Name: Vorbereitung und In Vivo Die Verwendung eines aktivitätsbasierte Sonde für N -acylethanolamine Säure Amidase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Lernen Sie die Synthese und Anwendung der aktivitätsbasierten Sonde ARN14686 zur Detektion von NAAA in Zellextrakten und Gewebeschnitten. Diese Methode liefert zuverlässige Erkenntnisse über den Aktivierungszustand des proinflammatorischen Enzyms.

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Die Autoren danken dem Nikon Imaging Center am Istituto Italiano di Tecnologia, Genua, Italien (NIC@IIT).

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Enzymaktivität wird auf verschiedenen Ebenen fein reguliert, einschließlich RNA-Transkription, Proteinsynthese, Protein Translokation, post-translationale Modifikation und Protein-Protein-Wechselwirkung. Oft allein Enzym-Expression nicht für seine Tätigkeit ausmachen. ABPP wurde die Aktivität von Proteinen in ihrem nativen Zustand zu studieren entwickelt. Zwei Merkmale sind erforderlich: eine chemische Sonde, die kovalent bindet an die aktive Stelle eines Enzyms von Interesse und einem Reporter-Tag die Sonde-markier...

Üblicherweise Methoden verwendet , um die Expressionsmuster, Interaktionen und Funktionen von Proteinen zu untersuchen, einschließlich Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie Plattformen für shotgun Analyse 1,2, Hefe - Zwei-Hybrid - Verfahren 3,4 und in vitro - Assays sind in begrenzt , dass sie nicht in der Lage, die Aktivität der Proteine ​​in ihrem nativen Zustand zu beurteilen. Die aktivitätsbasierte Proteinprofilierung (ABPP) können verwendet werden, um diese Lücke zu füllen. In diesem Ansatz werden die Sonden mit kleinem Molekül, das an die aktive Stelle eines Enzyms von Interesse konjugiert an eine Reportergruppe kovalent Bindung, die für die Zielerfassung ermöglicht. Mit Klick - Chemie (CC), kann der Reporter in die Sonde integriert oder eingeführt werden , nachdem Ziel Engagement 5,6 aufgetreten ist. Das letztere Verfahren erfordert die Verwendung von Sonden geeigneten chemischen Gruppen, wie beispielsweise einem terminalen Alkin oder Azid, die mit einer Anzahl von Reporterreagenzien über bioorthogonalen Reaktionen modifiziert werden kann such als Cu (I) -katalysierte Huisgen [3 + 2] -Cycloaddition 7-9 oder Staudinger - Ligation 10,11. Vor kurzem offenbarten wir die Verbindung ARN14686 als erste ABP für die in - vitro- und in - vivo - Nachweis der Cystein - Hydrolase, NAAA 12. NAAA katalysiert die hydrolytische Deaktivierung von gesättigten und einfach ungesättigten FAEs, einschließlich oleoylethanolamide (OEA) und Palmitoylethanolamid (PEA), die 13-15 endogene Agonisten des anti-inflammatory nukleären Rezeptor PPAR-alpha sind. NAAA wird überwiegend in Makrophagen und anderen Monozyten abgeleiteten Zellen exprimiert werden , als auch in B-Lymphozyten 14,16, eine Rolle in der Regulation der angeborenen Immunantwort hinweist. Das Enzym wird im rauhen endoplasmatischen Retikulum in einer inaktiven Form synthetisiert und in sauren Kompartimenten der Zelle durch eine autoproteolytische Mechanismus 17 aktiviert. Die autoproteolytische Spaltung erzeugt ein neues N -terminale Cystein (C131 in Mäusen und Ratten, C126 beim Menschen), das heißt das Nukleophil für FAE 18,19 Hydrolyse. Pharmakologische Hemmung der NAAA Aktivität verändert die FAE - Synthese / Abbau Gleichgewicht zugunsten der erhöhten zellulären Ebenen der FAE 16,20,21. Mehrere β-lacton und β-Lactam - Derivate wurden 16,22-26 NAAA Aktivität mit hoher Wirksamkeit und Selektivität gezeigt , zu hemmen. Diese Inhibitoren wirken durch S - Acylierung des katalytischen Cystein 16,27,28. (- [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat 4-cyclohexylbutyl- N) 16 Die Verbindung ARN14686 wurde basierend auf der chemischen Struktur des systemisch aktiven, Serin abgeleiteten β-Lactam NAAA Inhibitor, ARN726 gestaltet. Das 4-Butyl-cyclohexyl Gruppe von ARN726 wurde mit einem C9 gesättigte aliphatische Kette ersetzt ein terminales Alkin-Tag für die nachfolgende CC Konjugation mit einem Azid-Lager Reporter-Tag trägt. Wir entschieden uns für einen zweistufigen ABP-Design, um minimally die Struktur des ursprünglichen Gerüsts verändert, wodurch die Affinität der Sonde für NAAA aufrechterhalten wird. Darüber hinaus die Einführung von sperrigen Tags zu vermeiden, eine solche Sonde könnte besser geeignet sein für in vivo - Behandlung als eine direkte ABP. ARN14686 hemmt NAAA mit hoher Potenz (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) durch eine kovalente Addukt mit dem katalytischen Cystein des Enzyms 12 bilden. Experimente mit lebenden Ratten zeigten, dass die Sonde bei der Erfassung von NAAA selektiv ist in Lunge ausgedrückt. Acid Ceramidase, eine andere Cystein - Amidase , die 33-34% Identität mit NAAA teilt, wurde auch als niedriger Affinität Ziel identifiziert , wenn eine hohe Sondenkonzentrationen (10 &amp; mgr; M in vitro, 10 mg / ml intravenös, iv) unter Verwendung von 12. Wir haben auch ARN14686 zur Untersuchung der Anwesenheit von aktiven NAAA in entzündeten Rattengeweben nach der Verabreichung von komplettem Freund&#39;schen Adjuvans (CFA) 29 verwendet. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die preparatiauf der ARN14686 (Abbildung 1) und ihre Anwendung auf die Untersuchung von NAAA Aktivierung ex vivo. Als Beispiel beschreiben wir ein experimentelles Verfahren NAAA visualisieren in Rattenpfoten nach CFA Verabreichung. In diesem Experiment werden die Proteine ​​aus paw Gewebe nach intravenöser Injektion der Sonde extrahiert und die ABP-markiertem Proteom unterzogen mit Biotin-Azid zu CC. Biotinylierte Proben werden unter Verwendung von Streptavidin-Kügelchen angereichert, und Protein-Blots durchgeführt werden. In einer anderen Anwendung beschreiben wir die Lokalisation der aktiven NAAA durch Fluoreszenzmikroskopie in Mauslungen von der Sonde behandelten Mäusen. In diesem Fall wird das Gewebe geschnitten und Abschnitte sind CC für Rhodamin-Addition unterzogen. Ein Workflow - Schema ist in Abbildung 2 dargestellt.

