AF-Zellen und Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>Für Blockierungslösung. Verdünnt in PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td><td>Für die Zellpermeabilisierung. Verdünnt in PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>Maus monoklonales IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT) &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18418012</td><td>Für RT-PCR</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (Lösung)</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>PFA, Fixiermittel, verdünnt in PBS</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, frei von Ca2+/Mg2+. Verdünnt mit sterilem Wasser zur Gewinnung von PBS 1x</td></tr><tr><td>Penicillin - Streptomycin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>Für MEF-, Maus-AF-Zellen, iPS-AF-Zellen und Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>Petrischale (150 mm)</td><td>BD Falcon 353025</td><td>Für MEF-Kulturen, Gewebekulturen</td><td></td></tr><tr><td>PiggyBac-Transposase-Expressionsplasmid&nbsp;</td><td>Zur Verfügung gestellt von Professor Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratory-mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS Transposon Plasmid</td><td>Zur Verfügung gestellt von professor Andras Nagy</td><td></td> <td>laboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>Für die Aufreinigung von Plasmiden</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Für die Aufreinigung</td></tr> <tr><td>von PlasmidenReverse Tetracyclin-Transaktivator-Transposon-Plasmid&nbsp;</td><td>Zur Verfügung gestellt von Professor Andras Nagy</td> <td>laboratory-rtTA</td><td></td></tr> <tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Für die RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Sox2&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>Ziege polyklonales IgG</td></tr><tr><td>SSEA1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Monoklonales IgM</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transkriptase der Maus&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td>für RT-PCR</td></tr><tr><td>T&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>Kaninchen polyklonale IgG</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10342020</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Zellkultur-Passaging</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>Für die Zellpermeabilisierung, verdünnt in PBS 1x</td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>Für die RNA-Extraktion</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubb3&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G712A</td><td>Maus monoklonales IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>Für die Zellpermeabilisierung, verdünnt in PBS 1x</td></tr><tr><td>&alpha; fp&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>MAB1368</td><td>Maus Monoklonales IgG1</td></tr><tr><td>&alpha;SMA&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Monoklonales IgG2a-Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> für die Maus <tr><td>(FuGENE HD)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td>Für die Transfektion von AF-Zellen</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>Zur Durchführung einer Amniozentese&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &mu; l Tipps</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>70.760012</td> Zum <td>Entnehmen von Bakterienkolonien</td></tr><tr><td>Schere</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 rostfrei 25U</td><td>Zur Durchführung einer Amniozentese&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td>Zur Reinigung der Bauchdecke der trächtigen Hündin</td></tr><tr><td>Gewebekultur-Petrischale (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>Für die MEF-Expansion</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>Für die MEF-Inaktivierung</td></tr><tr><td>MULTIWELL 96-Well-Platte</td><td>BD Falcon</td><td>353071</td><td>Für iPS-AF-Kulturen</td></tr></tbody></table>

die herstellung von pluripotenten stammzellen aus maus fruchtwasserzellen ein transposon-system verwenden

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) werden aus somatischen Zellen von Mäusen und Menschen durch erzwungene Expression definierter Transkriptionsfaktoren mit unterschiedlichen Methoden erzeugt. Hier haben wir iPS-Zellen aus Fruchtwasserzellen der Maus hergestellt, wobei ein nicht-virales Transposon-System verwendet wurde. Alle erhaltenen iPS-Zelllinien wiesen Eigenschaften pluripotenter Zellen auf, einschließlich der Fähigkeit, in vitro und in vivo zu Derivaten aller drei Keimblätter zu differenzieren. Diese Strategie eröffnet die Möglichkeit, Zellen von erkrankten Föten zu nutzen, um neue Therapien für Geburtsfehler zu entwickeln.

