Name: Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Lernen Sie die Langzeit-Intravitalmikroskopie der intakten Lunge mit einem vakuumstabilisierten Bildfenster. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Einzelzellbildgebung zur Untersuchung von Stroma-Tumor-Zell-Interaktionen während der Metastasierung.

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Diese Forschung wurde unterstützt von NIH-CA100324, dem Einstein National Cancer Institute's Cancer Center Support Grant P30CA013330, R01CA172451 an JWP und das Integrated Imaging Program. Diese Technologie wurde im Gruss-Lipper Biophotonics Center und im Integrated Imaging Program am Albert Einstein College of Medicine entwickelt. Wir danken diesen Zentren für ihre Unterstützung bei dieser Arbeit. Die Autoren danken Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon und Anthony Leggiadro von der Einstein-Werkstatt für ihre geschickte und termingerechte Verarbeitung, dem Labor von Matthew Krummel für die großzügige Bereitstellung ihrer Fensterkonstruktionszeichnungen, Kevin Elicieri und Jeremy Bredfeldt für ihre Expertise in der Mikroskopie und ihren Verstärkerempfehlungen sowie Allison Harney und Bojana Gligorijevic für informative Gespräche.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hohe Auflösung in vivo optische Bildgebung mit fluoreszenzmarkierten funktionellen Tags kombiniert, wie Proteine und Antikörper hat sich unser Verständnis der metastatischen Kaskade dramatisch zugenommen. Es wurde eine direkte Visualisierung und Quantifizierung der Einzelzelle und subzellulären Parameter in Tumorzellen, Wirtszellen und ihrer Mikroumgebung aktiviert. Diese Abbildungs innerhalb des Primärtumors hat dazu geführt, beispielsweise zu der Entdeckung von diskreten Mikroumgebungen , die unterstützt entw...

