Wässrige Tröpfchen als enzymatische Mikroreaktoren und deren elektromagnetischen Betätigung
28. August 2017
Labor-in-a-Drop Reaktionssysteme erlauben die vielseitige Implementierung von komplexen Reaktionen in mikrofluidischen Maßstab. Eine automatisierte Betätigung-Plattform, bestehend aus einem 3 x 3-Matrix von elektromagnetischen Spulen wurde entwickelt und erfolgreich eingesetzt, um verschmelzen zwei 10 µL Mikroreaktoren und dadurch eine enzymatische Reaktion in die resultierenden flüssige Murmeln zu initiieren.
Der übergeordnete Zweck dieses Geräts besteht darin, eine neue mikrofluidische Plattformtechnologie bereitzustellen, die automatisierte Kaskadenreaktionen in kleinen wässrigen Tröpfchen realisiert. Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der synthetischen Biologie zu beantworten, indem sie Reaktionssequenzen von Mikroorganismen reproduziert, komplexe Reaktionssequenzen mit Enzymen durchführt und neue Katalysatoren screent. Der Hauptvorteil unseres Lab-in-a-Drop-Ansatzes besteht darin, dass er sehr anpassungsfähig ist.
Im Gegensatz zu kanalbasierten Mikrofluidik-Chips ist die einzige Voraussetzung eine hydrophile Reaktionsumgebung. Obwohl diese Methode Einblicke in enzymatische Reaktionen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. anorganische Katalysatoren oder das Stringing von Liganden. Die Idee zu dieser Methode hatte ich zum ersten Mal, als ich versuchte, ein mikrofluidisches Gerät mit integrierter Produkttrennung, aber ohne ein komplexes System von Ventilen und Separatoren zu entwerfen.
Indem die Reaktionslösung als Tröpfchen bewegt wird, wird die Reaktionskontrolle sehr einfach. Entwerfen Sie zunächst die Spulenkörper im 3D-Druck. Wickeln Sie dann mit einer Wickelmaschine die Körper jeweils 45 Mal mit einem 08-Millimeter-Kupferdraht um.
Platzieren Sie ein Peltier-Element auf einer elektrischen Platine. Schrauben Sie die erste Schicht Spulen auf das Peltier-Element, um ein Quadrat zu bilden. Befestigen Sie dann die zweite Schicht der Spulen mit dem 3D-gedruckten Kunststoffrahmen oder einem anderen nicht leitenden Material.
Verbinden Sie die Schaltplatine mit einem Flachbandkabel mit der Magnetsteuerung. Setzen Sie Neodym-Magnete in die Spulen ein. Legen Sie eine einen Millimeter dicke Quarzglas- oder Kunststoffplatte auf die Spulenmatrix.
Befestigen Sie die Abdeckung mit Schrauben, um die Montage der Betätigungsplattform abzuschließen. Um die Nanopartikelsynthese unter einer inerten Atmosphäre zu beginnen, suspendieren Sie zunächst 85 Gramm Eisen(III)chlorid-Hexahydrat und 3 Gramm Eisen(II)chlorid-Tetrahydrat in 200 Millilitern einer vier zu eins Wasser-Ethanol-Lösung. Fügen Sie dann 0,2 Milliliter PFOTES hinzu und rühren Sie die Mischung bei 500 U/min mit einem Magnetrührstab um.
Fügen Sie der Mischung 1,5 molare Ammoniumhydroxid hinzu, um einen pH-Wert von 8,0 zu erreichen. Rühren Sie die Lösung dann 24 Stunden lang weiter, um die hydrophoben magnetischen Nanopartikel zu erhalten. Befestigen Sie einen Stabmagneten mit einer Haftkraft von 25 Kilogramm am Boden des Reaktionskolbens.
Gießen Sie die Lösung ab und waschen Sie die Partikel dreimal mit einer Wasser-Ethanol-Lösung im Verhältnis vier zu eins. Entfernen Sie den Magneten und trocknen Sie die Partikel 24 Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Charakterisieren Sie die Partikel mit Rasterelektronenmikroskopie.
Bereiten Sie eine Lösung aus 0,1 Mikrogramm pro Milliliter Meerrettichperoxidase in 0,1 molaren Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,5 und 10 Millimolar Wasserstoffperoxid vor. Bereiten Sie dann eine 20-mikromolare Lösung der Fluoreszenzsonde 10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazin in Kaliumphosphatpuffer vor. Mahlen Sie dann die trockenen Nanopartikel vorsichtig mit einem Glasmörser und Stößel.
