Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster
6. Oktober 2016
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie zur Durchführung einer langfristigen hochauflösenden Einzelzellbildgebung der intakten Lunge in Echtzeit unter Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine langfristige, hochauflösende Einzelzellbildgebung der intakten Lunge unter Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten; Zum Beispiel, welche Wechselwirkungen zwischen Stroma und Tumorzellen in den frühesten Schritten der Metastasierung ablaufen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die lebende, intakte Lunge theoretisch mit einer Einzelzellauflösung von bis zu 12 Stunden sichtbar gemacht werden kann.
Beginnen Sie damit, eine drei Zoll lange 2-0-Naht mit einem Doppelknoten an einen Trachealkatheter zu binden, der einen Viertelzoll über der Buchse liegt. Tragen Sie dann Augensalbe auf die Augen einer betäubten Maus auf und verwenden Sie Enthaarungscreme, um die Haare von der linken Seite des Tieres, von der Mittellinie der Brust bis zu einem Viertel des Rückens und von der Achselhöhle bis knapp unter den Brustkorb zu entfernen. Reinigen Sie überschüssige Lotion und sterilisieren Sie die exponierte Haut mit 70% Ethanol.
Intubieren Sie anschließend das Tier. Und binden Sie die 2-0-Naht um die Schnauze unter den Vorderzähnen. Bringen Sie das Tier in den Operationsbereich, achten Sie darauf, dass sich die Katheter nicht lösen, und schalten Sie das Beatmungsgerät ein.
Schließen Sie das Beatmungsgerät an den Trachealkatheter an. Kleben Sie dann den Katheter an die Schnauze und das linke Vorderglied an den Katheter. Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, entfernen Sie mit einer scharfen Schere einen Quadratzentimeter Haut über der linken Brustwand.
Heben Sie das Brustfettpolster an und kauterisieren Sie alle freiliegenden Blutgefäße. Als nächstes resezieren Sie das Fettpolster und entfernen die Muskelschicht bis zum Brustkorb, wobei Sie darauf achten, dass die Achselvene an der Basis der Vordergliedmaße nicht durchtrennt wird. Hebe die sechste Rippe mit einer Pinzette an.
Halten Sie dann die scharfe Schere in einem flachen Fünf-Grad-Winkel und schneiden Sie die Rippe in der Nähe des Randes der Öffnung in die Haut. Entfernen Sie vier aufeinanderfolgende Rippen, um die Öffnung in der Brustwand zu erweitern und den gesamten Lungenlappen freizulegen. Bringen Sie dann die Maus vorsichtig auf den Mikroskop-Bildgebungstisch.
Füllen Sie bei ausgeschaltetem Vakuum die Innenkammer des Vakuumfensters mit PBS. Drehen Sie die Maus um und positionieren Sie die freiliegende Lunge über dem Deckglasfenster für die Vakuumbildgebung. Schalten Sie das Vakuum langsam ein.
Lege ein Fesselgeschirr aus halb gefaltetem Seidenpapier zweimal über die Brust der Maus und klebe das Geschirr an die Bühnenplatte. Befestigen Sie dann ein Pulsoximeter an der Pfote des Tieres. Stellen Sie dann die Klimakammer auf den Tisch und schalten Sie die Hitze ein, um die Maus auf einer physiologischen Temperatur zu halten.
Wenn das Tier in Position ist, bringen Sie das Objektiv mit numerischer Apertur von 25 x 95 in die Nähe des Deckglases. Betrachten Sie im Epifluoreszenzmodus den Fitzy-Kanal und bringen Sie das Lungengewebe in den Fokus. Laden Sie als Nächstes eine sterile Spritze mit 100 Mikrolitern der Tumorzellsuspension, entfernen Sie die PBS-Spritze aus dem Schwanzvenenkatheter und schließen Sie die Tumorzellspritze an.
Injizieren Sie die Tumorzellen langsam in die Schwanzvene. Verbinden Sie dann die PBS-Spritze wieder mit dem Schwanzvenenkatheter und lokalisieren Sie die Tumorzellen im gesamten Lungengewebe über das mikroskopische Okular. Ersetzen Sie nun die PBS-Spritze durch eine Spritze, die mit 100 Mikrolitern Rhodamin-Dextran beladen ist, und injizieren Sie das Dextran langsam über den Schwanzkatheter in die Maus.