Hochauflösende optische Abbildungsintravital hat zum Verständnis vielen biologischen Prozessen entscheidend erwiesen, so dass Einzelzelle und subzellulären Parameter gemessen und quantifiziert. In der Krebsforschung hat intravital Bildgebung von Tumor- und Stromazellen führte zur Entdeckung vieler Mikroumgebungs Wechselwirkungen 6-11 , die nur in dem intakten Tier sind. Entdeckungen über im Zusammenhang mit Mikroumgebungen intravasation und Verbreitung von Tumorzellen bei Brustkrebs einzelne Zelle auflösende optische Bildgebung in vivo unter Verwendung von sogar 12 bis 16 neue Marker für die Prognose und das Ansprechen auf eine Behandlung bei Brustkrebs - Patienten geführt. Die besten Imaging-Technologien für die Anzeige tief in intakten inneren lebenswichtigen Organe sind die klinischen Modalitäten (MRT, PET, CT), die eine hervorragende Aussicht auf das gesamte Organ bieten und Pathologien zeigen können, noch bevor sie klinische Symptome hervorrufen. Sie sind nicht in der Lage, however, um die frühesten Stadien der Metastasierung zeigen und die zellulären Mechanismen der Tumorprogression Fahr aufgrund ihres Mangels an Einzelzellauflösung. Durch die Zeit, Lungenmetastasen in dieser Modalitäten sichtbar sind, sind sie gut etabliert und proliferieren. In Anbetracht der Schätzung , dass 90% der disseminierten Tumorzellen , die in die Lunge gelangen entweder nicht 17 überleben oder bleiben zunächst ruhend 18 und der Beobachtung , dass sie ankommen viel früher als bisher 19 erwartet, die Abbildung der frühesten Schritte der Ankunft und das Überleben von entscheidender Bedeutung wird zu das Verständnis des Prozesses des metastasierten Seeding und ein erneutes Auftreten des Tumorwachstums an entfernten Standorten. jedoch Durchführung dieser Beobachtungen in der Lunge hat sich als äußerst schwierig erwiesen; die überwiegende Mehrheit der Imaging - Studien haben ex vivo oder Explantation Präparate verwendet 20-23, die nur einen Blick in die Lunge zu einzelnen Zeitpunkten geben. Während diese Vorbereitungen nützliche Informationen zur Verfügung gestelltenrmation, sie nicht ein vollständiges Verständnis der Wechselwirkungen, Ursache-Wirkungs-Beziehungen und Dynamik ergeben, die zwischen den verschiedenen Komponenten des Mikroumgebung auftreten. Das Fehlen eines richtigen Kreislaufsystems (und damit einhergehenden Ungleichgewicht der Homöostase) und der Trennung vom Rest des Immunsystems des Körpers macht es wünschenswert , die Schlussfolgerungen zu validieren , die diese Präparate in intaktem Gewebe in vivo zu erzeugen. Viele Gruppen haben intravital Bildgebung der intakten Lunge durchgeführt 2,4,5,24-33 mit Wearn und Deutsch die Pleura Schicht 24 und Terry entlarven die erste die erste chirurgisch zu sein ein implantierbares Abbildungsfenster 25 zu nutzen. Hochauflösende Abbildung in der Lunge wird durch die Lunge des konstanten Bewegung und verschiedene Techniken wurden entwickelt, um diese Einschränkung zu überwinden stark behindert. Wagner und Filley 27 studierte die natürliche Bewegung des Hundelungeund entwickelt , um ihre chirurgische Protokoll ihrer implantierten Fenster über einen relativ stationären Bereich zu lokalisieren , während Wagner Vakuum in seinem Fenster chirurgische Vorbereitung verwendet , um das Gewebe 28 zu immobilisieren. 34 Bronchus Klemm, sequentielle Apnoe und Gated Imaging, überabgetasteten Erwerb, Verkleben des Lungenlappens und Vakuum: Seit dieser Zeit wurde eine Vielzahl von Techniken , um die Lunge zu Bild einschließlich verwendet worden. Jeder von ihnen hat seine Vor- und Nachteile und keiner Technik hat sich als überlegen weitere 34 entstanden. Zum Beispiel Bronchus Klemm- und sequenziellen Apnoe verändern die normale Austausch von Gasen in der Lunge und kann Atelektase verursachen. Gated Imaging und überabgetastete Erwerb nicht an diesen Nachteilen leiden, sondern erfordern eine hohe Geschwindigkeit oder spezielle Bildgebungsgeräte nicht allgemein zugänglich. Schließlich beide Verklebung der Lunge und der Vakuumtechnik beide der oben erwähnten Nachteile zu vermeiden, kann aber Scherkraft induzierten Verletzungen aufweisen, wenn Sie darauf, nicht tak isten. In den letzten Jahren hat sich die Vakuumfenster für den Einsatz bei Mäusen mit Hilfe einer konfokalen und Multiphotonen - Mikroskopie 4,5,33 und hervorragende hochauflösende Bildgebung erreicht wurde 2 miniaturisiert und angepasst. Tabelle 1 dieser reichen Geschichte zusammenfasst und unterstreicht die Papiere , die neu beschreiben Fortschritte bei der Verwendung von intravital Bildgebung der Lunge Fenster. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von erweiterten Zeitraffer Multiphotonen- Intravitalmikroskopie zur Bild Metastase in der Live, intakte Lunge mit der höchsten subzellulärer Auflösung möglich. Bilder werden für bis zu 12 h erworben ein Multi Mikroskop mit einer hohen numerischen Apertur Objektivlinse und mehrere Photomultiplier-Röhre (PMT) -Detektoren ausgestattet ist. Transgener Mausmodelle werden zusammen mit fluoreszierenden hohem Molekulargewicht Dextran und fluoreszierende Protein transfizierten Tumorzellen zu fluoreszenz Label nativen Makrophagen genutzt (die Gefäße und Tumorzellen zu beschriften respectively). Während diese Wahl von fluoreszenzmarkierten Zellen Visualisierung von Tumorzell-Endothelzellen-Makrophagen-Interaktionen und Dynamik ermöglicht, wird dieses Protokoll für jeden Stamm von fluoreszierenden oder nicht-fluoreszierenden Maus arbeiten. Nach der Erfassung wird die Restdriftbewegung (falls vorhanden) ein Fidschi - Plugin 35,36 und benutzerdefinierte Makros Zeit Durchschnitt des Gefäßkanals durch unmarkierten zirkulierenden Blutzellen zu eliminieren Blitzen verursacht unter Verwendung eliminiert. Während dieses Protokoll auf die Bildgebung Metastasierung konzentriert, sind die Techniken, die für viele andere biologische Prozesse zu beobachten mit hochauflösenden Einzelzell-Bildgebung in der Lunge.

