Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, murine Fruchtwasserzellen mit Hilfe eines Transposon-Systems zu isolieren und umzuprogrammieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach durchzuführen ist. In einem therapeutischen Setting können Zellen von menschlichen Krankheitsföten zu Zellen differenziert werden, die für Arzneimitteltests oder Tissue Engineering von Interesse sind, um auf andere Weise die patientenspezifische Therapie vor der Geburt vorzubereiten.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen der Programmierung zu beantworten. Das Transposon-System ist in verschiedenen Zelltypen effizient. Es eignet sich besser für den klinischen Ansatz in Bezug auf virale Vektoren und ermöglicht die Produktion von oxinofreien IPS-Zellen.

Um mit der Isolierung zu beginnen, reinigen Sie die Bauchdecke des Damms mit 70 Prozent Ethanol. Führen Sie mit einer Schere eine Mittellinien-Laparotomie durch, bei der Sie die Länge der Bauchdecke einschneiden, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten. Lege eine Pinzette frei, um die Gebärmutter freizulegen, und schneide sie dann mit einer Schere heraus.

Übertragen Sie die Gebärmutter in eine 100-Millimeter-Schale, die mit sterilem 1xPBS gefüllt ist, und bewahren Sie sie auf Eis auf. Stellen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop mit 10-facher Vergrößerung und halten Sie die Gebärmutter mit einer Pinzette, während Sie die Gebärmutterwand mit einer Schere entfernen, wobei Sie darauf achten, dass die Membranen des Fötus nicht beschädigt werden. Sammeln Sie die Föten in einer 100-Millimeter-Schale, die mit sterilem 1XPBS gefüllt ist, und legen Sie sie auf Eis.

Fassen Sie die Plazenta eines Fötus mit der feinen Pinzette und bewegen Sie sie in eine saubere 100-Millimeter-Schale. Hier entfernst du vorsichtig den Dottersack. Unterbrechen Sie das Amnion mit der Pinzette und einer Insulinspritze, sammeln Sie 30 Mikroliter Fruchtwasser.

Füllen Sie die Flüssigkeit in ein konisches 15-Milliliter-Fläschchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Fötus und sammeln Sie die Flüssigkeit jedes Mal in derselben Durchstechflasche. Waschen Sie anschließend jeden Fötus mit sterilem 1XPBS, das mit einem Prozent fötalem Rinderserum angereichert ist, und sammeln Sie dieses zusammen mit dem Fruchtwasser in das konische 15-Milliliter-Röhrchen.

Das Röhrchen wird fünf Minuten lang bei 145 μg zentrifugiert und dann unter einer Laminar-Flow-Haube der Überstand entfernt. Suspendieren Sie die pelletierten Zellen erneut in zwei Millilitern Fruchtwasserkulturmedium. Nehmen Sie eine mit Gelatine beschichtete Sechs-Well-Platte mit Nullkomma, einem Prozent Gelatine, die mit Mymycin-C behandelte embryonale Mausfibroblasten oder MEF enthält, und säen Sie dann zwei Milliliter Zellen auf die Platte.

Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag. Setzen Sie die Kultur sieben Tage lang fort, bis die Zellen für die Transfektion bereit sind. Um die Transfektion zu beginnen, wird in einem Ein-Komma-Fünf-Millimiter-Mikrozentrifugenröhrchen ein Mikrogramm Transposon-Plasmid mit null Komma fünf Mikrogramm Transposase-Expressionsplasmid und null Komma fünf Mikrogramm reverses Tetracyclin-Transaktivator-Plasmid gemischt.