Nach der Verabreichung von Dextran mit einer sterilen PBS-Spülung von 50 Mikrolitern. Erhalten Sie dann Bilder an jeder der zuvor lokalisierten Tumorzellpositionen, um den Fluss und die Integrität des Gefäßsystems zu visualisieren. Vierundzwanzig Stunden nach der Injektion können einzelne Tumorzellen sichtbar gemacht werden, die mit Makrophagen und Monozyten im Gefäßsystem interagieren.
Die Stabilität der Bildgebung ist derart, dass sequentielle Z-Stapel des Feldes erfasst und eine dreidimensionale Rekonstruktion erzeugt werden kann. Hier wird ein Mosaik von fünf mal fünf Bildgebungsfeldern gezeigt, das ein Sichtfeld von 890 Mikrometern über 200 und fünf Minuten abdeckt, bei 15 Mikrometern unter der Lungenoberfläche einer einzelnen metastasierenden Läsion, 12 Tage nach der Injektion. Trotz des großen Sichtfeldes ermöglicht die hohe Auflösung der darunter liegenden Rahmen, aus denen das Mosaik besteht, die Erfassung subzellulärer Ereignisse, wie z. B. die Mitose einer einzelnen Zelle, wie sie durch die Chromosomentrennung belegt wird.
Die intravaskuläre Injektion eines fluoreszenzmarkierten Dextrans mit hohem Molekulargewicht führt zur Markierung des Gefäßlumens; Allerdings können unmarkierte zirkulierende Erythrozyten und Leukozyten das Dextran verschließen. In den kleinen Kapillaren der Lunge führt dieser Verschluss zu einem Aufblitzen des Dextran-Signals und einem Definitionsverlust in den Gefäßgrenzen. Die hohe räumliche Stabilität, die durch dieses Protokoll gewährleistet wird, ermöglicht eine zeitliche Mittelung des Blutkanals ohne Unschärfe und stellt so die temporären Verschlüsse wieder her.
Die anderen Signalkanäle können dann auf das Gefäßsystem gelegt werden, um eine klare Sicht auf die Gefäßgrenzen zu ermöglichen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Stunde abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, darauf zu achten, dass keine großen Blutgefäße durchtrennt werden, ohne sie vorher zu kauterisieren, und das Lungengewebe überhaupt nicht zu berühren.
Nach diesem Verfahren können die frühesten Stadien der Ausbreitung und Proliferation von Tumorzellen sichtbar gemacht werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine intravitale Bildgebung in der intakten Lunge mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungsfenster durchführen können. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrem Experiment.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie, um Langzeit-Aufnahmen mit hoher Auflösung auf Einzelzellniveau in der intakten Lunge in Echtzeit mithilfe eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Krebsforschung bezüglich der Interaktionen zwischen Stroma und Tumorzellen während der Metastasierung zu beantworten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Krebsforschung
Hintergrund
- Die Langzeit-Bildgebung von lebendem Gewebe ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Interaktionen.
- Mehrphotonen-Mikroskopie ermöglicht die hochauflösende Bildgebung.
- Mit dieser Technik lässt sich die intakte Lunge mit Einzelzell-Auflösung darstellen.
- Das Verständnis von Metastasierung ist entscheidend für die Entwicklung von Krebstherapien.
Zweck der Studie
- Um Interaktionen zwischen Stroma- und Tumorzellen sichtbar zu machen.
- Um das Verständnis der frühen Schritte der Metastasierung zu vertiefen.
- Um eine Methode für die Langzeit-Bildgebung von Lungengewebe bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Multiphotonenmikroskopie zur Bildgebung.
- Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.
- Herstellung des Mausmodells für die Bildgebung.
- Anwendung von Anästhetika und Augensalbe zum Wohlergehen des Tieres.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der intakten Lunge für bis zu 12 Stunden.
- Hochauflösende Bilder einzelner Zellen wurden erhalten.
- Erkenntnisse über zelluläre Wechselwirkungen während der Metastasierung.