<table><tbody><tr><td>Vakuumregler aus vernickeltem Messing 1/8 NPT Innengewinde, mit Manometer, 0 - 20" Hg Vakuum</td><td>McMaster Carr</td><td>4172K12&nbsp;</td><td>Vakuumregler</td></tr><tr><td>Messing-Stachelschlauchverschraubungsadapter für 1/4" Schlauch ID x 1/8" NPTF Außengewinde</td><td>McMaster Carr</td><td>5346K13</td><td>Vakuumregler Schlauchadapter</td></tr><tr><td>Pyrex Marke Filterkolben mit Tubulation; Hals für Gummistopfen Nr. 4 vorbereitet; Fassungsvermögen: 50 ml</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>5360-50</td><td>Isolierflasche</td></tr><tr><td>Rundglas Deckgläser Dicke #1,5, 0,16 - 0,19 mm Ø 10 mm&nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260368</td><td>Deckfolien</td></tr><tr><td>Exel International Einweg-Safelet IV-Katheter; 22 g x 1 Zoll</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td>Trachealkatheter</td></tr><tr><td>PERMA-HAND Schwarz Geflochtene Seidennähte, ETHICON LIGAPAK Dosierrolle Größe 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td></td></tr><tr><td>String Flüssiger Sekundenkleber, klar, 0,14 oz</td><td>Hendel Corp.</td><td>LOC1647358</td><td>Cyanacrylat-Kleber</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat&ndash; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>155 kD Dextran</td></tr><tr><td>Labor Durchsichtiger Tygon PVC-Schlauch, 1/16" ID, 1/8" AD, 1/32" Wandstärke, 25 ft. Länge</td><td>McMaster Carr</td><td>5155T12</td><td>Dünner Schlauch & Schlauch für</td></tr><tr><td>Luer-rissbeständige Polyethylenschläuche, 1/8" ID, 1/4" AD, 1/16" Wandstärke, weiß, 50 ft. Länge &nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>5181K24&nbsp;</td><td>Dicke Schläuche</td></tr><tr><td>Entpillende Lotion</td><td>Nair-Micro</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Medical Tubing 95 Durometer LDPE</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/1</td><td>Schlauch für Schwanzvenenkatheter</td></tr><tr><td>30 G x 1 Zoll BD PrecisionGlide Nadel</td><td>BD</td><td>305128</td><td>Nadeln für Schwanzvenenkatheter</td></tr><tr><td>Puritan Unsterile Wattetupfer</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td></td></tr><tr><td>Klare Polycarbonat-Rohrverschraubung, gerade Reduzierstück für 3/32" x 1/16" Rohr ID</td><td>McMaster Carr</td><td>5117k51</td><td>Verbinder zwischen Rohren</td></tr><tr><td>Einloch-Gummistopfen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-135F</td><td>Stopper für Vakuumflasche</td></tr><tr><td>SHARP Präzisions-Barrierespitzen, für P-100, 100 & Micro; l</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>Pipettenspitze</td></tr><tr><td>Laborband</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Tiergesundheit</td><td>008897</td><td>Augensalbe</td></tr><tr><td>Gemini Cautery Kit</td><td>Harvard Apparat</td><td>726067</td><td>Cautery Pen</td></tr><tr><td>Graefe Mikro-Präparierzange; Gezahnt; Leichte Kurve; 0,8 mm Spitzenbreite; 4" Länge</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>Zange</td></tr><tr><td>Extra feine Mikro-Präparierschere 4" Gerade Scharf/Scharf 24 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td><td>Scharfe Schere</td></tr><tr><td>Mikro-Präparierschere 4" Gerade Blunt/Blunt</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5980</td><td>Blunt Schere</td></tr><tr><td>Tücher</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>Pferdegeschirr</td></tr><tr><td>PhysioSuite System</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>Vitalmonitor</td></tr><tr><td>1 ml Spritze, Tuberkulin Slip Tip</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Spritze</td></tr><tr><td>Cyano Acrylat</td><td>Heftklammern</td><td>LOC1647358</td><td>Cover Slip Adhesive</td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086291</td><td>Water Barrier</td></tr><tr><td>Adapter Luer Cannulla 1,5 - 2,2 mm</td><td>Harvard Apparat</td><td>734118</td><td>Katheteranschluss</td></tr><tr><td>PhysioSuite MausSTAT Pulsoximeter</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Pulsoximeter</td></tr><tr><td>Isoethesia (Isofluran)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Sauerstoff</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PVC-Kugelhahn, Push to Connect, 1/4 Zoll</td><td>Grainger</td><td>3CGJ7</td><td>Vakuumventil</td></tr><tr><td>Beatmungsgerät für Kleintiere</td><td>Harvard Apparatus</td><td>683</td><td>Alternative ist von Kent Scientific erhältlich: MouseVent</td></tr><tr><td>OptiMEM Reduced Serum</td><td>Medium ThermoFisher</td><td>Scientific 31985062&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>026051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Multiphotonenmikroskop</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Alternative zum kundenspezifischen Zielfernrohr</td></tr><tr><td>Umweltgehäuse</td><td>Präzisions-Kunststoffkammer</td><td>für FV1000</td><td>Alternative zum kundenspezifischen Gehäuse</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Laser Power Meter</td><td>Coherent</td><td>FieldMaxIITOP</td><td></td></tr><tr><td>Laserleistungsmesserkopf</td><td>Coherent</td><td>PM10</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-Clover Fluoreszierender Proteinvektor</td><td>Addgene</td><td>40259</td><td></td></tr><tr><td>G418 Sulfatselektives Antibiotikum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Fluoreszenz-Aktivierender Zellsortierer&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>XDP</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>40 & Mikro; m Mesh</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Kulturschale</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Maus</td><td>Jackson Labor</td><td>000664&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kim wischt</td><td>Fisher Scientific</td><td>ab 06-666-A&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