Übertragen Sie die Partikel in eine Styropor-Waagschale und fügen Sie 10 Mikroliter der Peroxidaselösung hinzu. Schwenken Sie die Pfanne etwa 10 Sekunden lang vorsichtig, um eine Selbstorganisation der Nanopartikel um die Peroxidaselösung zu erreichen. Übertragen Sie diesen Mikroreaktor auf die Betätigungsplattform.
Wiederholen Sie diesen Vorgang mit 10 Mikrolitern der Fluoreszenzsondenlösung und stellen Sie den zweiten Mikroreaktor auf die Plattform. Lagern Sie die restlichen Partikel bei Raumtemperatur. Verwenden Sie das Peltier-Element, um die Reaktionslösungen in den Mikroreaktoren bei 25 Grad Celsius zu halten.
Montieren Sie ein Fluoreszenzmikroskop etwa 10 Millimeter über den Mikroreaktoren und schließen Sie das Mikroskop an einen Computer an. Aktivieren Sie mit dem Magnetregler die Magnete und drehen Sie ihn, um den Mikroreaktor mit der Fluoreszenzsondenlösung unter dem Mikroskop zu positionieren. Schalten Sie das Erregerlicht ein.
Heben Sie den Spulenmagneten an, um den Mikroreaktor zu öffnen und mit der Aufnahme des Fluoreszenzmikroskopiebildes zu beginnen. Senken Sie den Magneten nach zwei bis fünf Sekunden ab, um den Mikroreaktor zu schließen. Verwenden Sie dann die Magnetsteuerung, um den Peroxidase-Mikroreaktor neben den Fluoreszenz-Mikroreaktor zu bewegen.
Öffnen Sie den Mikroreaktor der Fluoreszenzsonde. Der Peroxidase-Mikroreaktor wird in den Sondenmikroreaktor eingezogen und geöffnet, wodurch die Reaktion eingeleitet wird. Überwachen Sie die Reaktion durch Fluoreszenzmikroskopie, um den zusammengeführten Mikroreaktor nach Bedarf zu öffnen und zu schließen.
Mikroreaktoren wurden hergestellt, indem Lösungströpfchen mit hydrophoben Eisennanopartikeln codiert wurden. Diese Mikroreaktoren können durch Manipulation von Neodym-Magneten unter einer Betätigungsplattform bewegt, geöffnet, geschlossen und zusammengeführt werden. Die Betätigungsplattform kann auch mit Eisenkernen in den Spulenkörpern konstruiert werden.
Dies bietet genügend magnetische Kraft, um einen Mikroreaktor um mehr als 10 Millimeter zu bewegen, reicht aber nicht aus, um den Mikroreaktor zu öffnen. Daher muss ein Neodym-Magnet verwendet werden, um Reaktionen in kleinen Lösungsvolumina durchzuführen. Es wurde eine repräsentative enzymatische Reaktion zwischen einer Peroxidase und einer Fluoreszenzmarkierung durchgeführt und fluoreszenzmikroskopisch überwacht.
Die von Michaelis erwähnte Kinetik, die während der Reaktion beobachtet wurde, stimmte gut mit den Werten in der Literatur überein, was darauf hindeutet, dass der Aufbau des Mikroreaktors den Reaktionsfortschritt nicht beeinflusst. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hydrophobe Mikropartikel synthetisiert und mit ihnen wässrige Mikrotröpfchen erzeugt. Die Plattformtechnologie kann zur automatisierten Reaktionssteuerung durch Tröpfchenverschmelzung genutzt werden.
Darüber hinaus können einzelne Mikroreaktoren, die mit Substrat gefüllt sind, mit mobilisierten Enzymen auf kleine Oberflächenzonen bewegt werden. Die Verwendung mehrerer Immobilisierungszonen mit unterschiedlichen Enzymen ermöglicht eine sequentielle Reaktionskaskade mit transportablen und unmittelbaren Produkten. Diese Prototypenentwicklung ist erst der Anfang.
Derzeit implementieren wir ein automatisiertes Dispensersystem oberhalb der Reaktionsplattform, um immobilisierte Enzyme an jeder beliebigen Position abzulagern. Die Spulenmatrix wird auf 10 mal 10 Positionen erhöht. Diese Technik kann den Weg für die computergesteuerte Planung und Durchführung biochemischer Reaktionssequenzen ebnen.
