Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA)-Mikrosphären zu verwenden, um Verbindungen in kultivierte, intakte Pankreasinseln abzugeben, um die Wirkung einzelner Substanzen auf die Proliferation adulter pankreatischer Beta-Zellen zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Substanzen zu testen, die lokal und kontrolliert an intakte Inseln abgegeben werden. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie leicht an alternative Biomaterialien für die Abgabe, interessierende Verbindungen und Endpunktanalysen angepasst werden kann.

Diese Methode bietet außerdem das Potenzial, Wirkstoffe in Kombination mit der etablierten In-vivo-Übertragung von Inseln abzugeben. Die Herstellung der PLGA-Mikrosphären wird Taylor Kavanaugh, der Doktorand in meinem Labor, demonstrieren. Geben Sie zunächst einen Milligramm der fluoreszenzmarkierten Verbindung von Interesse hinzu, um die erste wässrige Phase zu bilden, zu 100 Mikrolitern entionisiertem Wasser.

Lösen Sie anschließend 65 Milligramm PLGA in 750 Mikrolitern Dichlormethan in einem Szintillationsfläschchen und behandeln Sie die Mischung 10 bis 30 Sekunden lang mit Ultraschall bei 160 Watt, um das PLGA vollständig aufzulösen. Dadurch entsteht die Ölphase. Geben Sie die gesamte erste Wasserphase tropfenweise zur Ölphase hinzu.

Verwenden Sie dann einen Handhomogenisator, um die Lösung bei 20.000 U/min 30 Sekunden lang zu emulgieren, wodurch die erste Wasser-Öl-Phase entsteht. Fügen Sie anschließend die gesamte erste Wasser-Öl-Phase tropfenweise zu 15 Milliliter 1 %iger PVA-Lösung hinzu und emulgieren Sie wie zuvor gezeigt. Überführen Sie danach das gesamte Volumen der Emulsion in einen 200-Milliliter-Rundkolben und verwenden Sie einen Rotationsverdampfer, um das Lösungsmittel unter einem Vakuum von 635 Millimeter Quecksilbersäule eine Stunde lang zu entfernen, wodurch die wässrige Phase entsteht.

Geben Sie je ein Milliliter der wässrigen Phase in 14 Mikrozentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die Mikrosphären durch Zentrifugation. Entfernen Sie am Ende der Zentrifugation mit einer Mikropipette 900 Mikroliter der wässrigen Lösung aus jedem Röhrchen, wobei darauf geachtet werden muss, die Pellets nicht aufzurühren. Waschen Sie die Mikrosphären mit je einem Milliliter entionisiertem Wasser, gefolgt von der vorsichtigen Entfernung von 900 Mikrolitern des Überstandes.

Anschließend 900 Mikroliter deionisiertes Wasser zu den verbleibenden 100 Mikrolitern der Überstände hinzufügen. Dann kurz verwirbeln und sonifizieren, um die Pellets erneut in Suspension zu bringen. Nach der Isolierung der Inseln aus den betreffenden Versuchstieren 40 optisch größengleiche Inseln in ein Loch einer 96-Loch-Gewebekulturplatte in 200 Mikrolitern Inselkulturmedium aussäen.

Am nächsten Morgen ein Aliquot Mikrosphären in Prä-Assay-Medium resuspendieren, sodass die Endkonzentration der interessierenden Verbindung im Reaktionsgefäß 10 Nanogramm pro Mikroliter beträgt, und die Mikrosphären 10 Minuten lang bei 160 Watt in einem Eiswasserbad mit 10 Sekunden langen Impulsen bei vier Grad Celsius beschallen. Danach vorsichtig 100 Mikroliter Islet-Kulturmedium aus jedem Well entnehmen, ohne die Inseln zu lösen, und die Kulturen mit 100 Mikrolitern des Mikrosphären enthaltenden Assay-Mediums inkubieren. Nach drei Tagen das Assay-Medium vorsichtig aus allen Wells entfernen, ohne die Inseln zu stören, und die Inseln zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern PBS vorsichtig waschen.

Inseln haften nur locker an einer 96-Loch-Platte. Daher ist es entscheidend, dass Medium und PBS vorsichtig aus jedem Loch entfernt werden, damit die Inseln nicht versehentlich gelöst und verworfen werden. Nach der zweiten Wäsche die Inseln vorsichtig für drei Minuten bei Raumtemperatur in 100 Mikroliter Trypsin-EDTA-Lösung eintauchen, wobei nach zwei Minuten sanft pipettiert wird.