langfristige high-resolution intravitalmikroskopie in der lunge mit einem vakuum-stabilisierte imaging-fenster

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Metastasierung zu sekundären Standorten wie der Lunge, Leber und Knochen ist ein traumatisches Ereignis mit einer Mortalitätsrate von etwa 90% 1. Von diesen Standorten ist die Lunge der schwierigste im Körper, zarte Natur und entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung richtige Physiologie mit intravital optische Bildgebung aufgrund seiner geschlossenen Position zu beurteilen. Obwohl klinische Modalitäten (Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Kernspintomographie (MRI) und Computertomographie (CT)) vorzusehen noninvasive Bilder dieser Gewebe fähig sind, fehlt ihnen die Auflösung notwendig, um die frühesten seeding Ereignisse zu visualisieren, mit einem einzigen Pixel bestehend aus fast tausend Zellen. Aktuelle Modelle von metastasierendem Lungenkrebs Seeding Postulat, die Ereignisse kurz nach Ankunft eines Tumorzelle für das Überleben und das anschließende Wachstum deterministisch sind. Das bedeutet , dass in Echtzeit intravital Imaging - Tools mit Einzelzellenauflösung 2 erforderlich sind , um die Phänotypen der Aussaat cel zu definierenls und diese Modelle zu testen. Während hochauflösende optische Bildgebung der Lunge hat verschiedene ex vivo Präparaten durchgeführt wurde unter Verwendung sind diese Experimente typischerweise Einzelzeitpunkt Assays und sind anfällig für Artefakte und mögliche falsche Schlüsse aufgrund der dramatisch veränderten Umfeld (Temperatur, Überfluss, Cytokine, usw. ) aus der Entnahme aus dem Brustraum und Kreislaufsystem 3 führt. Neuere Arbeiten haben , dass die Zeit-lapse intravital optische Bildgebung der intakten Lunge gezeigt ist möglich unter Verwendung einer Vakuumabbildungsfenster 2,4,5 stabilisiert jedoch typische Aufnahmezeiten wurden auf etwa 6 Stunden begrenzt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige intravital Zeitraffer-Bildgebung der Lunge Durchführung eines solchen Fensters über einen Zeitraum von 12 Stunden verwendet wird. Die Zeitraffer-Bildsequenzen dieser Methode unter Verwendung ermöglichen die Visualisierung und Quantifizierung von Zell-Zell-Interaktionen, Membrandynamik und Gefäßperfusion in der Lunge. Wir weiter dEscribe eine Bildverarbeitungstechnik, die eine beispiellos klare Sicht auf die Lunge microvasculature gibt.

