Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Veränderungen in der Lipidzusammensetzung von Neutrophilen während der Freisetzung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit Hilfe von Dünnschichtchromatographie und HPLC zu untersuchen. Mit dieser Methode können detailliertere Informationen über die Mechanismen gewonnen werden, die an der Bildung von extrazellulären Fallen für neutrophile Zellen, kurz NET-Bildung, beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es Informationen über die Rolle der Lipide in der allgemeinen Funktion von Neutrophilen liefert, indem ein leicht verständliches Protokoll verwendet wird.

Die Isolierung von Zellen aus menschlichem Blut wird von einer ehemaligen Doktorandin unseres Labors, Ariane Neumann, demonstriert. Unterstützt wird sie dabei von Friederike Reuner. Die Vorbereitung von Zellen für die Lipidanalyse wird von Graham Brogden, einem Postdoktorand in meinem Labor, und Diab Husein, einem Masterstudenten im Biochemie-Programm, demonstriert.

Zur Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut werden etwa 20 ml Blut auf 20 ml Natriumdiatrizoat/Dextran-Lösung in der Nähe einer Flamme gelegt, ohne zu mischen. 30 Minuten lang bei 470 mal g ohne Bremsen zentrifugieren. Es ist wichtig, die Blutphase nicht mit dem Dichtegrad in Lösung zu vermischen.

Nach dem Zentrifugationsschritt müssen die mononukleären Zellen vorsichtig entfernt werden, um eine Kontamination oder unspezifische Aktivierung der Zellen zu vermeiden. Entfernen Sie die mononukleären Zellen und die gelbliche Plasmaschicht. Übertragen Sie die polymorphkernige Zelle oder PMN-Phase in ein neues 50-ml-Röhrchen und füllen Sie es bis zu 50 mL mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Die Probe wird 10 Minuten lang bei 470 mal g gebremst. Entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Pellet fünf Sekunden lang in 5 ml sterilem Wasser, um die Erythrozyten zu lysieren. Füllen Sie das Röhrchen sofort auf 50 mL mit 1X PBS und zentrifugieren Sie die Probe.

Nach Entfernen des Überstands sollte das Pellet weiß sein. Wenn es immer noch rot ist, wiederholen Sie diese Schritte. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in 1000 Mikrolitern Roswell Park Memorial Institute oder RPMI-Medium.

Zählen Sie die Zellzahl mit Trypanblau-Färbung und einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop. Bereiten Sie eine Zellsuspension in RPMI in einer Konzentration von zwei Millionen Zellen pro ml vor. Aus 20 ml Blut können etwa 25 Millionen Neutrophile entnommen werden.

Für die pharmakologische Behandlung von Neutrophilen für die Lipidanalyse verwenden Sie 15 Millionen der präparierten Zellen. Inkubieren Sie die Proben zwei Stunden lang in den Reaktionsröhrchen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach der Zentrifugation der Proben wird der Überstand entfernt und das Zellpellet in 300 Mikrolitern HBSS wieder suspendiert.

Nachdem Sie die Probe mit denselben Parametern erneut zentrifugiert haben, suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 1 mL einer 1:1 Chloroform:Methanol-Lösung. Homogenisieren Sie dann das resuspendierte Pellet mit einer 26-Gauge-Kanüle, indem Sie die Probe 10 Mal in eine 1-ml-Spritze hinein- und herausschieben. Um die Lipide aus den aus dem peripheren Blut des Menschen stammenden Neutrophilen zu isolieren, nehmen Sie die vorbereiteten Neutrophilen und legen Sie sie auf Eis.

Pipettieren Sie die Neutrophilen in ein 15-ml-Glasröhrchen mit Schraubverschluss und PTFE-Dichtung und homogenisieren Sie sie durch einminütiges Schütteln. Fügen Sie dann 2 mL Methanol hinzu, gefolgt von 1 mL Chloroform eine Minute später. Nach einer weiteren Minute Schütteln drehen Sie die Glasröhren bei Raumtemperatur und 50 U/min für 30 Minuten.

Als nächstes pelletieren Sie die Proteinfraktion, indem Sie die Lösung 10 Minuten lang bei 7 Grad Celsius und 1.952 mal g zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig in ein neues 15-ml-Glasröhrchen mit Schraubverschluss, wobei das proteinhaltige Pellet zurückbleibt. Lagern Sie das Pellet bei 20 Grad Celsius für eine zukünftige Quantifizierung.

Fügen Sie 1 ml Chloroform hinzu und warten Sie eine Minute. Fügen Sie dann 1 ml doppelt destilliertes Wasser hinzu und drehen Sie das Glasröhrchen mit dem Schraubverschluss 30 Sekunden lang um. Nachdem die Probe wie zuvor zentrifugiert wurde, wird die obere Phase bis zur trüben Schicht entfernt und verworfen, jedoch nicht einschließlich.

Trocknen Sie die Proben in einem Vakuumkonzentrator bei 60 Grad Celsius und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 20 Grad Celsius. Füllen Sie zunächst bis zu 5 mL jeder Lösung in die entsprechende Glaskammer. Fügen Sie jede Art von Filterpapier hinzu, um die Laufgeschwindigkeit in jeder Kammer zu erhöhen.