<table><tbody><tr><td>1,1'-Sulfonyldiimidazol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>gesundheitsschädliches</td></tr><tr><td>2-Dipyridylcarbonat</td><td>Fluorchem</td><td>11331</td><td>gesundheitsschädliches</td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Brennbar, giftig, wassergefährdend</td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)pyridin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td>Giftige</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>entzündlich, ätzend</td></tr><tr><td>Acetonitril&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>Entflammbare, giftige</td></tr><tr><td>Aktivkohle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>Schädliches</td></tr><tr><td>Azid-PEG3-Biotin</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azid-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Spin-Säulen</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Blocking-Puffer</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>Hochgiftiges</td></tr><tr><td>Bovin-Serumalbumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>Gesundheitsgefahr</td></tr><tr><td>Cersäureammoniumnitrat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>Oxidierendes, schädliches</td></tr><tr><td>Chloralhydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td>Hochgiftiges</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Giftiges Cyclohexadien</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>Entzündlich, Gesundheitsgefahr</td></tr><tr><td>Cyclohexan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34855</td><td>Entzündlich, gesundheitsschädlich, Gesundheitsgefahr, Umweltgefahr</td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>Gesundheitsschädlich, gesundheitsschädlich</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>Entzündlich, Schädliches</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>Entzündliches, gesundheitsschädliches</td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>Entzündlich, Schädliches</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Streptavidin</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Streptavidin&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td> Vor <td>Gebrauch kurz zentrifugieren, um Proteinkomplexe auszufällen</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>Hochgiftiges</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Entzündlich, giftig, gesundheitsgefährdend</td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N & -ethylcarbodiimidhydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>gesundheitsschädlich</td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>entzündlich, ätzend, giftig</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>entzündlich, gesundheitsschädlich</td></tr><tr><td>N-Cbz-L-Serin</td><td>Fluorchem</td><td>M03053</td><td>Schädlich</td></tr><tr><td>Nikon A1 Konfokalmikroskopie</td><td>Nikon</td><td></td><td>Lesen Sie die Bedienungsanleitung</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Palladium auf Kohlenstoff</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-anisidin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>Giftig, Gesundheitsgefahr, Umweltgefahr</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>Giftig, für die Atemwege schädlich, ätzend, falmierbares</td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifading-Eindeckmittel mit DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>Vermeidung von Blasenbildung</td></tr><tr><td>Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Giftiges, ätzendes, falmmbares</td></tr><tr><td>Natriumhydrid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td>Entflammbares</td></tr><tr><td>Natriumsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 immage scanner</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>Lesen Sie die Bedienungsanleitung</td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tert-Butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>Giftiges, brennbares</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>Entzündlich, gesundheitsschädlich, gesundheitsschädlich</td></tr><tr><td>Thioharnstoff</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>Giftig, warm bei 50 & Grad; C zum Auflösen</td></tr><tr><td>von Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>x100</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 basischer Gewebehomogenisator</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td></td></tr><tr><td>Schädlicher Harnstoff</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Giftig, warm bei 50 &de; C zum Auflösen</td></tr></tbody></table>