Um die Art der Ergebnisse zeigen , die mit diesem Verfahren erreicht werden kann, injizierten wir E0771-LG Tumor mit dem fluoreszierenden Protein Clover in die Schwanzvene von Mäusen MacBlue 44 markierten Zellen zu Zeitpunkten vor der Operation variiert. Nach der Operation wurde 155 kD Rhodamin markiertes Dextran IV injiziert das Gefäßsystem und Zeitraffer-Bildgebung zu markieren durchgeführt wurde. Wenn Mäuse Abbil...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie zur Durchführung einer langfristigen hochauflösenden Einzelzellbildgebung der intakten Lunge in Echtzeit unter Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Langzeit-Aufnahmen mit hoher Auflösung auf Einzelzell-Ebene im intakten Lungengewebe mithilfe eines vakuumstabilisierten Bildgebungs-Fensters durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise welche Wechselwirkungen zwischen Stroma- und Tumorzellen in den frühesten Phasen der Metastasierung entstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das lebende, intakte Lungengewebe theoretisch bis zu 12 Stunden lang mit Einzelzell-Auflösung sichtbar gemacht werden kann.Beginnen Sie damit, ein 7,6 cm langes Stück 2-0-Nahtmaterial mit einem Doppelknoten 0,6 cm oberhalb der Hülse an einen trachealen Katheter zu binden. Tragen Sie anschließend Augensalbe auf die Augen einer anästhesierten Maus auf und verwenden Sie Enthaarungscreme, um die Haare von der linken Körperseite des Tieres vom Brustmittellinie bis zu einem Viertel des Rückens und von der Achselhöhle bis knapp unterhalb des Rippenbogens zu entfernen. Entfernen Sie überschüssige Creme und desinfizieren Sie die freigelegte Haut mit 70 % Ethanol.Als Nächstes intubieren Sie das Tier und binden die 2-0-Naht um die Schnauze unterhalb der Vorderzähne. Bringen Sie das Tier in den Operationsbereich, achten Sie darauf, die Katheter nicht zu lösen, und schalten Sie den Beatmungsapparat ein.Schließen Sie das Beatmungsgerät an den Trachealkatheter an. Befestigen Sie den Katheter anschließend mit Klebeband an der Schnauze und am linken Vorderbein. Nachdem Sie die fehlende Reaktion auf eine Zehenquetschung bestätigt haben, entfernen Sie mit einer scharfen Schere einen Quadratzentimeter Haut über der linken Brustwand.Heben Sie das Brustfettgewebe an und koagulieren Sie alle sichtbaren Blutgefäße. Entfernen Sie anschließend das Fettgewebe und die Muskelschicht bis hin zum Rippenkorb, wobei darauf geachtet werden muss, die axilläre Vene an der Basis des Vorderbeins nicht zu verletzen. Heben Sie mit einer Pinzette die sechste Rippe an.Dann, unter Halten der scharfen Schere in einem flachen Winkel von fünf Grad, die Rippe nahe der Kante der Öffnung in der Haut schneiden. Vier aufeinanderfolgende Rippen entfernen, um die Öffnung in der Brustwand zu vergrößern und das gesamte Lungenlappen freizulegen. Anschließend die Maus vorsichtig auf den Mikroskopie-Präparat übertragen.Bei ausgeschaltetem Vakuum füllen Sie die innere Kammer des Vakuumfensters mit PBS. Drehen Sie die Maus um und positionieren Sie die freigelegte Lunge über das Vakuum-Abbildungs-Deckglasfenster. Schalten Sie langsam das Vakuum ein.Platzieren Sie einen Haltegurt, der aus zweifach gefaltetem Filterpapier besteht, über der Brust der Maus und befestigen Sie den Gurt mit Klebeband an der Plattform. Anschließend befestigen Sie ein Pulsoximeter an der Pfote des Tieres. Danach stellen Sie die