Name: Schnelle Erfassung von 3D-Bildern mit hoher Auflösung Episcopic Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Lernen Sie die episkopische Mikroskopie zur schnellen Erfassung hochauflösender 3D-Bilder von Maus-Embryonen. Diese Methode ermöglicht detaillierte morphometrische Analysen embryonaler Strukturen mit Standard-Laborausrüstung.

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Wir danken Dr. Yichen Huang, Dr. Chunming Guo und Dr. Zhenfang Zhou für ihre technische Unterstützung. Diese Forschung wurde von NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) und der American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL) finanziert.

Alle Tier Anwendungen werden von der Institutional Animal Care und Use Committee bei Boston Kinderkrankenhaus zugelassen. 1. Probenvorbereitung <ol><li> Timed Paarung <ol><li> Legen Sie eine C57Bl6 Wildtyp-Männchen und ein Weibchen zusammen in der gleichen Käfig. </li><li> Prüfen Sie, ob die Bildung eines Gegenstecker früh am nächsten Morgen. Der Gegenstecker ist (aka, vaginal oder Kopulation Stecker) eine gehärtete gallertartig Ablagerung der Vagina, blockiert. </li><li> Stellen Sie den Stecker Datum wie embryonale Tag 0.5 (E0.5). </li></ol></li><li> Isolierung von Maus - Embryonen <ol><li> Euthanize trächtige Weibchen von CO 2 Ersticken. </li><li> Setzen Sie Mäuse in Rückenlage auf einem absorbierenden Kissen und Spray Bauchbereich mit 70% Ethanol. </li><li> Heben Sie die Haut und machen einen anfänglichen 5 mm Schnitt an der Schwanzbauchregion mit chirurgische Scheren. Schneiden Sie und entfernen Sie die Bauchhaut vollständig die inneren Organe aussetzen </li><li> Schneiden Sie in der Nähe von vagina die gesamte Gebärmutter zu entfernen. </li><li> Schneiden Sie zwischen Implantationsstellen entlang der Uterushorn. Jedes Segment oder conceptus sollte innerhalb nur ein Embryo haben. </li><li> Halten Sie die Gebärmutter-Segmente in 1x eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li></ol></li><li> Embryo Dissektion <ol><li> Platzieren Sie jede conceptus in einer separaten Schüssel mit eiskaltem PBS unter einem Stereoskop. </li><li> Entfernen Sie Gebärmuttergewebe, Plazenta und dann sequentiell Eihüllen mit feinen Dissektionszangen. </li><li> Übertragen Sie die seziert Embryo in einen 50-ml-Röhrchen mit 1x eiskaltem PBS eine große Transferpipette. Vermeiden Embryo Aufnehmen direkt mit einer Pinzette Gewebeschäden zu minimieren. </li></ol></li><li> Fixierung <ol><li> Fixieren die sezierten Embryonen in 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung bei 4 ° C für mehr als 24 h mit mindestens 10 Probenvolumina von Fixativ. </li></ol></li><li> Vorbehandlung <ol><li> Bereiten Sie die Clearing-Lösung: 4M Harnstoff, 10% Glycerin, 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) in doppelt destilliertem Wasser. </li><li> Ersetzen Sie das Fixiermittel mit der Clearing-Lösung. </li><li> Vorsichtig drehen für auf einer Wippe bei Raumtemperatur 1 die Probe - 2 Wochen. Tauschen Sie die Clearing-Lösung einmal auf dem zweiten und dritten Tag. Die Probe wird langsam klar und durchscheinend. </li><li> Ersetzen Sie die Clearing-Lösung mit 10% Formalin und verlassen auf einer Wippe für 2 Tage. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Waschen Sie die vorbehandelten Proben mit 1x PBS 3 mal für jeweils 5 Minuten. </li><li> Entwässern Proben in einer aufsteigenden Ethanolreihe bei Raumtemperatur auf einem sanften Rocker. Für E15.5 Embryonen, verwenden eine aufsteigende Ethanolreihe einschließlich 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% und 100% Ethanol, 2 Stunden jeden Schritt. Für ältere Embryonen, muss die Inkubationszeit erhöht werden. </li></ol></li><li> Die Färbung <ol><li> Bereiten Sie Färbelösung: add 0,1375 Gramm Eosin Y Dinatriumsalz und 0,0275 g Acridinorange hemi (Zinkchlorid) -Salzes zu 50 ml 100% Ethanol. Rühre 2 Stunden. Filter mit einem Filterpapier. Lagerung bei Raumtemperatur und vermeiden Licht, indem sie mit Alufolie abdecken. </li><li> Übertragen Probe zu der Färbungslösung für 1 Stunde. </li><li> Ersetzen mit frischem Färbelösung und Flecken über Nacht. </li></ol></li><li> Infiltration <ol><li> Bereiten Sie Infiltrationslösung: Kombinieren Sie 100 ml Lösung A von JB-4 Einbettungssatz, 1,25 g Katalysator C, 0,275 g Eosin Y Dinatriumsalz und 0,055 g Acridinorange Hemi (Zinkchlorid) Salz. Rühre 2 h (200 Upm) in einem Eisbehälter zu mischen, und dann mit dem Filterpapier gefiltert. </li><li> Bewahren Sie die Infiltrationslösung bei 4 ° C und vermeiden Licht durch Abdecken mit Aluminiumfolie. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen Lösung Infiltrations: Färbelösung (1: 1), und Inkubation für mindestens 3 Stunden auf einer Wippe bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen Lösung Infiltrations und Inkubation für 3 hr auf einer Wippe in einem kalten Raum. </li><li> in einem kalten Raum auf einem sanften Rocker für drei weitere Tage ersetzen einmal Infiltrationslösung jeden Tag, und lassen. </li></ol></li></ol> 2. Embedding <ol><li> Halten Sie die Lösung B und Infiltrationslösung auf Eis. </li><li> Machen Sie Embedding Solution (01.25 der Lösung B und Infiltrationslösung) unmittelbar vor dem Einbetten. </li><li> Richten Sie die Probe in einer Einbettform, dann gießen kalt Embedding-Lösung in die Einbettform sanft. Re-Orientierung mit einem Stift, wenn nötig. </li><li> Verwenden Sie einen Stift zu prüfen, ob die Embedding-Lösung verfestigt wird. Schieben Sie den Probenblock heraus und schneiden Sie es, wenn nötig. </li><li> Richten Sie die Probe und die separate Form mit einer Querorientierung zu erhalten. </li><li> Setzen Sie einen Blockhalter auf der Oberseite der Einbettform. gießen Sie vorsichtig Embedding-Lösung in die Form, bis die Form und der Blockhalter durch Einbetten Lösung eingetaucht sind. </li><li> Halten Sie die Probe in einem Sekundärbehälter und lassen Sie esauf Eis für 3 bis 4 Stunden in einem Abzug. </li><li> Speichern die verfestigten Proben in einem 4 ° C. </li><li> Ziehen Sie die Einbettform entfernt. Setzen Sie den Block unter dem Stereomikroskop mit schräger Beleuchtung Position der Probe in dem Block zu inspizieren. Auf der Blockfläche, die Probenmarkierung Gitterlinien um. </li><li> Schneiden Sie den Block zu entfernen, um Zugang Materialmenge Einbetten der markierten Gitterlinien als Referenzen. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Klemmen Sie den Probenblock zu dem Mikrotom und erhalten eine frische Schnittfläche. Set Schnittdicke (zB e9.5-10.5, 1,5 &amp; mgr; m; e11.5-12.5, 2,0 &amp; mgr; m; e13.5-15.5, 2,5 &amp; mgr; m; E16.5-älter, 3 &amp; mgr; m). Halten Sie die Probe / Block an der Ausgangsposition von Mikrotom. </li><li> Montieren Sie den Stereo-Zoom-Mikroskop horizontal um den Block Oberfläche der Probe gegenüber. </li><li> Schalten Sie den Computer und Mikroskop, und starten Sie die Bildaufnahme-Software. </li><li> Visualisieren und konzentrieren sich die Optik auf den Block-faceunter der &quot;Live-Ansicht&quot; Modus der Imaging-Software. </li><li> Richten Mikroskop und Mikrotom, wenn nötig, so dass die Blockfläche in der Mitte des Suchers ist. </li><li> Stellen Sie den Zoom, so dass der gesamte Block-Gesicht im Sucher ist. </li><li> Wählen grün fluoreszierendes Protein (GFP) -Filter (Anregung 470 ± 20 nm, dichroitische 495 nm, Emission 525 ± 25 nm) und neu auszurichten, wenn nötig. </li><li> Messen Sie und stellen Sie die Belichtungszeit manuell (zB 80-400 Mini sec). </li><li> Erwerben Sie Bilder des block Gesicht nach jedem frischen Schnitt und Speichern von Bildern automatisch, wenn möglich. </li><li> Zeichnen Sie wichtige Parameter wie Auflösung, Schnittdicke und Zoom. </li><li> Nachdem die gesamte Probe, Export Finishing und alle Bilddateien in das JPEG-Format, wenn notwendig, zu konvertieren. </li><li> Invert alle Originalbilder eine Bildverarbeitungssoftware, und die Helligkeit und den Kontrast. </li><li> Speichern Sie alle bearbeiteten Bilder in einem separaten Ordner. </li></ol> 4. 3DVisualisierung <ol><li> Laden Sie alle bearbeiteten Bilder zu einem 3D-Visualisierungssoftware gemäß den Anweisungen. </li><li> Eingangsauflösung und Schnittdicke um alle Bilder zu volumetrischen Daten zu konvertieren (dh Voxel - Größe) und die 3D - Datei zu speichern. </li><li> Richten Sie alle Bilder den automatischen Modus. Passen Sie manuell einzelne Bilder, wenn nötig. </li><li> Speichern Sie das ausgerichtetes Bild zu einem neuen Dateinamen. </li><li> Analysieren morphometrischen Eigenschaften der Probe die 3D-Visualisierungssoftware. </li></ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
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<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier präsentieren wir eine modifizierte Protokoll Routinelaborgeräte mit seriellen HREM Bilder zu erwerben, die für die schnelle 3D-Visualisierung und morphometrische Analyse komplexer Strukturen kompatibel sind. Da die hochauflösenden Bilder direkt von der Blockfläche statt einzelner Abschnitte genommen werden, werden die feinen morphologischen Merkmale erhalten und schnell digital in einem 3D-Visualisierungsprogramm rekonstruiert. 3D-Bildgebung bietet signifikante Vorteile bei der Visualis...