Mit d-man auf 100 Mikroliter verdünnen. Geben Sie acht Mikroliter Transfektionsreagenz in das Mikrozentrifugenröhrchen, das die DNA enthält. Inkubieren Sie diese Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nehmen Sie die Sechs-Well-Platte mit Maus-AF-Zellen, fügen Sie tropfenweise 100 Mikroliter des Transfektionsmittel-DNA-Gemischs pro Vertiefung hinzu und verteilen Sie es durch sanftes Schwenken mit einem Endvolumen von zwei Millilitern pro Vertiefung. Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid stehen. Entfernen Sie am nächsten Tag das Kulturmedium und füttern Sie dann jede Mulde mit zwei Millilitern frischem iPS AF-Medium, das mit einem Komma fünf Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin ergänzt wurde, um die Expression der Yamanaka-Faktoren zu induzieren.

Füttern Sie die Zellen ab diesem Zeitpunkt täglich mit frischem dox-haltigem Medium ohne Passage. Beobachten Sie die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop innerhalb von 24 Stunden nach der ersten Doxycylcin-Behandlung, um nach einer mCherry-Expression zu suchen, und von diesem Zeitpunkt an täglich auf die Koloniebildung. Sobald die Koloniebildung beobachtet wurde, entnehmen Sie einzelne Kolonien in 50 Mikroliter Zellkulturmedium.

Als nächstes werden sie nacheinander in separate Vertiefungen einer 96-Well-Gewebekulturplatte mit Mytomycin c behandeltem MEF überführt. Am nächsten Tag geben Sie 50 Mikroliter Trypsin in jede Vertiefung und inkubieren fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Kolonien in einzelne Zellen zu dissoziieren. Pipettieren Sie die Flüssigkeit nach der Inkubation auf und ab, um die Kolonien weiter zu disaggregieren.

Übertragen Sie 50 Mikroliter des Trypsin-Zellmixes in eine neue Vertiefung mit inaktiviertem MEF und geben Sie die Zellen dann wieder in den Inkubator. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 60 bis 70 Prozent erreichen, teilen Sie sie in eine neue Vertiefung einer 24-Well-Platte auf und setzen Sie die Inkubation bei Raumtemperatur fort. Sobald diese Zellen eine Konfluenz von 60 bis 70 Prozent erreicht haben, drehen Sie die Zellen eins bis zwei in zwei Vertiefungen, eine mit Doxycyclin und eine ohne Vertiefung, um sicherzustellen, dass die Kolonien auch in Abwesenheit von Doxycyclin wachsen.

Halten Sie die IPS-AF-Kolonien und das Doxycyclin-unabhängige Medium auf inaktiviertem MEF weiterhin bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid. Wechseln Sie das Medium täglich, bis die Zellen für die Färbung, Bildgebung und RNA-Extraktion bereit sind. Hier exprimieren die stabilen Doxycyclin-unabhängigen induzierten pleuripotenten amniotischen GFP-Zellen der Maus die Pleuripotenzmarker, die zur Bestätigung einer erfolgreichen Reprogrammierung erforderlich sind.

Die RTPCR-Analyse mit R1-ES-Zellen als Kontrolle zeigte die Expression der induzierten Pleuripotenzmarker in Gegenwart oder Abwesenheit von Doxycyclin. Die Expression des Haushaltsgens, Beta-2-Mikroglobulin, wurde ebenfalls in allen drei Zelltypen beobachtet. Teratome, die von Mäusen isoliert wurden, denen die induzierten pleuropotenten Zellen injiziert wurden, wurden immungefärbt.

Der Nachweis von alpha-fetalem Protein, Alpha-Aktin der glatten Muskulatur und Beta-3-Tubulin in den Massen bestätigt die Zelldifferenzierung in alle drei Keimblätter, Ektoderm, Mesoderm und Endoderm. Darüber hinaus bestätigt die RTPCR-Analyse von in vitro Embryoidkörpern und in vivo Teratomzellen die Expression von keimblattspezifischen Markergenen für das Mesoderm, Endoderm und Ektoderm. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Fruchtwasserzellen von Mäusen isoliert und neu programmiert

Dies ist ein einfaches und sicheres Verfahren, das auch auf menschliche Fruchtwasserzellen aus einer Probe angewendet werden kann, die bei Routinediagnosen oder Kaiserschnitten entnommen wurde.