Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster
6. Oktober 2016
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie zur Durchführung einer langfristigen hochauflösenden Einzelzellbildgebung der intakten Lunge in Echtzeit unter Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Langzeit-Aufnahmen mit hoher Auflösung auf Einzelzell-Ebene im intakten Lungengewebe mithilfe eines vakuumstabilisierten Bildgebungs-Fensters durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise welche Wechselwirkungen zwischen Stroma- und Tumorzellen in den frühesten Phasen der Metastasierung entstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das lebende, intakte Lungengewebe theoretisch bis zu 12 Stunden lang mit Einzelzell-Auflösung sichtbar gemacht werden kann.
Beginnen Sie damit, ein 7,6 cm langes Stück 2-0-Nahtmaterial mit einem Doppelknoten 0,6 cm oberhalb der Hülse an einen trachealen Katheter zu binden. Tragen Sie anschließend Augensalbe auf die Augen einer anästhesierten Maus auf und verwenden Sie Enthaarungscreme, um die Haare von der linken Körperseite des Tieres vom Brustmittellinie bis zu einem Viertel des Rückens und von der Achselhöhle bis knapp unterhalb des Rippenbogens zu entfernen. Entfernen Sie überschüssige Creme und desinfizieren Sie die freigelegte Haut mit 70 % Ethanol.
Als Nächstes intubieren Sie das Tier und binden die 2-0-Naht um die Schnauze unterhalb der Vorderzähne. Bringen Sie das Tier in den Operationsbereich, achten Sie darauf, die Katheter nicht zu lösen, und schalten Sie den Beatmungsapparat ein.
Schließen Sie das Beatmungsgerät an den Trachealkatheter an. Befestigen Sie den Katheter anschließend mit Klebeband an der Schnauze und am linken Vorderbein. Nachdem Sie die fehlende Reaktion auf eine Zehenquetschung bestätigt haben, entfernen Sie mit einer scharfen Schere einen Quadratzentimeter Haut über der linken Brustwand.
Heben Sie das Brustfettgewebe an und koagulieren Sie alle sichtbaren Blutgefäße. Entfernen Sie anschließend das Fettgewebe und die Muskelschicht bis hin zum Rippenkorb, wobei darauf geachtet werden muss, die axilläre Vene an der Basis des Vorderbeins nicht zu verletzen. Heben Sie mit einer Pinzette die sechste Rippe an.
Dann, unter Halten der scharfen Schere in einem flachen Winkel von fünf Grad, die Rippe nahe der Kante der Öffnung in der Haut schneiden. Vier aufeinanderfolgende Rippen entfernen, um die Öffnung in der Brustwand zu vergrößern und das gesamte Lungenlappen freizulegen. Anschließend die Maus vorsichtig auf den Mikroskopie-Präparat übertragen.
Bei ausgeschaltetem Vakuum füllen Sie die innere Kammer des Vakuumfensters mit PBS. Drehen Sie die Maus um und positionieren Sie die freigelegte Lunge über das Vakuum-Abbildungs-Deckglasfenster. Schalten Sie langsam das Vakuum ein.
Platzieren Sie einen Haltegurt, der aus zweifach gefaltetem Filterpapier besteht, über der Brust der Maus und befestigen Sie den Gurt mit Klebeband an der Plattform. Anschließend befestigen Sie ein Pulsoximeter an der Pfote des Tieres. Danach stellen Sie die Umweltkammer auf die Plattform und schalten die Heizung ein, um die Maus auf einer physiologischen Temperatur zu halten.
Wenn sich das Tier in Position befindet, bringen Sie das Objektiv mit einer numerischen Apertur von 25 durch 95 nahe an die Deckglasoberfläche heran. Im Epifluoreszenzmodus betrachten Sie den Fitzy-Kanal und fokussieren das Lungengewebe scharf. Danach laden Sie eine sterile Spritze mit 100 Mikrolitern der Tumorzellsuspension, entfernen die PBS-Spritze aus dem Katheter in der Schwanzvene und verbinden die Tumorzell-Spritze.