Das Aufkommen von 3D-Bildgebungstechnologien hat die Möglichkeit der systemischen Analyse detaillierter morphologischer Merkmale während der Entwicklung des Fötus eröffnet. Eine Vielzahl von 3D-Bildgebungsmodalitäten ist jetzt verfügbar, darunter die Mikromagnetresonanztomographie (Mikro-MRT), die Mikro-Computertomographie, der Hochfrequenz-Ultraschall, die optische Kohärenztomographie, die optische Projekttomographie und die episkopische Mikroskopie1-4. Jede Modalität hat ihre eigenen einzigartigen Merkmale in Bezug auf Auflösung, Kontrast, Geschwindigkeit, Kosten, In-utero-Fähigkeit und Verfügbarkeit.
Episkopische Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) und hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) sind episkopische Mikroskopie-Bildgebungsverfahren4. Dabei werden anstelle von Gewebeschnitten kontinuierlich hochauflösende Serienbilder von der Blockfläche aufgenommen. Die resultierenden Bilder spiegeln detaillierte morphologische Merkmale mit minimaler oder keiner Gewebeverzerrung originalgetreu wider. Die erfassten volumetrischen Daten lassen sich leicht in hochauflösende 3D-Bilder konvertieren, die für eine genaue morphometrische Analyse geeignet sind. Aufgrund der relativ niedrigen Kosten und der hohen Auflösung sind HREM und EPIC die überlegenen Alternativen für die systemische Bewertung von Mausmodellen für menschliche Geburtsfehlergeworden 2,4-8.
Sowohl die EFIC- als auch die HREM-Methode erfordern, dass Proben in das geeignete Medium eingebettet werden. EFIC erkennt Autofluoreszenz, die vom eingebetteten Gewebe emittiert wird. Aus diesem Grund ist es auf Proben beschränkt, die ein hohes Maß an Autofluoreszenz emittieren, aber nicht auf Proben mit relativ schwacher Autofluoreszenz, wie z. B. Embryonen im Frühstadium9. Um die Abhängigkeit von der Autofluoreszenz zu überwinden, werden die Proben mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie Eosin für die HREM-Bildgebung gefärbt. Die Wahl der Farbstoffe und Färbemethoden macht HREM auch kompatibler für die Detektion molekularer Signale im Kontext der Gewebearchitektur und -morphologie4,10.
In diesem Artikel stellen wir ein verbessertes HREM-Protokoll vor, das für die Ganzkörperbeurteilung von Mausembryonen im späten Stadium geeignet ist. Um die Färbung zu erleichtern, fügen wir einen Vorbehandlungsschritt hinzu, um die Gewebepenetration zu erhöhen und so die HREM-Bildgebung älterer Mausembryonen zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 Proof, Absolut, ACS / USP / Koscher Qualität</td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>Clearing-Lösung</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td>Clearing-Lösung</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Reinigungslösung</td></tr><tr><td>Eosin Y Dinatriumsalz</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>BP241925</td><td>Infiltrationslösung</td></tr><tr><td>Acridin Orange Hemi (Zinkchlorid) Salz</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>Infiltrationslösung</td></tr><tr><td>Whatman Papier</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Einbettungskit - Lösung A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>Infiltrationslösung</td></tr><tr><td>JB-4 Einbettungskit - Lösung B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>Einbettlösung</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Einbettungs-Kit - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>Infiltrationslösung</td></tr><tr><td>zum Einbetten von Formen</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>16 x 8 mm</td></tr><tr><td>Peel-A-Way scharfe Einbettungsformen</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>22 mm x 22 mm quadratisch, gekürzt auf 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Kunststoff-Blockhalter</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Graduiert-Transferrohre</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Petrlschale</td><td>VWR</td><td>25384-088</td> Pinzette <td>zum Sezieren von Embryonen</td></tr><tr><td>Inox-Spitze</td><td> ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Gewebezange</td> für die Embryodissektion<td>; ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>Embryodissektion</td></tr><tr><td>Empfindliche Operationsschere</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>Embryodissektion</td></tr><tr><td>14 ml Polypropylen-Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Polypropylen-Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Magic Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml (3,4 Unzen) Antistatische Polystyrol-Waage</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11,2 oz.) Antistatische Polystyrol-Wägeschiffchen</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>MP Biomedicals</td><td>102892</td><td>PBS-Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>PBS-Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>PBS-Lösung</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>PBS-Lösung</td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Stereo-Zoom-Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Faseroptische Lichtquelle</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Mikrotomklinge</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Dispenser</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D Software</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell T7600, 2x900GB SAS Festplatte und 64 GB DDR3 RDIMM Speicher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rocking Platform Shaker</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>Standard Heizplattenrührer</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle erfassung von 3d-bildern mit hoher auflösung episcopic mikroskopie