Inkubieren Sie eine 20 x 10 cm große HPTLC-Kieselgel-60-Glasplatte in der ersten Lauflösung. Sobald die laufende Lösung die Oberseite der Platte erreicht, trocknen Sie sie 10 Minuten lang bei 110 Grad Celsius. Das zuvor nach dem Trocknen mit einem Vakuumkonzentrator erhaltene Lipidpellet wird in dem gewünschten Volumen von 1:1 Chloroform:Methanol-Lösung aufgelöst und 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, um sich aufzulösen.

Markieren Sie anschließend mit einem Lineal und einem weichen Bleistift die Ladepunkte für die gewünschte Anzahl von Proben plus mindestens einen Standard. Markieren Sie die Laufstrecke bei ca. 4 cm für die erste Lauflösung und bei ca. 6 cm für die zweite Lauflösung. Um die Proben zu laden, waschen Sie die 10-Mikroliter-Spritze dreimal in 1:1 Chloroform:Methanol, bevor Sie jede neue Probe laden.

Laden Sie 10 Mikroliter jeder Probe tropfenweise und versuchen Sie, die Probe auf einen möglichst kleinen Bereich zu konzentrieren. Platzieren Sie die Platte senkrecht in die erste Kammer mit laufender Lösung eins. Stellen Sie sicher, dass die Platte parallel zur Wand der Glaskammer verläuft, um eine gleichmäßige Migrationsgeschwindigkeit zu erreichen.

Achten Sie darauf, dass die Platten parallel zur Rückwand der Glaskammern platziert werden und dass die Lösungsmittelfronten nicht zu weit verlaufen, um eine effiziente Trennung der Lipide zu gewährleisten. Sobald die Lösungsmittellinie die erste Markierung erreicht hat, entfernen Sie die Platte, trocknen Sie sie und legen Sie sie in die zweite Lösung. Wiederholen Sie ähnliche Schritte für die zweite und die dritte ausgeführte Lösung.

Lassen Sie die Platte in der Lösung, bis die Lösungsmittelfront die Oberseite der Platte erreicht. Nehmen Sie dann die Platte heraus und trocknen Sie sie eine Minute lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte sieben Sekunden lang in die Kupfersulfatlösung.

Nachdem du die Platte gründlich getrocknet hast, backst du sie sieben Minuten lang im Ofen bei 170 Grad Celsius. Den Teller aus dem Ofen nehmen und abkühlen lassen. Um eine HPLC durchzuführen, befestigen Sie die Säule an einer Schutzpatrone am Gerät und erhitzen Sie sie auf 32 Grad Celsius.

Verwenden Sie Methanol als mobile Phase mit einer Durchflussrate von 1 mL pro Minute und 65 bar. Stellen Sie den UV-Detektor auf 202 Nanometer ein, um die Cholesterinmenge in jeder Probe zu quantifizieren. Waschen Sie das HPLC-Gerät gründlich, bevor Sie die Proben analysieren, und erstellen Sie eine Cholesterin-Standardkurve, wie im Textprotokoll beschrieben.

Zum Schluss werden die Proben in 500 Mikrolitern 1:1 Chloroform:Methanol in bernsteinfarbenen 1,5-ml-Glasflaschen mit roten PTFE/weißen Silikondeckeln mit Schraubverschluss wieder suspendiert, bevor Sie sie auf das HPLC-Gerät laden. Hier ist das Lipidprofil von Neutrophilen auf einer HPTLC-Platte zu sehen. Lipide können durch den Vergleich der Migrationsabstände mit dem Standard identifiziert werden.

Ebenfalls zu sehen ist ein HPLC-Chromatogramm, das zwei große Peaks zeigt. Der erste Peak kurz vor zwei Minuten ist Chloroform. Der zweite große Peak nach fünf Minuten ist das Cholesterin.

Hier sind Cholesterin-Standardkurven dargestellt, die durch HPLC und durch HPTLC bestimmt wurden. Die durch HPLC erhaltene Standardkurve ist im Vergleich zur HPTLC-Standardkurve über einen breiteren Konzentrationsbereich linear. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man aus menschlichem Blut gewonnene Neutrophile isoliert und anschließend ihre Lipidzusammensetzung analysiert.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Nitrilhandschuhe zu tragen, um Ihre Hände vor gefährlicher Chloroform:Methanol-Exposition zu schützen und auch unter einem Abzug zu arbeiten. Zukünftige Experimente werden weitere Informationen über die Mechanismen der NET-Bildung und der allgemeinen Funktionen von Neutrophilen liefern, die noch nicht vollständig verstanden sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit primären menschlichen Blutzellen eine ethische Erlaubnis sowie angemessene Sicherheitsvorkehrungen erfordert, wie z. B. die Arbeit in einem entsprechenden Biosicherheitslabor, um eine riskante Exposition gegenüber menschlichen Krankheitserregern zu vermeiden.

Schließlich ist das Ziel unserer Studie es, neue therapeutische Angriffspunkte gegen eine Infektion zu finden, die auf dem angeborenen Immunsystem basiert, und insbesondere die Lipidzusammensetzung ist für uns sehr interessant, da sie uns helfen wird zu verstehen, warum das Neutrophil antimikrobiell gegen eine Infektion wirkt.