Vorbereitung und

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Synthese einer aktivitätsbasierten Sonde, ARN 14 six eight six, spezifisch für N-Acylethanolamin-Säureamidase oder NAAA, zu zeigen und deren Anwendung zur Detektion des katalytisch aktiven Enzyms in Zelllysaten und Gewebeschnitten zu beschreiben. Diese Methode kann helfen, Fragen zur in-vivo-Funktion von NAAA zu beantworten und Einblicke in die Aktivierung von NAAA unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen wie entzündlichen und neurodegenerativen Erkrankungen zu gewinnen. Ihr Hauptvorteil liegt darin, dass eine einfache Manipulation auf die Reaktion von NAAA mit der Sonde folgt, wodurch zuverlässige Informationen über den in-vivo-Aktivierungszustand des Enzyms erhalten werden.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass unsere Sonde im Gegensatz zu spezifischen Antikörpern nur die aktive Form des Enzyms nachweist, was für den fluoreszenzmikroskopischen Status nützlich ist. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da sie verschiedene Fachkenntnisse kombiniert und eine vollständige Geschichte von der korrekten Synthese bis hin zur endgültigen Anwendung ergeben. In einem 50-Milliliter-Rundkolben lösen Sie 350 Milligramm Undecynenol und 3,5 Milliliter trockenes Dichlormethan auf.

Anschließend 25 Milligramm DMAP und 530 Milligramm DPC zu dieser Lösung hinzufügen. Das Gemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur rühren. Nach 16 Stunden 20 Milliliter Dichlormethan zur Lösung geben.

Überführen Sie das Gemisch in ein Trennfunnel. Geben Sie 15 Milliliter Wasser hinzu. Schütteln Sie das Gemisch und lassen Sie die beiden Phasen separieren.

Öffnen Sie als Nächstes den Hahn, sammeln Sie die organische Phase von unten auf, schließen Sie den Hahn und überführen Sie die organische Phase zurück in den Trenntrichter. Geben Sie 15 Milliliter einer gesättigten Natriumbicarbonat-Lösung zu der Mischung hinzu. Schütteln Sie den Trenntrichter und lassen Sie die beiden Phasen voneinander trennen.

Nachdem Sie die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet haben, filtrieren Sie sie durch Watte in einen zweihalsigen Rundkolben. Anschließend verdampfen Sie die organische Phase unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer bis zur Trockne. Wiegen Sie den Kolben ab und erhalten 600 Milligramm Öl, das eine Mischung aus zwei Pyridylundecynylcarbonat und Undecynol zwei Oxypyridincarboxylat im Verhältnis 1,7 zu 1 darstellt.

In einem 10-Milliliter-Rundkolben lösen Sie 60 Milligramm Oxocarbyldienolammoniumacetat in zwei Milliliter trockenem Dichlormethan auf. Kühlen Sie die Lösung in einem Eisbad auf null Grad Celsius ab und geben Sie dann tropfenweise 81 Mikroliter Diazapropaläthylamin zu. Lösen Sie anschließend 350 Milligramm des Rohgemischs, das Undecynol-2-oxypyridincarboxylat enthält, in zwei Milliliter trockenem Dichlormethan auf.

Geben Sie die gelöste Mischung zur Lösung hinzu und rühren Sie 15 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend verdampfen Sie das Lösungsmittel unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer bis zur Trockne. Reinigen Sie die Verbindung mittels Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung einer automatisierten Säulenchromatographie-Apparatur.

Zunächst wird die Probe auf Kieselgel aufgenommen. Nach der Equilibrierung der Säule mit Cyclohexen wird die Probe in die Kartusche gegeben. Die Probe wird mit Ethylacetat in Cyclohexan von null bis 100 eluiert, wobei die Peaks in Reagenzgläser gesammelt werden.

Verdampfen Sie unter vermindertem Druck mithilfe eines Rotationsverdampfers das Lösungsmittel der Fraktionen, die der Verbindung entsprechen, bis zur Trockne, um 40 Milligramm eines weißen Feststoffs zu erhalten. Nachdem die Probe wie im textbasierten Protokoll beschrieben vorgeklärt wurde, geben Sie 11,3 Mikroliter einer 5-Millimolar-Stammlösung von Azid-Polyethylenglykol-Biotin hinzu und wirbeln Sie die Probe. Anschließend geben Sie 11,3 Mikroliter einer 50-Millimolar-Stammlösung frisch zubereiteten TCEP zur Probe hinzu und wirbeln erneut.

Nachdem 34 µL einer frisch hergestellten Arbeitslösung von 1,7 mM TBTA mit 11,3 µL einer 50 mM Kupfersulfat-Stammlösung vorgemischt wurden, 45,3 mL dieser Lösung zur Probe gegeben und vortexiert werden. Verwenden Sie beschriftete Gefäße. Inkubieren Sie die Reaktion bei 25 °C für mindestens zwei Stunden.