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

Die hochauflösende episkopische mikroskopische (HREM) Technologie ermöglicht die schnelle Erfassung von hochauflösenden digitalen volumetrischen und dreidimensionalen (3D) morphometrischen Daten. Hier beschreiben wir das detaillierte Protokoll zur Abbildung des gesamten Mausembryos. Das Protokoll besteht aus vier Hauptabschnitten: Probenvorbereitung, Einbettung, Bildaufnahme und schließlich 3D-Visualisierung. Die Technologie erfordert, dass die Proben mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt werden, was bei großen oder dichten Proben problematisch sein kann. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir das bestehende Protokoll verbessert, um die Gewebepenetration des Farbstoffs zu verbessern, indem wir die Probe mit einer Lösung vorbehandelt haben, die Harnstoff und Natriumdodecylsulfat enthält. Das Protokoll verwendet nur routinemäßige Laborgeräte und Reagenzien für eine einfache Anpassung in Standardlaborumgebungen. Wir zeigen, dass die resultierenden hochauflösenden 3D-Bilder die detaillierten morphologischen Merkmale der inneren Organe von Mausembryonen originalgetreu rekapitulieren und so morphometrische Analysen ermöglichen. Gemeinsam präsentieren wir ein detailliertes und verbessertes Protokoll mit Standard-Laborgeräten, um hochauflösende 3D-Bilder von kleinen und großen Proben zu erfassen.