- Nachweis der Wirksamkeit der Methode in der Live-Bildgebung.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt ein leistungsstarkes Werkzeug für die Krebsforschung dar.
- Langzeit-Aufnahmen können entscheidende biologische Prozesse aufdecken.
- Weitere Studien können auf dieser Technik aufbauen, um therapeutische Erkenntnisse zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Langzeit-Intravitalmikroskopie der intakten Lunge ermöglicht die direkte Beobachtung früher metastatischer Ereignisse mit Einzelzellauflösung und schließt damit eine entscheidende Lücke in der präklinischen Krebsforschung. Diese Fähigkeit unterstützt die mechanistische Entwicklungsrisikominderung durch die Visualisierung von Tumor-Stroma-Interaktionen und vaskulären Dynamiken in einem physiologisch relevanten Kontext. Solche Erkenntnisse verbessern die Zielvalidierung und die Vorhersagesicherheit in onkologischen Arzneimittelentwicklungsprozessen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung von Echtzeit-Interaktionen von Tumorzellen mit stromalen Komponenten während der Initiation der Metastasierung.
- Operationaler Wert: Bietet funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch direkte Beobachtung zellulärer Phänotypen im intakten Gewebe.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Projektportfolios, indem Schlüsselmoleküle identifiziert werden, die für die frühe metastatische Aussaat verantwortlich sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messwerte für Zell-Zell-Interaktionen, Membrandyamik und Perfusion zur Bewertung von Assays.
- Operativer Wert: Schafft reproduzierbare Bildgebungsbedingungen über 12 Stunden, was eine konsistente Beurteilung von Substanzeffekten ermöglicht.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Vorbereitung validierter biologischer Systeme für Workflows im Hochdurchsatz-Screening mit hohem Informationsgehalt.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung, indem die physiologische Relevanz während der longitudinalen Beobachtung erhalten bleibt.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt die Festlegung von Weiterentwicklungskriterien durch die Visualisierung subzellulärer Ereignisse wie Mitose und Gefäßintegrität.
- Biomarker-Korrelation: Ermöglicht die Zuordnung von bildgebenden Phänotypen zu potenziellen translationalen Biomarkern metastatischer Potenziale.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung, indem sie dynamische, quantitative Daten zu metastatischen Prozessen bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem sie die Stroma-Tumor-Zell-Interaktionen aufklärt, die das frühe Überleben und Wachstum bestimmen.
- Screening: Bietet standardisierte, versuchsfertige Bedingungen mit quantitativen Aussagen zu Gefäßbildung und zellulären Parametern für die Wirkstoffprüfung.
- Analytik: Ermöglicht zeitliche Mittelung und 3D-Rekonstruktion, um stabile vaskuläre Signale und subzelluläre Dynamiken für den Vergleich zu extrahieren.
- Translationale Forschung: Erhält die systemische Integrität unter krankheitsrelevanten Bedingungen von der Entdeckung bis in die präklinische Phase und unterstützt beobachtungen, die auf Biomarker ausgerichtet sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare intravitale Bildgebungsplattform, die in verschiedenen Onkologieprojekten mit Modellen der Lungenmetastasierung anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen in Metastasemodellen durch direkte, langfristige Visualisierung zellulärer Interaktionen.
- Operativer Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch vakuumstabilisiertes Fenster und Umweltkontrollen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, vorhersagende Einblicke in die metastatische Kompetenz bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf beobachteten anti-metastatischen Effekten im intakten Gewebe.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der intravitale Chirurgie, der Multiphotonenmikroskopie und der Bildverarbeitung zur vaskulären Rekonstruktion.
- Beruht auf spezialisierter Messtechnik, einschließlich einer vakuumstabilisierten Bildgebungsöffnung, einer Umgebungskammer und Objektiven mit hoher numerischer Apertur (high-NA).
- Erfordert eine standardisierte Zusammenarbeit zwischen chirurgischen, bildgebenden und analytischen Teams, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf andere Tumormodelle oder genetische Hintergründe übertragen wird.
- Eingeschränkt durch die technische Komplexität des Thoraxeingriffs sowie die Notwendigkeit präziser vaskulärer Zugänge und einer stabilen Fixierung der Lunge.