Umweltkammer auf die Plattform und schalten die Heizung ein, um die Maus auf einer physiologischen Temperatur zu halten.Wenn sich das Tier in Position befindet, bringen Sie das Objektiv mit einer numerischen Apertur von 25 durch 95 nahe an die Deckglasoberfläche heran. Im Epifluoreszenzmodus betrachten Sie den Fitzy-Kanal und fokussieren das Lungengewebe scharf. Danach laden Sie eine sterile Spritze mit 100 Mikrolitern der Tumorzellsuspension, entfernen die PBS-Spritze aus dem Katheter in der Schwanzvene und verbinden die Tumorzell-Spritze.Injizieren Sie die Tumorzellen langsam in die Schwanzvene. Anschließend schließen Sie die PBS-Spritze erneut an den Katheter der Schwanzvene an und verfolgen Sie die Verteilung der Tumorzellen im Lungengewebe über das Okular des Mikroskops. Ersetzen Sie nun die PBS-Spritze durch eine mit 100 Mikrolitern Rhodamin-Dextran gefüllte Spritze und injizieren Sie das Dextran langsam über den Schwanzkatheter in die Maus.Nach der Dextran-Applikation erfolgt ein Spülvorgang mit 50 Mikroliter sterilem PBS. Anschließend werden Bilder an jeder zuvor lokalisierten Tumorzellposition aufgenommen, um den Blutfluss und die Integrität der Gefäßstruktur sichtbar zu machen. Einundzwanzig Stunden nach der Injektion können einzelne Tumorzellen beobachtet werden, die mit Makrophagen und Monozyten innerhalb der Gefäße interagieren.Die Stabilität der Bildgebung ist so hoch, dass aufeinanderfolgende Z-Stapel des Feldes aufgenommen und eine dreidimensionale Rekonstruktion erstellt werden können. Hier wird ein Mosaik aus fünf mal fünf Bildfeldern gezeigt, das ein Sichtfeld von 890 Mikron abdeckt, über 200 Aufnahmen und fünf Minuten hinweg, 15 Mikron unterhalb der Oberfläche der Lunge einer einzelnen metastatischen Läsion, 12 Tage nach Injektion. Trotz des großen Sichtfelds ermöglicht die hohe Auflösung der zugrundeliegenden Einzelbilder, aus denen das Mosaik zusammengesetzt ist, die Erfassung subzellulärer Ereignisse, wie beispielsweise die Mitose einer einzelnen Zelle, wie durch die Chromosomentrennung belegt.Die intravasale Injektion eines hochmolekularen, fluoreszenzmarkierten Dextrans führt zur Markierung des vaskulären Lumens; ungefärbte zirkulierende Erythrozyten und Leukozyten können jedoch den Dextran verdecken. In den kleinen Kapillaren der Lunge führt diese Verdeckung zu einem Flimmern des Dextran-Signals und zu einem Verlust der Abgrenzung der vaskulären Strukturen. Die hohe räumliche Stabilität, die durch dieses Protokoll erreicht wird, ermöglicht eine zeitliche Mittelung des Blutkanals, ohne Unschärfe zu erzeugen, wodurch die vorübergehenden Verdeckungen kompensiert werden.Die anderen Signalkanäle können anschließend über die Gefäße gelegt werden, um eine klare Sicht auf die Gefäßränder zu ermöglichen. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in etwa einer Stunde abgeschlossen werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, keine größeren Blutgefäße zu durchtrennen, ohne sie vorher zu koagulieren, und das Lungengewebe keinesfalls zu berühren.Mit dieser Methode können die frühesten Stadien der Tumorzellverbreitung und -proliferation sichtbar gemacht werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine intravitale Bildgebung in der intakten Lunge mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungsfenster durchführt. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Krebsforschung