Wir haben hohe Qualität HREM Bilder von Mäuseembryonen berichtet zwischen E9.5 und E13.5 8. Bildqualität der spät statt Embryonen jedoch signifikant wegen der begrenzten Gewebepenetration des fluoreszierenden Farbstoffes Eosin kompromittiert. Um die Färbung die Effizienz zu steigern, haben wir mehrere Vorbehandlungsmethoden getestet, die auf Fluoreszenz - kompatibel sind Bildgebung 11. Insbesondere wurden die E15.5 Maus - Embryonen entweder mit A2 12 Sca ...

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll mit hochauflösender episkopischer Mikroskopie, um dreidimensionale (3D) Bilder von Mausembryonen zu erfassen. Dieses verbesserte Protokoll verwendet eine modifizierte Gewebepräparationsmethode, um die Penetration des Fluoreszenzfarbstoffs zu verbessern und so die morphometrische Analyse sowohl kleiner als auch großer Proben zu ermöglichen.

Schnelle Erfassung von 3D-Bildern mit hoher Auflösung Episcopic Mikroskopie

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, mithilfe standardmäßiger Laborausrüstung schnell hochauflösende 3D-Digitalbilder biologischer Proben zu gewinnen. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie beantworten, indem sie komplexe morphologische Merkmale visualisiert und deren Dynamik untersucht. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie auf Standardlaborgeräten basiert und nur minimale Vorkenntnisse erfordert.Den Ablauf wird Jungang Huang, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Nach der Dissektion und Fixierung des Embryos gemäß dem schriftlichen Protokoll ersetzen Sie die Fixierlösung durch eine Klärungslösung und schwenken das Präparat sanft bei Raumtemperatur für ein bis zwei Wochen auf einem Schüttler. Am Ende der Inkubation überführen Sie das Präparat in 10 % Formalin und lassen es weitere zwei Tage auf dem Schüttler. Am dritten Tag das Probenmaterial dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS waschen. Anschließend die Proben bei Raumtemperatur in einer aufsteigenden Ethanolreihe jeweils zwei Stunden lang unter leichtem Schütteln entwässern. Nach der Entwässerung mit 100 % Ethanol die Probe eine Stunde lang in Färbelösung überführen, dabei vor Licht schützen.Danach die Lösung durch frische Färbungslösung ersetzen, um die Probe über Nacht zu markieren. Am nächsten Morgen die Probe in ein Volumen- zu Volumenverhältnis von 1:1 aus frisch zubereiteter Infiltrations- und Färbungslösung für mindestens drei Stunden auf einem Schüttler bei vier Grad Celsius einlegen. Am Ende der Inkubation das Embryo in Infiltrationslösung überführen und weitere drei Stunden unter Schütteln inkubieren.Ersetzen Sie anschließend den Überstand durch frische Infiltrationslösung und lassen Sie die Probe weitere drei Tage bei vier Grad Celsius schütteln. Am vierten Tag richten Sie das Embryo in einer Einbettform aus und stellen die Form auf Eis. Mischen Sie Lösung B mit der Infiltrationslösung und tauchen Sie die Form dann vorsichtig in kalte Einbettlösung bei vier Grad Celsius ein.Nach etwa drei Stunden verwenden Sie eine Spitze, um zu überprüfen, ob die Lösung erstarrt ist, und drücken Sie die Probe aus der Form. Schneiden Sie überschüssiges Einbettungsmaterial ab, und bringen Sie den Probenblock in einer neuen Form in querer Ausrichtung neu an. Stellen Sie anschließend die gesamte Anordnung auf Eis in einer Abzugshaube.Das Einbettungslösung vorsichtig der neuen Form hinzufügen, bis die Form untergetaucht ist. Anschließend einen Blockhalter auf die Form setzen. Nach drei bis vier Stunden die Einbettform entfernen und den Block unter ein Stereomikroskop mit schräger Beleuchtung