vorbereitung und<em&gt; in vivo</em&gt; die verwendung eines aktivitätsbasierte sonde für<em&gt; n</em&gt; -acylethanolamine säure amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Aktivitätsbasierte Protein Profilierung (ABPP) ist ein Verfahren zur Identifizierung eines Enzyms von Interesse in einer komplexen Proteom durch die Verwendung einer chemischen Sonde, die das Enzym der aktiven Stellen richtet. Ein Reporter-Tag in die Sonde eingeführt ermöglicht die Detektion des markierten Enzyms durch in-Gel-Fluoreszenz-Scanning, Protein-Blot, Fluoreszenz-Mikroskopie, oder Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie. Hier beschreiben wir die Herstellung und die Verwendung der Verbindung ARN14686, eine Click - Chemie aktivitätsbasierte Sonde (CC-ABP), die das Enzym N -acylethanolamine Säure Amidase selektiv erkennt (NAAA). NAAA ist ein Cystein-Hydrolase, die Entzündung durch Deaktivierung endogenen Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptor (PPAR) -alpha-Agonisten wie Palmitoylethanolamide (PEA) und oleoylethanolamide (OEA) fördert. NAAA wird als inaktives Proenzym in voller Länge synthetisiert, die durch Autoproteolyse in dem sauren pH des Lysosom aktiviert wird. Lokalisationsstudien have gezeigt, dass NAAA überwiegend in Makrophagen und anderen Monozyten abgeleiteten Zellen exprimiert wird, als auch in B-Lymphozyten. Wir stellen Beispiele dafür , wie ARN14686 verwendet werden können , zu erkennen und zu aktiven NAAA ex vivo in Nagetiergeweben durch Protein - Blot und Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert.

ARN14686 wurde basierend auf dem Gerüst des NAAA Inhibitors ARN726 gestaltet. Das 4-butyl-cyclohexyl Gruppe von ARN726 wurde mit einem C9 gesättigte aliphatische Kette Lager ein terminales Alkin - Tag (1) substituiert. Das Alkin-Tag wurde eingeführt, um die Verwendung eines zweistufigen Markierungsverfahren zu ermöglichen, ein Fluorophor oder ein Biotin-Molekül über CC hinzuzufügen. Diese Funktion macht ARN14686 ein sehr vielseitiges Werkzeug NAAA in vitro zu un...

Hier beschreiben wir die Herstellung und Verwendung eines aktivitätsbasierten Sonde (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat) , die zum Nachweis und zur Quantifizierung des ermöglicht aktive Form des proinflammatorischen Enzym N -acylethanolamine Säure Amidase (NAAA), sowohl in vitro und ex vivo.