Wir zeigen, wie 2-Photonen-Mikroskopie für die Beobachtung der Dynamik der neutrophilen Granulozyten im infizierten Lungengewebe verwenden, während sie Krankheitserreger oder phagozytieren produzieren neutrophilen extrazellulären Traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

In diesem Video beschreiben wir die intravitale Bildgebung einer Bauchspeicheldrüse einer Maus durch ein stabilisiertes Fenster zur Langzeitvisualisierung der zellulären Dynamik.

Intravitale Bildgebung: Eine Methode zur Beobachtung der Bauchspeicheldrüse der Maus auf zellulärer Ebene durch ein stabilisiertes Bildgebungsfenster

Dieses Protokoll beschreibt die intravitalen Bildgebung von transgenen Mäusen zellspezifische fluoreszierenden Marker zum Ausdruck zu bringen. Intravitalen Bildgebung stellt eine nicht-invasive Methode für hochauflösende Beobachtungen an lebenden Tieren mit implantierbaren Windows durch die mikroskopische Visualisierung von Prozessen möglich ist. Diese Methode ist besonders nützlich, um längs Prozesse zu studieren.

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

In vivo wurde die hochauflösende Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit dem pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster erleichtert.

Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster

Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.

Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Hier stellen wir ein Protokoll zur operativen Implantation eines dauerhaft verweilbaren optischen Fensters für den murinen Thorax vor, das eine hochauflösende, intravitale Bildgebung der Lunge ermöglicht. Die Permanenz des Fensters macht es gut geeignet für die Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse in der Lunge, insbesondere solcher, die sich langsam entwickeln, wie z.B. das metastatische Fortschreiten von disseminierten Tumorzellen.

Ein permanentes Fenster zur Untersuchung von Krebsmetastasen in der Lunge

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges Brustbildfenster mit einem austauschbaren Deckel (R.MIW). Die intravitale Mikroskopie nach Implantation des R.MIW ermöglicht eine Längs- und Mehrtagesbildgebung der gesunden und erkrankten Brustdrüse mit zellulärer Auflösung während der verschiedenen Entwicklungsstadien.

Längsschnittliche intravitale Mikroskopie unter Verwendung eines Brustbildgebungsfensters mit austauschbarem Deckel

Die intravitale Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um Leukozyten-Endothel-Interaktionen und Kapillarperfusion in Echtzeit zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Abbildung und Quantifizierung dieser Parameter im pulmonalen Mikrokreislauf mit einem vakuumstabilisierten Lungenbildgebungssystem.

Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem die transplantierte linke Lunge der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie intravital abgebildet werden kann. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen in Echtzeit nach einer Lungentransplantation von Mäusen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die intravitale Bildgebung einer abgeschwächten, BSL-2-zugelassenen Mycobacterium tuberculosis. Spannung in der Mauslunge unter Verwendung eines permanenten Lungenfensters. Dieser Ansatz ermöglicht eine longitudinale, einzelzellige Auflösungsanalyse früher Wirts-Pathogen-Interaktionen, einschließlich bacillärer Lokalisation, vaskulärer Dynamik und Makrophagenaufnahme innerhalb derselben Lungenmikroumgebung.

Intravitale Bildgebung der abgeschwächten auxotrophen Mycobacterium tuberculosis in der Mauslunge während früher intravaskulärer Infektion

Lernen Sie die Langzeit-Intravitalmikroskopie der intakten Lunge mit einem vakuumstabilisierten Bildfenster. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Einzelzellbildgebung zur Untersuchung von Stroma-Tumor-Zell-Interaktionen während der Metastasierung.

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

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