legen, um die Position der Probe innerhalb des Blocks zu bestimmen.Markieren Sie auf der Blockoberfläche Gitterlinien um die Probe herum und verwenden Sie diese Linien als Führung zum Abschneiden überschüssigen Einbettungsmaterials. Um die Probe abzubilden, klemmen Sie zunächst den Block in ein Mikrotom und stellen einen frischen Schnitt der Probe her. Danach montieren Sie ein Stereozoommikroskop horizontal, sodass es auf die Blockoberfläche der Probe gerichtet ist, und schalten Sie das Mikroskop sowie den dazugehörigen Computer ein.Als Nächstes starten Sie die Software zur Bildaufnahme und verwenden Sie den Live-Ansicht-Modus der Bildgebungssoftware, um die Optik auf die Blockoberfläche zu fokussieren. Richten Sie das Mikroskop und das Mikrotom nach Bedarf aus, sodass die Blockoberfläche im Zentrum des Suchers liegt. Einer der kritischsten Schritte dieses Verfahrens besteht darin, Bilder in der festen Ausgangsposition des Mikrotoms aufzunehmen.Stellen Sie den Zoombereich so ein, dass die gesamte Blockoberfläche im Sucher sichtbar ist. Wählen Sie dann den Filter für das grün fluoreszierende Protein aus. Fahren Sie fort, indem Sie den Block vorschneiden, bis das Gewebeprobe sichtbar wird, und stellen Sie die Bildschärfe bei Bedarf erneut ein.Nachdem die Belichtungszeit manuell gemessen und eingestellt wurde, erwerben und speichern Sie Bilder der Blockoberfläche nach jedem neuen Schnitt und notieren Sie die wichtigen Parameter der Bildaufnahme. Am Ende der Aufnahmesitzung exportieren Sie alle Bilddateien und konvertieren Sie in das JPEG-Format. Verwenden Sie eine geeignete Bildverarbeitungssoftware, um alle Originalbilder zu invertieren, und passen Sie Helligkeit und Kontrast der Bilder nach Bedarf an. Laden Sie alle bearbeiteten Bilder gemäß der Anleitung in eine 3D-Visualisierungssoftware hoch.Richten Sie alle Bilder im automatischen Modus aus und zeigen Sie die 3D- und 2D-Ergebnisse an. Bei diesem repräsentativen Bild handelt es sich um eine Ganzpräparat-Auflichtaufnahme eines embryonalen Mäuseembryos vom Tag 15,5, das wie gerade demonstriert präpariert und abgebildet wurde. Detaillierte morphologische Merkmale der Haut, einschließlich der Schnurrhaarpolster und der sich entwickelnden Haarfollikel, können beobachtet werden.Wichtig ist, dass die Auflösung der virtuellen Schnittansicht einer mit dieser Methode abgebildeten Embryonalprobe vom Tag 15,5 der Entwicklung ähnlich gut ist wie die eines standardmäßigen histologischen Schnitts. Sobald man das gesamte Verfahren beherrscht, kann es nach der Vorbehandlung mit der Klärungslösung innerhalb einer Woche abgeschlossen werden, sofern es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während des Verfahrens ist darauf zu achten, die Färbelösung während der Infiltrations- und Einbettungsphase vor Licht geschützt bei vier Grad zu lagern.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Schuppenfärbung angewendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der spezifischen Verteilungsmuster von Zelltypen zu beantworten. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Laborgeräte verwendet, um hochauflösende 3D-Bilder biologischer Proben für deren morphometrische Analyse zu gewinnen. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Fixierungs-, Färbungs- und Infiltrationslösungen äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einem Abzug und das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Zerstörungsfreie Volumen-Visualisierung können nur von tomographischen Techniken, von denen die am effizientesten ist die x-ray micro-Computertomographie (CT) erreicht werden.