Vorbereitung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Verwendung eines aktivitätsbasierte Sonde für<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Säure Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Synthese einer aktivitätsbasierten Sonde, ARN 14 six eight six, spezifisch für N-Acylethanolamin-Säureamidase oder NAAA, zu zeigen und deren Anwendung zur Detektion des katalytisch aktiven Enzyms in Zelllysaten und Gewebeschnitten zu beschreiben. Diese Methode kann helfen, Fragen zur in-vivo-Funktion von NAAA zu beantworten und Einblicke in die Aktivierung von NAAA unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen wie entzündlichen und neurodegenerativen Erkrankungen zu gewinnen. Ihr Hauptvorteil liegt darin, dass eine einfache Manipulation auf die Reaktion von NAAA mit der Sonde folgt, wodurch zuverlässige Informationen über den in-vivo-Aktivierungszustand des Enzyms erhalten werden.Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass unsere Sonde im Gegensatz zu spezifischen Antikörpern nur die aktive Form des Enzyms nachweist, was für den fluoreszenzmikroskopischen Status nützlich ist. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da sie verschiedene Fachkenntnisse kombiniert und eine vollständige Geschichte von der korrekten Synthese bis hin zur endgültigen Anwendung ergeben. In einem 50-Milliliter-Rundkolben lösen Sie 350 Milligramm Undecynenol und 3,5 Milliliter trockenes Dichlormethan auf.Anschließend 25 Milligramm DMAP und 530 Milligramm DPC zu dieser Lösung hinzufügen. Das Gemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur rühren. Nach 16 Stunden 20 Milliliter Dichlormethan zur Lösung geben.Überführen Sie das Gemisch in ein Trennfunnel. Geben Sie 15 Milliliter Wasser hinzu. Schütteln Sie das Gemisch und lassen Sie die beiden Phasen separieren.Öffnen Sie als Nächstes den Hahn, sammeln Sie die organische Phase von unten auf, schließen Sie den Hahn und überführen Sie die organische Phase zurück in den Trenntrichter. Geben Sie 15 Milliliter einer gesättigten Natriumbicarbonat-Lösung zu der Mischung hinzu. Schütteln Sie den Trenntrichter und lassen Sie die beiden Phasen voneinander trennen.Nachdem Sie die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet haben, filtrieren Sie sie durch Watte in einen zweihalsigen Rundkolben. Anschließend verdampfen Sie die organische Phase unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer bis zur Trockne. Wiegen Sie den Kolben ab und erhalten 600 Milligramm Öl, das eine Mischung aus zwei Pyridylundecynylcarbonat und Undecynol zwei Oxypyridincarboxylat im Verhältnis 1,7 zu 1 darstellt.In einem 10-Milliliter-Rundkolben lösen Sie 60 Milligramm Oxocarbyldienolammoniumacetat in zwei Milliliter trockenem Dichlormethan auf. Kühlen Sie die Lösung in einem Eisbad auf null Grad Celsius ab und geben Sie dann tropfenweise 81 Mikroliter Diazapropaläthylamin zu. Lösen Sie anschließend 350 Milligramm des Rohgemischs, das Undecynol-2-oxypyridincarboxylat enthält, in zwei Milliliter trockenem Dichlormethan auf.Geben Sie die gelöste Mischung zur Lösung hinzu und rühren Sie 15 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend verdampfen Sie das Lösungsmittel unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer bis zur Trockne. Reinigen Sie die Verbindung mittels Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung einer automatisierten Säulenchromatographie-Apparatur.Zunächst wird die Probe auf Kieselgel aufgenommen. Nach der Equilibrierung der Säule mit Cyclohexen wird die Probe in die Kartusche gegeben. Die Probe wird mit Ethylacetat in Cyclohexan von null bis 100 eluiert, wobei die Peaks in Reagenzgläser gesammelt werden.Verdampfen Sie unter vermindertem Druck mithilfe eines Rotationsverdampfers das Lösungsmittel der Fraktionen, die der Verbindung entsprechen, bis zur Trockne, um 40 Milligramm eines weißen Feststoffs zu erhalten. Nachdem die Probe wie im textbasierten Protokoll beschrieben vorgeklärt wurde, geben Sie 11,3 Mikroliter einer 5-Millimolar-Stammlösung von Azid-Polyethylenglykol-Biotin hinzu und wirbeln Sie die Probe. Anschließend geben Sie 11,3 Mikroliter einer 50-Millimolar-Stammlösung frisch zubereiteten TCEP zur Probe hinzu und wirbeln erneut.Nachdem 34 µL einer frisch hergestellten Arbeitslösung von 1,7 mM TBTA mit 11,3 µL einer 50 mM Kupfersulfat-Stammlösung vorgemischt wurden, 45,3 mL dieser Lösung zur Probe gegeben und vortexiert werden. Verwenden Sie beschriftete Gefäße. Inkubieren Sie die Reaktion bei 25 °C für mindestens zwei Stunden.Nach einerstündiger Inkubation die Proteinfällung beobachten und die Reaktion mischen. Die Probe vier Minuten bei 6.500 × g und 4 °C zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstands 750 µL kaltes Methanol hinzufügen und das Pellet durch Ultraschallbehandlung mit einem Tauchsonde für fünf Sekunden resuspendieren.Anschließend die Probe vier Minuten bei 6.500 × g und 4 °C zentrifugieren. Den Überstand mit einer Spritze und Nadel entfernen. Nach zwei weiteren Waschungen mit kaltem Methanol 325 µL 2,5 %iger SDS in PBS zum Proteinpellet hinzufügen.Sonicieren Sie die Probe dreimal für jeweils fünf Sekunden. Erhitzen Sie anschließend die Probe fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Probe nach der Beschallung fünf Minuten lang bei 6.500 × g bei Raumtemperatur.