Zur Auswertung wurden die Kapazität der Reprogrammierung, Maus AF-Zellen aus Föten von GFP-Mäusen gesammelt. Zellen wurden mit dem kreisförmigen Transposon-Plasmid PB-tetO2-IRES-OKMS, transfiziert, die die Yamanaka Faktoren (Oct4, Sox2, cMyc und Klf4) drückt auf die mCherry fluoreszierendes Protein gebunden in einer Doxycyclin-induzierbaren Weise und Tetracyclin-Transaktivator-reverse (PB- CAG-rtTA) Plasmide zusammen mit dem Transposaseexpression Plasmid (mPBase). Maus - AF - Zellen wurd...

In dieser Studie erzeugen wir induzierte pluripotente Stammzellen aus Fruchtwasserzellen der Maus unter Verwendung eines nicht-viralen Transposon-Systems.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, murine Fruchtwasserzellen mit Hilfe eines Transposon-Systems zu isolieren und umzuprogrammieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach durchzuführen ist. In einem therapeutischen Setting können Zellen von menschlichen Krankheitsföten zu Zellen differenziert werden, die für Arzneimitteltests oder Tissue Engineering von Interesse sind, um auf andere Weise die patientenspezifische Therapie vor der Geburt vorzubereiten.Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen der Programmierung zu beantworten. Das Transposon-System ist in verschiedenen Zelltypen effizient. Es eignet sich besser für den klinischen Ansatz in Bezug auf virale Vektoren und ermöglicht die Produktion von oxinofreien IPS-Zellen.Um mit der Isolierung zu beginnen, reinigen Sie die Bauchdecke des Damms mit 70 Prozent Ethanol. Führen Sie mit einer Schere eine Mittellinien-Laparotomie durch, bei der Sie die Länge der Bauchdecke einschneiden, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten. Lege eine Pinzette frei, um die Gebärmutter freizulegen, und schneide sie dann mit einer Schere heraus.Übertragen Sie die Gebärmutter in eine 100-Millimeter-Schale, die mit steril

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Die Stemgent Dox Inducible Maus TF Lentivirus Set kann embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) neu zu programmieren. Hier haben wir das Protokoll für DOX-induzierbare Expression von Maus Umprogrammierung Transkriptionsfaktoren Oct4 zu demonstrieren, Sox2, Klf4 und c-Myc iPS Kolonien, die ausdrückliche gemeinsamen mES Pluripotenz Marker zu generieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Linien produziert Linien unterschiedlicher Entwicklungspotenzial, auch wenn sie Standard-Tests für Pluripotenz passieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Mäuse vollständig aus iPS, die die iPSC Linien definiert als die über volle Pluripotenz abgeleitet...

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Embryonale Fibroblasten der Maus können durch die erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc mit geringer Effizienz in induzierte pluripotente Stammzellen reprogrammiert werden. Die seltenen Zwischenprodukte der Reprogrammierungsreaktion sind FACS-isoliert durch Markierung mit Antikörpern gegen die Zelloberflächenhersteller Thy-1.2, Ssea-1 und Epcam.

Zelloberflächenmarker vermittelte Reinigung von iPS-Zellen aus einer Zwischen Reprogrammierbare Maus-Modell

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur nahtlosen Genbearbeitung in humanen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der Cas9-Nickase-Mutante. Zwei Punktmutationen wurden in Exon 8 des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Locus (HNF4α) in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt.

Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Wir stellen hier eine Methode vor, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren effizient zu erzeugen, ohne dass Gentransfektion oder retrovirale Vektoren erforderlich sind. Diese Strategie ist daher vielversprechend für die translationale Medizin und stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzellorganoidtechnologie dar.

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

Wir haben eine Methode zur Verkapselung von pluripotenten Stammzellen (PS-Zellen) in Alginat-Hydrogel-Kapseln mit einer koaxialen Düse etabliert.  Dies verhindert eine übermäßige Aggregation der Zellen und begrenzt die Scherspannung, der Zellen in Suspensionskulturen ausgesetzt sind.  Die Technik ist sowohl auf die Massenproduktion von PS-Zellen als auch auf die Forschung in der Stammzellnische anwendbar.

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Erfahren Sie die Reprogrammierung von Maus-Fruchtwasserzellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Transposon-System. Diese nicht-virale Methode ermöglicht patientenspezifische Therapien vor der Geburt.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

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