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Raumzeitliche Informationen über dynamische Proteine in lebenden Zellen sind entscheidend für das Verständnis der Biologie. Eine Art von hochauflösender Mikroskopie, die als schnelle 3D-strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (f3D-SIM) bezeichnet wird, enthüllt einzigartige Informationen über den zytokinetischen Z-Ring in Bakterien: sowohl sein kügelchenartiges Aussehen als auch die schnelle Dynamik von FtsZ innerhalb des Rings.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Wir präsentieren ein Protokoll für die Anwendung von interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm), einer 3-dimensionalen Einzelmoleküllokalisierung Super Resolution Mikroskopie-Methode, um die Abbildung des Aktin-Zytoskelett in adhärenten Säugerzellen. Dieser Ansatz ermöglicht es Licht-basierte Visualisierung von Nanostrukturmerkmale, die sonst mit herkömmlichen beugungsbegrenzten optischen Mikroskopie ungelöst bleiben würde.

Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

Wir bieten einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung von Biopsiematerialien verschiedener Arten, Embryonen biomedizinischer Modellorganismen und Proben von anderen organischen Geweben, um eine digitale Volumendatenerzeugung mit der hochauflösenden episkopischen Mikroskopie zu ermöglichen.

Hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) - Einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung und Visualisierung von organischen Materialien

Vor kurzem abgebildet wir die dreidimensionale (3D) räumlichen Positionen der Transportwege für verschiedene Proteine in primäre Zilien in lebenden Zellen translocating. Hier leben diese Papier-Details, die in der Versuchsanordnung, den Prozess der biologischen Proben und der Datenanalyse für die 3D Höchstauflösung Fluoreszenz imaging Ansatz neu angewendet primäre Zilien.

Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie

In diesem Protokoll wird erläutert, wie bakterielle Proben für die dreidimensionale Bildgebung vorbereitet und montiert werden und wie die dreidimensionale Form von E. coli aus diesen Bildern rekonstruiert wird.

Dreidimensionale Bildgebung von Bakterienzellen für genaue zelluläre Darstellungen und präzise Proteinlokalisierung

Hier beschreiben wir Berechnungswerkzeuge und -methoden, die die Visualisierung und Analyse von drei- und vierdimensionalen Bilddaten von Mausembryonen im Rahmen der axialen Dehnung und Segmentierung ermöglichen, die durch optische In-toto-Projektionstomographie und durch Live-Bildgebung und Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung mittels Multiphotonenmikroskopie erhalten werden.

Drei- und vierdimensionale Visualisierungs- und Analyseansätze zur Untersuchung der axialen Dehnung und Segmentierung von Wirbeltieren

In Kombination mit einer Kopfplatte und einem optischen Design, das sowohl mit Einzel- als auch mit Zwei-Photonen-Mikroskopen kompatibel ist, bietet die Mikroprismenlinse einen erheblichen Vorteil bei der Messung neuronaler Reaktionen in einer vertikalen Säule unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich gut kontrollierter Experimente in kopffesten Zuständen oder natürlicher Verhaltensaufgaben bei frei beweglichen Tieren.

Langzeitbildgebung identifizierter neuronaler Populationen mit Mikroprismen bei frei beweglichen und kopffixierten Tieren

Dieses Protokoll beschreibt die fortschrittlichen Bildgebungsanwendungen und das gemeinsame Ressourcenmanagement eines laserabtastenden konfokalen Mikroskopsystems, das mit einem multiplexierten Array-Detektor für hochauflösende zelluläre und subzelluläre Bildgebung integriert ist. Der Workflow ermöglicht multimodale Bildgebung von Konfokal bis Superauflösung (~120 nm) innerhalb einer einzigen Plattform und macht die Visualisierung im Nanomaßstab zugänglicher.

Superauflösende Bildgebung und gemeinsames Management: Ein Protokoll für konfokale Mikroskopie mit Multiplex-Detektion

Lernen Sie die episkopische Mikroskopie zur schnellen Erfassung hochauflösender 3D-Bilder von Maus-Embryonen. Diese Methode ermöglicht detaillierte morphometrische Analysen embryonaler Strukturen mit Standard-Laborausrüstung.

Schnelle Erfassung von 3D-Bildern mit hoher Auflösung Episcopic Mikroskopie

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