Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von inneren retinalen Neuronen in der Flat-Mount-Maus-Netzhautpräparation durchzuführen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der retinalen Neurobiologie zu beantworten, wie z.B. die Vielfalt der Neuronen, ihre synaptischen Verbindungen unter normalen und pathologischen Bedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl die vertikalen als auch die lateralen Verbindungen erhalten bleiben, so dass die Netzhautschaltkreise mit großen lateralen Komponenten untersucht werden können.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Netzhaut ein dünnes, empfindliches Gewebe ist, das mit großer Sorgfalt und Geduld behandelt werden muss. Übung ist jedoch der beste Weg, um es zu meistern. Um diesen Vorgang zu beginnen, rollen Sie die Augäpfel der Maus in ein sauberes Papiertuch, um jegliches Blut zu entfernen.

Tauchen Sie sie dann in die karbogenierte Ringer-Lösung für Säugetiere. Als nächstes stanzt du mit einer 23-Gauge-Nadel ein Loch in den Limbus und halbierst die Augäpfel, indem du mit einer Mikroschere entlang des Limbus schneidest. Entfernen Sie dann die Hornhaut und die Linse mit einer feinen Pinzette.

Für die retinale Whole-Mount ziehen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die gesamte Netzhaut vom pigmentierten Epithel ab und machen vier 1,5 bis zwei Millimeter lange orthogonale Schnitte vom Rand in Richtung des Sehnervenkopfes. Tauchen Sie danach eine gestanzte Nitrozellulosemembran in die Schale und ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig mit der GCL-Seite nach oben darüber. Platzieren Sie dann den Sehnervenkopf in das mittlere Loch, wenn Sie eine Whole-Mount-Netzhaut vorbereiten.

Übertragen Sie anschließend die Membran mit der Netzhaut in eine andere saubere Schüssel. Glätten Sie die Netzhaut vorsichtig als Malteserkreuz mit einem feinen Pinsel und legen Sie alle vier Kanten über die Löcher. Tupfen Sie die Nitrozellulosemembran mit einem Stück trockenem Filterpapier ab und entfernen Sie die glasartige und innere Begrenzungsbahn mit einer Pinzette und einem Pinsel.

Stellen Sie sicher, dass alle Netzhautränder vollständig mit der Membran verbunden sind, bevor Sie die Baugruppe mit einem versiegelten Glasabdeckglas an der Unterseite in die Aufnahmekammer übertragen. Befestigen Sie die Membran mit Vakuumfett auf dem Deckglas und rehydrieren Sie die Netzhaut mit der externen Lösung. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen unter der Baugruppe eingeschlossen werden.

Stellen Sie dann die Kammer auf den Tisch eines aufrechten Mikroskops. Gießen Sie die Kammer mit 34 Grad Celsius carbogenisierter externer Lösung mit einer Geschwindigkeit von etwa drei Millilitern pro Minute. Untersuchen Sie zuerst die Netzhaut unter einer 10-fach subjektiven Linse.

Verwenden Sie dann eine 60-fache Wasserimmersionslinse, um GCL- und INL-Neuronen unter DIC und der Epifluoreszenzeinstellung zu sehen. Um tdTomato-exprimierende SACs sichtbar zu machen, verwenden Sie eine weiße LED-Lichtquelle in Kombination mit einem Anregungsfilter von 554 Nanometern und einem Emissionsfilter von 581 Nanometern. Bei diesem Verfahren filtrieren Sie die innere Lösung durch einen Spritzenvorsatzfilter in das benutzerdefinierte Verfüllfilament.

Führen Sie dann das Filament in eine frisch gezogene Mikropipette ein und geben Sie die innere Lösung in der Nähe der Spitze ab, bis die Lösung den Silberelektrodendraht mehr als fünf Millimeter bedeckt. Befestigen Sie anschließend die Mikropipette mit einem Saugzug an einem Elektrodenhalter, durch den der Druck im Inneren der Elektrode durch Drücken oder Ziehen des Kolbens einer mit dem Schlauch verbundenen 10-Milliliter-Kunststoffspritze eingestellt werden kann. Platzieren Sie dann die Pipette unter dem Objektiv und bringen Sie sie bis etwa 100 Mikrometer über die Netzhaut.

