Schnelle Erfassung von 3D-Bildern mit hoher Auflösung Episcopic Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, mit Standard-Laborgeräten schnell hochauflösende digitale 3D-Bilder von biologischen Proben zu erfassen. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsbiologie durch die Visualisierung und Dynamik komplexer morphologischer Merkmale beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie mit Standard-Laborgeräten ausgestattet ist und nur minimale Vorkenntnisse erfordert.

Das Verfahren wird von Jungang Huang, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Nach der Dissektion und Fixierung des Embryos, wie im Textprotokoll beschrieben, ersetzen Sie das Fixiermittel durch eine Reinigungslösung und drehen Sie die Probe ein bis zwei Wochen lang vorsichtig auf einer Wippe bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Probe auf 10%Formalin umfüllen und weitere zwei Tage auf der Wippe ruhen lassen.

Waschen Sie die Probe am dritten Tag drei Mal lang in PBS. Anschließend werden die Proben in einer aufsteigenden Ethanolreihe bei Raumtemperatur auf einer sanften Wippe für jede Konzentration zwei Stunden lang dehydriert. Nach der 100%igen Ethanol-Dehydratisierung wird die Probe eine Stunde lang lichtgeschützt in eine Färbelösung überführt.

Ersetzen Sie dann die Lösung durch frische Färbelösung, um die Probe über Nacht zu etikettieren. Tauchen Sie die Probe am nächsten Morgen mindestens drei Stunden lang bei vier Grad Celsius in eine Eins-zu-Eins-Mischung aus frisch zubereiteten Infiltrations- und Färbelösungen auf einer Wippe. Am Ende der Inkubation überführen Sie den Embryo in eine Infiltrationslösung für eine weitere dreistündige Schaukelinkubation.

Ersetzen Sie dann den Überstand durch frische Versickerungslösung, um drei weitere Tage bei vier Grad Celsius zu schaukeln. Orientieren Sie den Embryo am vierten Tag in einer Einbettform und legen Sie die Form auf Eis. Mischen Sie Lösung B mit der Infiltrationslösung und tauchen Sie die Form dann vorsichtig in kalte Einbettlösung bei vier Grad Celsius.

Bestätigen Sie nach etwa drei Stunden mit einer Spitze, dass sich die Lösung verfestigt hat, und drücken Sie die Probe aus der Form. Schneiden Sie überschüssiges Einbettmaterial ab und richten Sie den Probenblock dann in einer neuen Form in Kreuzausrichtung neu aus. Legen Sie anschließend das gesamte Setup in einem Abzug auf Eis.

Geben Sie vorsichtig Einbettlösung in die neue Form, bis die Form untergetaucht ist. Setze dann einen Blockhalter auf die Form. Nach drei bis vier Stunden ziehen Sie die Einbettungsform ab und legen den Block unter ein Stereomikroskop mit Schrägbeleuchtung, um die Position der Probe innerhalb des Blocks zu bestimmen.

Markieren Sie auf der Blockfläche Rasterlinien um die Probe und verwenden Sie die Linien als Hilfslinien zum Beschneiden von überschüssigem Einbettungsmaterial. Um die Probe abzubilden, klemmen Sie den Block zuerst auf ein Mikrotom und erhalten Sie einen frischen Oberflächenschnitt der Probe. Montieren Sie dann ein Stereo-Zoom-Mikroskop waagerecht auf die Blockfläche der Probe und schalten Sie das Mikroskop und den zugehörigen Computer ein.

Starten Sie als Nächstes die Bildaufnahmesoftware und verwenden Sie den Live-View-Modus in der Bildgebungssoftware, um die Optik auf die Blockfläche zu fokussieren. Richten Sie das Mikroskop und das Mikrotom nach Bedarf so aus, dass sich die Blockfläche in der Mitte des Suchers befindet. Einer der wichtigsten Schritte dieses Verfahrens ist die Aufnahme von Bildern an der festen Ausgangsposition des Mikrotoms.

Passen Sie den Zoom an, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Blockfläche innerhalb des Suchers befindet. Wählen Sie dann den grün fluoreszierenden Proteinfilter aus. Fahren Sie mit dem Vorschneiden des Blocks fort, bis das Probengewebe erscheint, und fokussieren Sie das Bild nach Bedarf neu.

Nachdem Sie die Belichtungszeit manuell gemessen und eingestellt haben, können Sie nach jedem neuen Schnitt Bilder der Blockfläche aufnehmen und speichern und die wichtigen Bildaufnahmeparameter aufzeichnen. Exportieren und konvertieren Sie am Ende der Bildsitzung alle Bilddateien in das JPEG-Format und verwenden Sie die entsprechende Bildbearbeitungssoftware, um alle Originalbilder zu invertieren und die Helligkeit und den Kontrast der Bilder nach Bedarf anzupassen. Laden Sie alle verarbeiteten Bilder in eine 3D-Visualisierungssoftware hoch und folgen Sie den Anweisungen.

Richten Sie alle Bilder im automatischen Modus aus und zeigen Sie die 3D- und 2D-Ergebnisse an. In diesem repräsentativen Bild einer Ganzmontage-Oberflächenansicht eines embryonalen Tag 15,5 Mausembryos, der wie gerade gezeigt präpariert und abgebildet wurde. Die detaillierten morphologischen Merkmale der Haut, einschließlich der Schnurrhaare und der sich entwickelnden Haarfollikel, können beobachtet werden.

Wichtig ist, dass die Auflösung der virtuellen Schnittansicht einer embryonalen Probe am Tag 15,5, die mit dieser Methode abgebildet wurde, ähnlich wie bei einem histologischen Standardschnitt ist. Einmal gemeistert, kann die gesamte Prozedur nach der Vorbehandlung mit der Clearing-Lösung in einer Woche abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Färbelösung während des Infiltrations- und Einbettungsschritts bei vier Grad vor Licht zu schützen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Skalenfärbung, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den spezifischen Verteilungsmustern der Zelltypen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Laborgeräte verwenden, um hochauflösende 3D-Bilder von biologischen Proben für ihre morphometrische Analyse zu erfassen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Fixier-, Flecken- und Infiltrationslösung äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Abzug und das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.