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Überblick
Diese Studie präsentiert eine neuartige mikrofluidische Plattformtechnologie, die für automatisierte Kaskadenreaktionen in kleinen wässrigen Tröpfchen konzipiert ist. Der Lab-in-a-drop Ansatz ermöglicht eine vielseitige Implementierung komplexer Reaktionen und liefert Einblicke in enzymatische Prozesse und andere Systeme.
Wichtige Bestandteile der Studie
Wissenschaftsbereich
- Mikrofluidik
- Synthetische Biologie
- Enzymatische Reaktionen
Hintergrund
- Mikrofluidische Systeme verwenden traditionell kanalbasierte Designs.
- Lab-in-a-drop Systeme bieten eine anpassungsfähigere Reaktionsumgebung.
- Automatisierte Plattformen können die Reaktionseffizienz und Komplexität verbessern.
- Erkenntnisse aus dieser Forschung könnten Anwendungen in der synthetischen Biologie vorantreiben.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer mikrofluidischen Plattform für automatisierte Kaskadenreaktionen.
- Reproduktion komplexer Reaktionssequenzen ähnlich denen in Mikroorganismen.
- Screening neuer Katalysatoren und Verbesserung des Verständnisses enzymatischer Reaktionen.
Verwendete Methoden
- Entwicklung einer automatisierten Antriebsplattform mit elektromagnetischen Spulen.
- Zusammenführung von Mikroreaktoren zur Initiierung enzymatischer Reaktionen.
- Nutzung hydrophiler Umgebungen zur Erleichterung der Reaktion.
- Anpassung der Methode für verschiedene katalytische Systeme.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Zusammenführung von Mikroreaktoren zur Bildung von flüssigen Perlen.
- Nachgewiesene Anpassungsfähigkeit des Lab-in-a-drop Ansatzes.
- Potenzielle Anwendungen jenseits von enzymatischen Reaktionen, einschließlich anorganischer Katalysatoren.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten zukünftige Forschungen in der synthetischen Biologie beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Die Lab-in-a-drop Methode bietet eine flexible Plattform für komplexe Reaktionen.
- Diese Technologie könnte synthetische Biologie und Katalysatorscreening erheblich beeinflussen.
- Weitere Erforschung dieser Methode könnte zu innovativen Anwendungen in verschiedenen Bereichen führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Automated microreactor platforms using aqueous droplets enable programmable, multiplexed enzymatic and catalytic reactions at microscale volumes. This technology addresses the need for flexible, channel-free microfluidic systems that support rapid hypothesis testing and high-throughput screening in early discovery. Its adaptability and automation potential position it as a reusable capability for synthetic biology, catalyst evaluation, and mechanistic de-risking across the R&D pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of enzymatic pathways and substrate specificity in a controlled, miniaturized environment.
- Supports biological de-risking by allowing rapid, parallel testing of reaction sequences and catalyst candidates.
- Facilitates predictive confidence in target selection through quantitative, real-time monitoring of reaction kinetics.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microreactor systems for downstream compound or catalyst screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible assay conditions by automating droplet manipulation and merging.
- Enables scalable, multiplexed screening with minimal reagent consumption and high data density.
- Supports reliable evaluation of enzyme activity and substrate conversion via fluorescence readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant enzymatic pathways for translational biomarker exploration when appropriate substrates are used.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting sequential reaction cascades and product tracking.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by enabling precise control over reaction initiation and monitoring.
Pipeline & Workflow Integration
This microreactor platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical mechanistic studies, supporting hypothesis-driven research and rapid iteration.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling programmable reaction sequences in droplets.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible microreactors for high-throughput evaluation of enzymes, substrates, or catalysts.
- Analytics: Delivers quantitative fluorescence measurements and kinetic data for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports alignment with disease-relevant enzymatic processes when integrated with appropriate biological substrates.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, scalable platform adaptable to diverse reaction types and screening needs across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by enabling controlled, multiplexed reaction analysis.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability through automated droplet actuation and merging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing reagent use and enabling rapid data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates through robust mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, magnetic actuation, and fluorescence analytics.
- Needs access to 3D printing, coil winding, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of droplet preparation and actuation protocols.
- Adaptable to various model systems, but optimization may be needed for different enzyme or substrate classes.
- Practical limitations include the need for hydrophobic surfaces and precise magnetic control for reliable droplet manipulation.