Überführen Sie das gesamte Volumen jedes Wells in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 400 Mikroliter Islet-Kulturmedium zu jedem Röhrchen hinzu, um die Dissoziation zu stoppen. Nachdem die mikrosphärenbehandelten Inseln durch Zentrifugation gesammelt wurden, entfernen Sie vorsichtig die Überstände mit einer Mikropipette und resuspendieren die Pellets in 200 Mikrolitern frischem Islet-Kulturmedium. Anschließend zentrifugieren Sie die dissoziierten Inseln mit einem Cytospin auf geladenen Objektträgern.

Nach dem Lufttrocknen zeichnen Sie mit einem hydrophoben Markierstift einen Rahmen um die Inseln und fixieren die Zellen mit 75 µL vierprozentigem Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 10 Minuten, gefolgt von zwei Waschungen mit jeweils 75 µL PBS. Nach der zweiten Waschung permeabilisieren Sie die Zellen mit 75 µL 0,2 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten, gefolgt von einer abschließenden Waschung mit 75 µL PBS allein. Um die Inseln immunologisch zu markieren, legen Sie die Objektträger mit der Zellseite nach oben in eine feuchte Kammer und entfernen Sie das PBS.

Als Nächstes blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 75 µL normalem Eselserum bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde ersetzen Sie das Serum durch 75 µL des gewünschten primären Antikörpers und inkubieren erneut eine Stunde bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation saugen Sie die primäre Antikörperlösung vorsichtig ab und waschen die Proben mit 375 µL PBS-Puffer.

Anschließend inkubieren Sie die Inseln für eine Stunde bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, mit 75 Mikrolitern des geeigneten immunfluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers. Am Ende der Inkubation ersetzen Sie die Lösung des sekundären Antikörpers durch 75 Mikroliter Dappy für drei Minuten, gefolgt von einer fünfminütigen Spülung mit entionisiertem Wasser. Nach Beendigung der Wäsche geben Sie einen 100-Mikroliter-Tropfen einer schnell trocknenden Einbettlösung, die ein Anti-Fade-Reagenz enthält, auf einen Glasdeckel und legen einen Objektträger mit der Probenoberfläche nach unten auf die Einbettlösung.

Der größte Anteil der Mikrosphären liegt im Durchmesser zwischen 1 und 10 Mikrometern, obwohl einige Mikrosphären größer sein können. Nach der Verteilung der intakten, mit PLGA-Mikrosphären behandelten Inseln und deren anschließender Immunmarkierung ist es üblich, Bereiche der Probe zu beobachten, die frei von jeglicher Markierung zwischen den Zellen sind, verursacht durch intakte Mikrosphären, die während der Waschschritte nicht vollständig entfernt wurden. Nach der Bildaufnahme kann der Prozentsatz an Ki67-insulinpositiven Zellen mithilfe einer Software zur Bildanalyse oder manuell durch Zählen der Gesamtanzahl markierter Zellen quantifiziert werden.

Die Behandlung intakter Inseln mit rekombinanten humanen PLGA-Mikrosphären des Wachstumsfaktors für Bindegewebe über einen Zeitraum von drei Tagen führt, wie gerade gezeigt, zu einer erhöhten Proliferation der Beta-Zellen, was belegt, dass das Protein während der Herstellung der Mikrosphären keine Funktionalität verliert. Sobald die Technik beherrscht ist, können bei sachgemäßer Durchführung Ergebnisse innerhalb von weniger als einer Woche erzielt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass der Einfluss auf die Proliferation der Beta-Zellen in Ihrem Experiment je nach interessierender Substanz und den genauen Freisetzungs­kinetiken der hergestellten Mikrosphären variieren wird.

Nach dieser Methode können andere Verfahren, wie beispielsweise die Cotransplantation von Wirkstoff-beladenen Mikrosphären zusammen mit intakten Pankreasinseln, durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu untersuchen, etwa ob der interessierende Wirkstoff die Proliferation von Beta-Zellen in vivo induzieren kann. PLGA hat eine etablierte Anwendungsgeschichte in medizinischen Geräten und Arzneimittelabgabesystemen, die von der FDA zugelassen wurden, und stellt somit eine geeignete Wahl für Forschende und Kliniker dar, die therapeutische Wirkstoffe über einen längeren Zeitraum hinweg gezielt an bestimmte Gewebe abgeben möchten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Wirkstoff-beladene PLGA-Mikrosphären herstellt und sie kultivierten, intakten Inseln verabreicht.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung, während dieser Prozedur getroffen werden sollten.