Verwenden Sie im Stromfolgermodus den DC-Offset, um das stehende Gleichspannungssignal auf Null zu setzen. Messen Sie den Pipettenwiderstand im Stromzangenmodus, indem Sie Rechteckströme mit fester Amplitude durch die Pipette injizieren, während sie sich im Bad befindet. Neutralisieren Sie die Differenz, indem Sie den Raccess-Knopf drehen und den Messwert verwenden, um den Pipettenwiderstand zu berechnen.

Bringen Sie die Elektrode danach langsam auf etwa 10 Mikrometer über die Netzhaut. Üben Sie Überdruck auf die Elektrode aus. Beobachten Sie dann, wie sich die Reflexion in der Nähe der Pipettenspitze ändert, wenn sie sich der Netzhaut nähert.

Drücken Sie die Pipette schnell aber vorsichtig in den GCL und reduzieren Sie sofort den Überdruck. Bewegen Sie die Pipette in Richtung eines markierten Neurons und vermeiden Sie den Kontakt mit anderen Neuronen, Blutgefäßen und Endfüßen von Müller-Zellen. Üben Sie bei Bedarf mehr Überdruck aus, um ein Verstopfen der Elektrode zu verhindern.

Positionieren Sie anschließend die Pipettenspitze in der Nähe des markierten Neurons, bis ein Grübchen sichtbar ist. Lassen Sie dann den Überdruck ab und lassen Sie die Plasmamembran zurück auf die Pipettenspitze prallen. Wenden Sie 20 bis 120 Pikoampere negative Ströme an die Pipette an, um die Bildung einer Gigaohm-Dichtung zu unterstützen.

Es ist wichtig, dass die Zellmembran nach dem Ablassen des Überdrucks zurückprallt, da eine hervorragende Abdichtung, die auf natürliche Weise zwischen der Membran und der Pipettenöffnung gebildet wird, wichtig ist, um die Zellmorphologie nach der Aufzeichnung zu erhalten. Ziehen Sie die Plasmamembran bei Bedarf durch einen sanften Sog in die Pipette. Warten Sie fünf Minuten nach der Versiegelungsbildung, um die Zellmembran zu durchbrechen, damit die verschüttete innere Lösung durch Superfusion entfernt werden kann.

Schalten Sie nach dem Bruch der Membran und im aktuellen Clamp-Modus die Brückenbalance ein und stellen Sie sie mit dem Raccess-Knopf ein. Zeichnen Sie die erregenden und hemmenden postsynaptischen Ströme im Spannungsklemmmodus auf, indem Sie die Zelle auf Umkehrpotentiale halten. Entfernen Sie nach der Aufnahme vorsichtig die Pipette aus dem Soma.

Bringen Sie die Baugruppe aus der Kammer in eine saubere Schüssel. Nehmen Sie dann die Netzhaut ab und befestigen Sie sie wieder auf einer anderen abgeflachten Nitrozellulosemembran, ohne Löcher zu stanzen, um eine Ebenheit der Netzhaut während der Fixierung zu gewährleisten. Das Gewebe ist nun bereit für die Färbung.

Diese Bilder zeigen, dass cholinerge Zellen sowohl in GCL als auch in INL zuverlässig durch tdTomato-Fluoreszenz identifiziert und für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung unter DIC anvisiert werden können. Die Oszillation ihrer Membranpotentiale kann durch Stromklemmenaufzeichnung aufgedeckt werden, und die Oszillation, die durch die inhibitorischen und exzitatorischen synaptischen Ströme angetrieben wird, wird aufgedeckt, indem die Zellen unter den Bedingungen der Spannungsklemme bei null Millivolt bzw. minus 75 Millivolt gehalten werden. Hier zeigt die histologische Charakterisierung der aufgezeichneten Zellen nach Hoke die typische dendritische Morphologie und Schichtungsniveaus der SAC im IPL.

Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Netzhautmembrananordnung in der Aufnahmekammer zu befestigen und zu rehydrieren, ohne Luftblasen darunter einzuschließen, und zwar auf eine feste und empfindliche Weise, um eine beschreibbare Probe zu erhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Dual-Patch-Clamp-Aufzeichnungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Oszillationen der Zielzellen von denselben synaptischen Mechanismen gesteuert werden. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der retinalen Neurobiologie den Weg, die Synchronizität der Oszillation zwischen benachbarten retinalen Neuronen in photorezeptordegenerierten Netzhäuten zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Glaskörper entfernen und eine retinale Flat-Mount für die gezielte Aufzeichnung von Patch-Clamps in Originalgröße von inneren retinalen Neuronen vorbereiten können.