Injizieren Sie die Tumorzellen langsam in die Schwanzvene. Anschließend schließen Sie die PBS-Spritze erneut an den Katheter der Schwanzvene an und verfolgen Sie die Verteilung der Tumorzellen im Lungengewebe über das Okular des Mikroskops. Ersetzen Sie nun die PBS-Spritze durch eine mit 100 Mikrolitern Rhodamin-Dextran gefüllte Spritze und injizieren Sie das Dextran langsam über den Schwanzkatheter in die Maus.
Nach der Dextran-Applikation erfolgt ein Spülvorgang mit 50 Mikroliter sterilem PBS. Anschließend werden Bilder an jeder zuvor lokalisierten Tumorzellposition aufgenommen, um den Blutfluss und die Integrität der Gefäßstruktur sichtbar zu machen. Einundzwanzig Stunden nach der Injektion können einzelne Tumorzellen beobachtet werden, die mit Makrophagen und Monozyten innerhalb der Gefäße interagieren.
Die Stabilität der Bildgebung ist so hoch, dass aufeinanderfolgende Z-Stapel des Feldes aufgenommen und eine dreidimensionale Rekonstruktion erstellt werden können. Hier wird ein Mosaik aus fünf mal fünf Bildfeldern gezeigt, das ein Sichtfeld von 890 Mikron abdeckt, über 200 Aufnahmen und fünf Minuten hinweg, 15 Mikron unterhalb der Oberfläche der Lunge einer einzelnen metastatischen Läsion, 12 Tage nach Injektion. Trotz des großen Sichtfelds ermöglicht die hohe Auflösung der zugrundeliegenden Einzelbilder, aus denen das Mosaik zusammengesetzt ist, die Erfassung subzellulärer Ereignisse, wie beispielsweise die Mitose einer einzelnen Zelle, wie durch die Chromosomentrennung belegt.
Die intravasale Injektion eines hochmolekularen, fluoreszenzmarkierten Dextrans führt zur Markierung des vaskulären Lumens; ungefärbte zirkulierende Erythrozyten und Leukozyten können jedoch den Dextran verdecken. In den kleinen Kapillaren der Lunge führt diese Verdeckung zu einem Flimmern des Dextran-Signals und zu einem Verlust der Abgrenzung der vaskulären Strukturen. Die hohe räumliche Stabilität, die durch dieses Protokoll erreicht wird, ermöglicht eine zeitliche Mittelung des Blutkanals, ohne Unschärfe zu erzeugen, wodurch die vorübergehenden Verdeckungen kompensiert werden.
Die anderen Signalkanäle können anschließend über die Gefäße gelegt werden, um eine klare Sicht auf die Gefäßränder zu ermöglichen. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in etwa einer Stunde abgeschlossen werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, keine größeren Blutgefäße zu durchtrennen, ohne sie vorher zu koagulieren, und das Lungengewebe keinesfalls zu berühren.
Mit dieser Methode können die frühesten Stadien der Tumorzellverbreitung und -proliferation sichtbar gemacht werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine intravitale Bildgebung in der intakten Lunge mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungsfenster durchführt. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie, um Langzeit-Aufnahmen mit hoher Auflösung auf Einzelzellniveau in der intakten Lunge in Echtzeit mithilfe eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Krebsforschung bezüglich der Interaktionen zwischen Stroma und Tumorzellen während der Metastasierung zu beantworten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Krebsforschung
Hintergrund
- Die Langzeit-Bildgebung von lebendem Gewebe ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Interaktionen.
- Mehrphotonen-Mikroskopie ermöglicht die hochauflösende Bildgebung.
- Mit dieser Technik lässt sich die intakte Lunge mit Einzelzell-Auflösung darstellen.
- Das Verständnis von Metastasierung ist entscheidend für die Entwicklung von Krebstherapien.
Zweck der Studie
- Um Interaktionen zwischen Stroma- und Tumorzellen sichtbar zu machen.
- Um das Verständnis der frühen Schritte der Metastasierung zu vertiefen.
- Um eine Methode für die Langzeit-Bildgebung von Lungengewebe bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Multiphotonenmikroskopie zur Bildgebung.
- Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.
- Herstellung des Mausmodells für die Bildgebung.
- Anwendung von Anästhetika und Augensalbe zum Wohlergehen des Tieres.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der intakten Lunge für bis zu 12 Stunden.
- Hochauflösende Bilder einzelner Zellen wurden erhalten.