Nach einerstündiger Inkubation die Proteinfällung beobachten und die Reaktion mischen. Die Probe vier Minuten bei 6.500 × g und 4 °C zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstands 750 µL kaltes Methanol hinzufügen und das Pellet durch Ultraschallbehandlung mit einem Tauchsonde für fünf Sekunden resuspendieren.

Anschließend die Probe vier Minuten bei 6.500 × g und 4 °C zentrifugieren. Den Überstand mit einer Spritze und Nadel entfernen. Nach zwei weiteren Waschungen mit kaltem Methanol 325 µL 2,5 %iger SDS in PBS zum Proteinpellet hinzufügen.

Sonicieren Sie die Probe dreimal für jeweils fünf Sekunden. Erhitzen Sie anschließend die Probe fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Probe nach der Beschallung fünf Minuten lang bei 6.500 × g bei Raumtemperatur.

Überführen Sie dann den Überstand in ein sauberes 15-Milliliter-Gefäß und geben Sie 1,4 Milliliter PBS zum Überstand hinzu, um die SDS-Konzentration auf 0,5 % zu verdünnen. Für die Strepavidin-Anreicherung bringen Sie zunächst das Probenvolumen mit PBS auf 4,2 Milliliter. Fügen Sie anschließend 40 µL einer 50 %igen Suspension vorgewaschener Streptavidin-Agarose unter Verwendung einer Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende hinzu.

Die Mischung zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Rotation inkubieren. Nach einer Zentrifugation für zwei Minuten bei 1.400 × g das Überstandsvolumen entfernen, ohne das Pellet der Beads zu trocknen. Den restlichen Überstand verwenden, um die Beads auf eine 1-Milliliter-Spinsäule zu übertragen, und die Säule durch Schwerkraft mit einem Milliliter 1 %iger SDS-Lösung in PBS waschen.

Setzen Sie die Waschung der Kügelchen mit sechs Molar Harnstoff gefolgt von PBS wie im Textprotokoll beschrieben fort. Verwenden Sie anschließend 500 Mikroliter PBS, um die gewaschenen Kügelchen in eine 1,5-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Nachdem die Probe zwei Minuten bei 1.400 × g zentrifugiert wurde, aspirieren Sie vorsichtig den Überstand mit einer Spritze und Nadel.

Um die an die Harzkügelchen gebundenen Proteine zu eluieren, 25 Mikroliter Elutionspuffer zum Harzpellet hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur sowie anschließend 15 Minuten bei 95 Grad Celsius inkubieren. Ungefähr 400 Mikroliter Click-Chemie-Mix zu den gemäß dem Textprotokoll vorbereiteten Gewebeschnitten hinzufügen. Darauf achten, dass das gewählte Volumen an Click-Chemie-Mix ausreicht, um die Schnitte vollständig zu bedecken.

Anschließend die Gewebeschnitte eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation die Proben fünf Minuten mit PBS und danach fünf Minuten mit kaltem Methanol waschen. Danach die Gewebeschnitte dreimal mit einer Lösung aus einem Prozent Tween 20 und null Komma fünf Millimolar EDTA in PBS je zwei Minuten waschen.

Spülen Sie die Schnitte abschließend ein letztes Mal fünf Minuten lang mit PBS. Nach dem Lufttrocknen geben Sie einen Tropfen Antifade-Montagemittel mit DAPI hinzu. Verschließen Sie die Proben mit Deckgläsern und versiegeln Sie sie mit Lack.

Für die Probensynthese wird Undecynenol durch Dipyridercarbonat in Gegenwart von katalytischen Mengen Dimethylaminopyridin aktiviert, um ein gemischtes Carbonat zu erzeugen, das anschließend mit dem Aminylactam umgesetzt wird. Das Beta-Lactam oder der Kopf der Sonde reagiert mit der NAAA-Wirkstelle, während das terminale Alkin über Click-Chemie mit einem Reportermolekül funktionalisiert werden kann. ARN 14 686 wurde verwendet, um die NAAA-Aktivierung in Proteinauszügen aus entzündeten Rattenpfoten mittels Proteinblock nachzuweisen. Bei naiven Ratten wird kein NAAA-Signal detektiert.

Umgekehrt wird bei Ratten, die mit komplettem Freund-Adjuvans behandelt wurden, ein ausgeprägtes Band beobachtet, das der aktiven NAAA entspricht. Eine weitere Anwendung von ARN 14 six eight six ist die Gewebeabbildung mittels Fluoreszenzmikroskopie. Hier stellen rote Zellen alveoläre Makrophagen dar, die positiv für aktive NAAA sind.

NAAA lokalisiert sich in diffusen vesikulären Strukturen, was bei höherer Vergrößerung erkennbar ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ARN 14 six eight six synthetisiert und verwendet, um aktives NAAA in Geweben sowohl mittels Proteinblot als auch Fluoreszenzmikroskopie nachzuweisen. Darüber hinaus ließen sich die in diesem Protokoll beschriebenen Anwendungen der Sonde, obwohl sie spezifisch für unser Zielmolekül ist, leicht an verschiedene aktivitätsbasierte Sonden anpassen, die für andere Zielstrukturen als NAAA spezifisch sind.