Herstellung von extrazellulären Matrix Proteinfasern für Brillouin-Spektroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Probe von Proteinfasern der extrazellulären Matrix, Kollagen oder Elastin vorzubereiten, die für Brillouin-Spektroskopie-Messungen in den Probenraum eingebaut werden sollen. Mit dieser Methode können Kollagen- und Elastinfasern der extrazellulären Matrix aus Bindegewebe tierischen Ursprungs für deren Verwendung in Brillouin-Spektroskopie-Messungen gewonnen werden. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die mikromechanischen Eigenschaften der Probe ohne vorherige Kenntnis des Brechungsindex des Materials vollständig bestimmt werden können.

Während der Schwanz noch gefroren ist, schneidet man ein 20 Millimeter langes Segment vom proximalen Ende ab und taut das Gewebe in einer mit Raumtemperatur gefüllten Petrischale PBS auf. Wenn der Schwanz aufgetaut ist, verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt entlang der Länge der Probe zu machen, um die Haut zu spalten, und schälen Sie das Gewebe zurück, um vier Scheidensehnenbündel um die Schwanzwirbel freizulegen. Ziehen Sie mit einer feinen Pinzette jede Faser vorsichtig aus der Hülle und legen Sie sie in ein Fläschchen mit destilliertem Wasser, das mit 0,01 % Gewichtsprozent Natriumazid für die Lagerung bei vier Grad Celsius ergänzt ist.

Um reines faseriges Kollagen vom Typ 1 zu erhalten, tauchen Sie die Fasern 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in Chondroitinase ABC, in Tris-Puffer und Natriumacetat in einen Schüttelinkubator. Am nächsten Tag überführen Sie die Fasern in Streptomyces-Hyaluronidase in Tris-Puffer und Natriumchlorid für weitere 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in den Schüttelinkubator. Tauchen Sie dann die Fasern in Trypsin, in Natriumphosphat und Natriumchlorid für 16 Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.

Die gereinigten Fasern können dann bei vier Grad Celsius in Fläschchen mit destilliertem Wasser gelagert werden, das mit 0,01 % Natriumazid angereichert ist, bis sie benötigt werden. Um das Nackenband des Rinders zu gewinnen, entfetten die Elastinfasern zunächst das frisch gewonnene Nackenband des Rinders. Wenn das gesamte Fett entfernt wurde, geben Sie das Band in einen Erlenmeyerkolben und bedecken Sie das Gewebe mit frisch zubereitetem Natriumhydroxid in destilliertem Wasser.

Kochen Sie das Band 45 Minuten lang in einem 95 Grad Celsius warmen Wasserbad. Waschen Sie dann den unlöslichen Block wiederholt in einem mit destilliertem Wasser gefüllten Becherglas. Wenn ein pH-Wert von 7,0 erreicht wird, tauchen Sie das Gewebe in destilliertes Wasser, das mit 0,01 % Natriumazid versetzt ist, und verschließen Sie den Behälter für die Lagerung bei vier Grad Celsius, bis er benötigt wird.

Ziehen Sie nach der Lagerung mit einer Pinzette vorsichtig etwa zwei Millimeter dicke, 20 bis 50 Millimeter lange kleinere Elastinsegmente aus dem größeren Block. Legen Sie die Segmente in eine Petrischale, die PBS enthält, und ziehen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig etwa einen Millimeter dicke Faserbündel aus den Segmenten. Schneiden Sie dann die Bündel mit einem Skalpell in einige Millimeter lange Fragmente und geben Sie die Faserstücke in Fläschchen mit destilliertem Wasser, das mit 0,01 % Natriumazid versetzt ist, zur Lagerung bei vier Grad Celsius, bis es benötigt wird.

Um die Faser auf einem reflektierenden Substrat zu montieren, verwenden Sie zunächst einen Diamantschneider, um ein Stück reflektierenden Silikondia zu schneiden. Schneiden Sie dann einen Streifen Para-Folie mit einer Vertiefung in der Mitte, die groß genug ist, um ein Stück Faser aufzunehmen, und platzieren Sie die Para-Folie auf dem Silikonsubstrat. Verwenden Sie nun eine feine Pinzette, um eine einzelne Faser aus der vier Grad Celsius warmen Lagerlösung in eine kleine Petrischale zu überführen, die mit reinem Wasser bei Raumtemperatur gefüllt ist.

Nach 5 Minuten übertragen Sie die gespülte Faser in die Mitte der Para-Film-Mulde auf dem Silikonsubstrat. Legen Sie dann einen dünnen Glasabdeckschirm über die Faser und legen Sie einen erhitzten Lötkolben vorsichtig über das Glas, um die Para-Folie unter dem Glas zu schmelzen. Um eine Drehung der Probe in der Ebene zu ermöglichen und gleichzeitig einen konstanten Streuwinkel und eine konstante Volumenposition beizubehalten, montieren Sie die Probe auf einen vertikalen Halter, der mit einem Goniometer ausgestattet ist, und positionieren Sie sie in einem Winkel von 45 Grad zum einfallenden Laserstrahl.

In trockenen Kollagenfasern bei einem spezifischen Drehwinkel von null Grad führen die Längsmoden zu einem Volumenpeak bei 18,92 Gigahertz, während die Parallelmoden zu den Oberflächenmoden einen Peak bei 9,85 Gigahertz ergeben. Der parallel zur Oberfläche verlaufende Peak verschiebt sich bei einem spezifischen Drehwinkel von fast 90 Grad in niedrigere Frequenzen, während sich der Bulk-Peak bei Änderung des spezifischen Drehwinkels im gleichen Bereich nur leicht rot verschiebt. In nassen Kollagenfasern blieben die beiden Peaks während des gesamten Experiments im Wesentlichen unverändert, wobei der Bulk-Peak bei 10,5 Gigahertz und der parallel zur Oberfläche verlaufende Peak bei 4,9 Gigahertz lag, was auf eine Verringerung der Häufigkeit um 80 bis 100 % hinweist und die verringerte Steifigkeit des hydratisierten Materials berücksichtigt.

In dieser Abbildung ist ein Diagramm der Schallwellengeschwindigkeit von trockenem Kollagen dargestellt, das von parallelen zu Oberflächen- und Transversalpeaks in Abhängigkeit vom spezifischen Drehwinkel erhalten wurde. In trockenen Elastinfasern, die bei einem spezifischen Drehwinkel von null Grad gemessen werden, tritt der Volumenpeak bei 16,8 Gigahertz und der Parallel-zu-Oberflächen-Modus bei 8,2 Gigahertz auf. Die nassen Elastinfasern weisen jedoch einen Bulk-Peak mit einer um 37 % geringeren Häufigkeit auf als der Bulk-Peak des trockenen Elastins, was auf eine Verringerung der Steifigkeit der Faser hinweist.

Wie bei trockenem Kollagen gibt es Hinweise auf eine Anisotropie in den mechanischen Eigenschaften von trockenen Elastinfasern, was die Wirksamkeit der Brillouin-Spektroskopie bei der Gewinnung relevanter Daten über die Steifigkeit, Zusammensetzung und strukturellen Aspekte bestimmter Materialien von Interesse zeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Kollagen- und Elastinfaserproben für mikromechanische Tests auf der Grundlage der Brillouin-Lichtstreuspektroskopie vorbereitet werden.