- Erkenntnisse über zelluläre Wechselwirkungen während der Metastasierung.
- Nachweis der Wirksamkeit der Methode in der Live-Bildgebung.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt ein leistungsstarkes Werkzeug für die Krebsforschung dar.
- Langzeit-Aufnahmen können entscheidende biologische Prozesse aufdecken.
- Weitere Studien können auf dieser Technik aufbauen, um therapeutische Erkenntnisse zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Langzeit-Intravitalmikroskopie der intakten Lunge ermöglicht die direkte Beobachtung früher metastatischer Ereignisse mit Einzelzellauflösung und schließt damit eine entscheidende Lücke in der präklinischen Krebsforschung. Diese Fähigkeit unterstützt die mechanistische Entwicklungsrisikominderung durch die Visualisierung von Tumor-Stroma-Interaktionen und vaskulären Dynamiken in einem physiologisch relevanten Kontext. Solche Erkenntnisse verbessern die Zielvalidierung und die Vorhersagesicherheit in onkologischen Arzneimittelentwicklungsprozessen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung von Echtzeit-Interaktionen von Tumorzellen mit stromalen Komponenten während der Initiation der Metastasierung.
- Operationaler Wert: Bietet funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch direkte Beobachtung zellulärer Phänotypen im intakten Gewebe.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Projektportfolios, indem Schlüsselmoleküle identifiziert werden, die für die frühe metastatische Aussaat verantwortlich sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messwerte für Zell-Zell-Interaktionen, Membrandyamik und Perfusion zur Bewertung von Assays.
- Operativer Wert: Schafft reproduzierbare Bildgebungsbedingungen über 12 Stunden, was eine konsistente Beurteilung von Substanzeffekten ermöglicht.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Vorbereitung validierter biologischer Systeme für Workflows im Hochdurchsatz-Screening mit hohem Informationsgehalt.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung, indem die physiologische Relevanz während der longitudinalen Beobachtung erhalten bleibt.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt die Festlegung von Weiterentwicklungskriterien durch die Visualisierung subzellulärer Ereignisse wie Mitose und Gefäßintegrität.
- Biomarker-Korrelation: Ermöglicht die Zuordnung von bildgebenden Phänotypen zu potenziellen translationalen Biomarkern metastatischer Potenziale.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung, indem sie dynamische, quantitative Daten zu metastatischen Prozessen bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem sie die Stroma-Tumor-Zell-Interaktionen aufklärt, die das frühe Überleben und Wachstum bestimmen.
- Screening: Bietet standardisierte, versuchsfertige Bedingungen mit quantitativen Aussagen zu Gefäßbildung und zellulären Parametern für die Wirkstoffprüfung.
- Analytik: Ermöglicht zeitliche Mittelung und 3D-Rekonstruktion, um stabile vaskuläre Signale und subzelluläre Dynamiken für den Vergleich zu extrahieren.
- Translationale Forschung: Erhält die systemische Integrität unter krankheitsrelevanten Bedingungen von der Entdeckung bis in die präklinische Phase und unterstützt beobachtungen, die auf Biomarker ausgerichtet sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare intravitale Bildgebungsplattform, die in verschiedenen Onkologieprojekten mit Modellen der Lungenmetastasierung anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen in Metastasemodellen durch direkte, langfristige Visualisierung zellulärer Interaktionen.
- Operativer Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch vakuumstabilisiertes Fenster und Umweltkontrollen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, vorhersagende Einblicke in die metastatische Kompetenz bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf beobachteten anti-metastatischen Effekten im intakten Gewebe.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der intravitale Chirurgie, der Multiphotonenmikroskopie und der Bildverarbeitung zur vaskulären Rekonstruktion.
- Beruht auf spezialisierter Messtechnik, einschließlich einer vakuumstabilisierten Bildgebungsöffnung, einer Umgebungskammer und Objektiven mit hoher numerischer Apertur (high-NA).
- Erfordert eine standardisierte Zusammenarbeit zwischen chirurgischen, bildgebenden und analytischen Teams, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf andere Tumormodelle oder genetische Hintergründe übertragen wird.
- Eingeschränkt durch die technische Komplexität des Thoraxeingriffs sowie die Notwendigkeit präziser vaskulärer Zugänge und einer stabilen Fixierung der Lunge.