Überführen Sie dann den Überstand in ein sauberes 15-Milliliter-Gefäß und geben Sie 1,4 Milliliter PBS zum Überstand hinzu, um die SDS-Konzentration auf 0,5 % zu verdünnen. Für die Strepavidin-Anreicherung bringen Sie zunächst das Probenvolumen mit PBS auf 4,2 Milliliter. Fügen Sie anschließend 40 µL einer 50 %igen Suspension vorgewaschener Streptavidin-Agarose unter Verwendung einer Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende hinzu.Die Mischung zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Rotation inkubieren. Nach einer Zentrifugation für zwei Minuten bei 1.400 × g das Überstandsvolumen entfernen, ohne das Pellet der Beads zu trocknen. Den restlichen Überstand verwenden, um die Beads auf eine 1-Milliliter-Spinsäule zu übertragen, und die Säule durch Schwerkraft mit einem Milliliter 1 %iger SDS-Lösung in PBS waschen.Setzen Sie die Waschung der Kügelchen mit sechs Molar Harnstoff gefolgt von PBS wie im Textprotokoll beschrieben fort. Verwenden Sie anschließend 500 Mikroliter PBS, um die gewaschenen Kügelchen in eine 1,5-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Nachdem die Probe zwei Minuten bei 1.400 × g zentrifugiert wurde, aspirieren Sie vorsichtig den Überstand mit einer Spritze und Nadel.Um die an die Harzkügelchen gebundenen Proteine zu eluieren, 25 Mikroliter Elutionspuffer zum Harzpellet hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur sowie anschließend 15 Minuten bei 95 Grad Celsius inkubieren. Ungefähr 400 Mikroliter Click-Chemie-Mix zu den gemäß dem Textprotokoll vorbereiteten Gewebeschnitten hinzufügen. Darauf achten, dass das gewählte Volumen an Click-Chemie-Mix ausreicht, um die Schnitte vollständig zu bedecken.Anschließend die Gewebeschnitte eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation die Proben fünf Minuten mit PBS und danach fünf Minuten mit kaltem Methanol waschen. Danach die Gewebeschnitte dreimal mit einer Lösung aus einem Prozent Tween 20 und null Komma fünf Millimolar EDTA in PBS je zwei Minuten waschen.Spülen Sie die Schnitte abschließend ein letztes Mal fünf Minuten lang mit PBS. Nach dem Lufttrocknen geben Sie einen Tropfen Antifade-Montagemittel mit DAPI hinzu. Verschließen Sie die Proben mit Deckgläsern und versiegeln Sie sie mit Lack.Für die Probensynthese wird Undecynenol durch Dipyridercarbonat in Gegenwart von katalytischen Mengen Dimethylaminopyridin aktiviert, um ein gemischtes Carbonat zu erzeugen, das anschließend mit dem Aminylactam umgesetzt wird. Das Beta-Lactam oder der Kopf der Sonde reagiert mit der NAAA-Wirkstelle, während das terminale Alkin über Click-Chemie mit einem Reportermolekül funktionalisiert werden kann. ARN 14 686 wurde verwendet, um die NAAA-Aktivierung in Proteinauszügen aus entzündeten Rattenpfoten mittels Proteinblock nachzuweisen. Bei naiven Ratten wird kein NAAA-Signal detektiert.Umgekehrt wird bei Ratten, die mit komplettem Freund-Adjuvans behandelt wurden, ein ausgeprägtes Band beobachtet, das der aktiven NAAA entspricht. Eine weitere Anwendung von ARN 14 six eight six ist die Gewebeabbildung mittels Fluoreszenzmikroskopie. Hier stellen rote Zellen alveoläre Makrophagen dar, die positiv für aktive NAAA sind.NAAA lokalisiert sich in diffusen vesikulären Strukturen, was bei höherer Vergrößerung erkennbar ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ARN 14 six eight six synthetisiert und verwendet, um aktives NAAA in Geweben sowohl mittels Proteinblot als auch Fluoreszenzmikroskopie nachzuweisen. Darüber hinaus ließen sich die in diesem Protokoll beschriebenen Anwendungen der Sonde, obwohl sie spezifisch für unser Zielmolekül ist, leicht an verschiedene aktivitätsbasierte Sonden anpassen, die für andere Zielstrukturen als NAAA spezifisch sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ein Protokoll, um Trichothecene (Mykotoxine, die für die menschliche Gesundheit) mit einem neu entwickelten Screening-Methode auf einem wettbewerbsfähigen immunchemischen Verfahren und eine endgültige elektrochemischer Detektion basierte Erkennung demonstriert.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrochemische) Verfahren zur Mykotoxin-Erkennung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines synthetischen tRNA Substrat für...

In-vitro-tRNA Methylierungs-Assay mit der Entamoeba histolytica DNA und tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Eine Methode zur Bestimmung von Acetat-Kinase-Aktivität beschrieben. Dieser Assay nutzt eine direkte Reaktion zur Bestimmung der Enzymaktivität und die Kinetik der Acetat-Kinase in die Acetat-bildenden Richtung mit unterschiedlichen Phosphoryl Akzeptoren. Darüber hinaus kann diese Methode für die Untersuchung auf andere Acetyl-Phosphat-oder Acetyl-CoA-Enzyme verwendet genutzt werden.

Direkter Nachweis der Acetat-bildenden Aktivität des Enzyms Acetat-Kinase

Dieses Video zeigt die In-vitro-Messung der Enzymaktivität für α-Galactosidase A und saure α-Glucosidase in Proben, die synthetische 4-Methylumbelliferyl-Substrate verwenden.

In-vitro-Messung der Aktivität von α-Galactosidase A und sauren α-Glucosidase-Enzymen

Die reversible Zugabe von Palmitat an Proteine ​​ist ein wichtiger Regulator des intrazellulären Protein-Trafficking. Dies ist von besonderem Interesse, wo viele Neuronen synaptische Proteine ​​palmitoyliert. Wir nutzen einen einfachen biochemischen Verfahren zur palmitoylierten Proteinen in kultivierten Neuronen, die für mehrere Zelltypen und Gewebe angepasst werden kann zu detektieren.

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

Der vorliegende Bericht beschreibt einen enzymatischen In-vitro-Assay zur Messung der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Leishmania-Zellextrakten. Dieser Assay basiert auf der Übertragung einer radioaktiven Methylgruppe von S-[Methyl-3-H]adenosyl-L-methionin auf endogenes Phosphatidylethanolamin.

In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen

Diese Arbeit stellt eine Methode des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung eines universellen genetischen Enzym-Screening-Systems vor, das theoretisch auf über 200 Enzyme angewendet werden kann. Dabei identifiziert das Single-Screening-System drei verschiedene Enzyme (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) durch einfaches Wechseln des verwendeten Substrats (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

Es ist eine Forderung, prä-klinischen Tests für eine neuartige Klasse von "Orphan" Medikamenten, den sogenannten pharmakologischer Chaperonen reproduzierbar, schnell und effizient zu machen. Wir entwickelten einen einfache, hoch standardisiert und vielseitige Zelle kulturbasierte Assay zum Bildschirm für geeignete Patienten sowie neuartige pharmakologische Chaperon Medikamente.

In-vitro- Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) wird angewendet, um dendritische Stacheln im murinen Hippocampus abbilden und analysieren zu können.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte der Immunelektronenmikroskopie vor der Einbettung, wobei der Schwerpunkt auf der Erforschung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung in der Netzhaut liegt.

Untersuchung von retinalen Schaltkreisen und molekularer Lokalisierung durch Voreinbettung der Immunelektronenmikroskopie

Lernen Sie die Synthese und Anwendung der aktivitätsbasierten Sonde ARN14686 zur Detektion von NAAA in Zellextrakten und Gewebeschnitten. Diese Methode liefert zuverlässige Erkenntnisse über den Aktivierungszustand des proinflammatorischen Enzyms.

Vorbereitung und

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