Name: Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von Lipidveränderungen in Neutrophilen mit HPTLC und HPLC. Diese Methode liefert Einblicke in die Mechanismen der NET-Bildung und die Rolle von Lipiden in der Immunantwort.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Akademie für Tiergesundheit (HbH) und ein Stipendiums aus dem PhD-Programm „Tiere und Zoonosen“ der Universität für Veterinärmedizin, Hannover, Deutschland, zur Verfügung gestellt zu Ariane Neumann unterstützt.

Die Sammlung des peripheren Blutes in diesem Protokoll wurde von der lokalen Menschenforschungsethikkommission genehmigt. Alle menschlichen Probanden, wenn ihr eine schriftliche Einverständniserklärung. 1. Isolierung von humanen blutabgeleiteten Neutrophilen durch Dichtegradientenzentrifugation <ol><li> Isolierung von menschlichem Blut abgeleitetes Neutrophile <ol><li> Schicht ~ 20 ml Blut auf 20 ml Natriumdiatrizoat / Dextran-Lösung in der Nähe einer Flamme und ohne sich zu vermischen. </li><li> Zentrifuge 30 min bei 470 x g ohne Bremse. </li><li> Entfernen Sie die einkernigen Zellen und die gelbliche Plasmaschicht. Übertragen die polymorphkernigen Zellen (PMN) Phase (zweite Phase mit Akkumulatorzellen; 1 und 2) in ein neues 50 - ml - Röhrchen und füllt sie bis zu 50 ml mit 1 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Zentrifuge für 10 Minuten bei 470 · g mit Bremse. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 5 ml sterilem Wasser foR 5 s, die Erythrozyten lysieren. </li><li> Unmittelbar füllt für 10 min bei 470 x g auf 50 ml mit 1 × PBS und Zentrifugieren auf. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. Das Pellet sollte weiß sein. Wenn es immer noch rot ist, wiederholen Sie die Schritte 1.1.5 und 1.1.6. </li><li> Das Pellet in 1000 ul Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium. Zählen der Zellzahl unter Verwendung von Trypan-Blau-Färbung in einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop. </li><li> Vorbereiten einer Zellsuspension in RPMI in einer Konzentration von 2 x 10 6 / ml. Etwa 2,5 x 10 7 Neutrophilen können aus 20 ml Blut geerntet werden. </li></ol></li><li> Pharmakologische Behandlung von Neutrophilen für Lipidanalyse <ol><li> Verwenden 5 x 10 7 Zellen aus Schritt 1.1.9. Stellen Sie die Zellzahl in reiner Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) -Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM MßCD oder 25 nM PMA in einem Gesamtvolumen von 300 &amp; mgr; l in einem 1,5 ml Reaktionsröhrchen. </li><li> Inkubieren Sie die Proben in derReaktionsröhrchen für 2 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Zentrifuge für 10 Minuten bei 470 · g mit Bremse. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 300 &amp; mgr; l HBSS. </li><li> Zentrifuge für 10 Minuten bei 470 · g mit Bremse. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml Chloroform / Methanol (1: 1), homogenisiert es mit einer 26-G-Kanüle, indem die Probe in der und aus in eine 1 ml Spritze saugt 10mal, und speichert die Proben bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Pharmakologische Behandlung von Neutrophilen für NET Quantifizierung von Immun <ol><li> Bereiten Poly-L-Lysin beschichtete 48-Well-Platten mit Glasdeckgläschen. <ol><li> Legen Sie ein 8-mm-Glasdeckgläschen in jeder Vertiefung, fügen 55 ul sterilen 0,01% Poly-L-Lysin und inkubiere ~ 20 min bei Raumtemperatur (RT). </li></ol></li><li> Zweimal waschen mit 200 ul 1x PBS. Lagern Sie die Platten mit 200 ul 1x PBS pro Vertiefung in einem Kühlschrank, bis sie benötigt. </li><li> Autoefully mit 100 ul Zellsuspension (2 x 10 5/100 &amp; mgr; l) aus Schritt 1.1.9 pro Vertiefung in der Mitte jedes Deckglas. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung entweder den letzten 10 mM MßCD oder den letzten 25 nM PMA. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 370 xg mit Bremse. </li><li> Inkubieren für 2 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 370 xg mit Bremse. </li><li> Fixieren Sie die Zellen mit 155 ul 4% PFA, wickeln sie in Kunststoffparaffinfilm, und speichert sie über Nacht bei 4 ° C oder 10 min bei RT. HINWEIS: Für Informationen über die NET Bildung von MßCD induziert, siehe Neumann et al. 15. </li></ol></li></ol> 2. Lipid Isolierung und Analyse von menschlichem Blut abgeleiteten Neutrophile <ol><li> Isolieren der Lipide aus dem menschlichen peripheren Blut-Neutrophilen abgeleitet basierend auf Bligh und Dyer 22 und Brogden et al. 23 <ol><li&gt; Neutrophilen aus Schritt 1.2.6 nehmen und sie auf Eis legen. </li><li> Auf Eis, eine Pipette die Neutrophilen (in Methanol und Chloroform-Lösung) in ein 15 ml Schraubdeckel Glasrohr mit einer Polytetrafluorethylen (PTFE) Dichtung und homogenisieren sie für 1 min durch Schütteln. Verwenden Glasröhren, die Lipide zu verhindern, dass Kunststoffoberflächen zu binden. Verwendung PTFE Kappen Verunreinigungen aus Gummi / Kunststoff zu verhindern. </li><li> 2 mL Methanol 1 min später von 1 ml Chloroform. Schütteln Sie wieder für 1 min. </li><li> Drehen, um die Glasrohre bei RT und 50 rpm für 30 min. </li><li> Pelle die Proteinfraktion von der Lösung bei 7 ° C und 1.952 × g für 10 min zentrifugiert. </li><li> Sorgfältig dekantiert den Überstand in ein neues 15 ml-Glasrohr mit Schraubverschluß, hinter dem proteinhaltigen Pellets verlassen. Lagern Sie das Pellet bei -20 ° C für eine spätere Quantifizierung. </li><li> 1 ml Chloroform warten, 1 min, 1 ml bidestilliertem Wasser, und invertieren das Glas mit Schraubverschluß Rohr mit der Probe für 30 s. </li&gt; <li> Zentrifuge bei 7 ° C und 1.952 × g für 10 min und die obere Phase verworfen, bis hin zu, aber nicht einschließlich, die trübe Schicht. </li><li> Falls erforderlich, durchführt, indem einen optionalen weiteren Reinigungsschritt Schritt 2.1.8 wiederholen. </li><li> Trocknen Sie die Proben in einem Vakuum-Konzentrator bei 60 ° C und im Kühlschrank bei -20 ° C, bis es benötigt. </li></ol></li><li> Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC) zu halb Quantifizierung der Menge von mehreren Lipiden, einschließlich Cholesterin, Phospholipide und Sphingomyelin <ol><li> Bereiten Sie die folgenden vier Lauf Lösungen und Färbelösung. <ol><li> Lösung 1: Mischen Ethylacetat (26,6%), 1-propanol (26,6%), Chloroform (26,6%), Methanol (26,6%) und Kaliumchlorid (9,6%). Bereiten KCl durch Auflösen von 0,25 g KCl in 100 ml HPLC-Qualität Wasser. </li><li> Lösung 2: Mischung von n-Hexan (73%), Diethylether (23%) und Citronensäure (2%). </li><li> Lösung 3: 100% n-Hexan. </li><li> Bereiten Sie die Färbelösung durchMischen von destilliertem Wasser (90 ml) mit 7,5 g Kupfersulfat, und dann werden 10 ml Phosphorsäure hinzuzufügen. </li></ol></li><li> Füllen bis zu 5 mm von jeder Lösung in einem separaten Glaskammer. Fügen Sie jede Art von Filterpapier, die Laufgeschwindigkeit in jeder Kammer zu erhöhen. </li><li> Vorinkubieren eine 20 x 10 cm HPTLC Kieselgel 60 Glasplatte in der ersten Lauflösung, bis die Lösung, die die Lauf Oberseite der Platte erreicht. trocknet dann 10 min bei 110 ° C. ANMERKUNG: Diese Platten können vor der Verwendung für die zukünftige Verwendung in Aluminiumfolie getrocknet und für 10 min bei 110 ° C gelagert werden. </li><li> Man löst die Lipid Pelle aus Schritt 2.1.10 in 200 ul Chloroform / Methanol (1: 1) -Lösung und inkubieren bei 37 ° C für 15 min zu lösen. </li><li> Verwenden Sie ein Lineal und einen weichen Bleistift die Ladestellen für die gewünschte Anzahl von Proben, sowie mindestens eine Standard zu markieren. Mark der Fahrstrecke bei etwa 4 cm und 6 cm für die erste und zweite Lauflösung, respectively. </li><li> Um die Proben zu laden, waschen die 10 &amp; mgr; l-Spritze 3 mal in Chloroform / Methanol (1: 1) vor jede neue Probenbeladung. Last 10 &amp; mgr; l jede Probe tropfenweise und versucht, die Probe zu konzentrieren sich auf möglichst kleines Gebiet wie möglich. Die Proben sollten mindestens in Duplikaten geladen werden. </li><li> Die Platte wird senkrecht in die erste Kammer mit Lösung 1 ausgeführt (Schritt 2.2.1.1). Stellen Sie sicher, dass die Platte an der Wand der Glaskammer parallel ist, eine einheitliche Migrationsgeschwindigkeit zu erreichen. </li><li> Sobald die Lösungsmittelleitung die erste Markierung erreicht hat, entfernen, die Platte, trocknet, und es in der zweiten Lösung platzieren. Wiederholen Sie ähnliche Schritte für die zweite und für den dritten Lauf Lösungen; verlassen, um die Platte in der Lösung, bis die Lösungsmittelfront die Oberseite der Platte erreicht hat, dann entfernen und bei RT für 1 min trocknen. </li><li> Plazierungsplatte in Kupfersulfatlösung für 7 s. Entfernen Sie die Platte, gut trocknen, und backen in einem Ofen für 7 min bei 170 ° C. Warten für die Platte zu kühlen. </li><li> Using eine Dünnschichtchromatographie und Gelanalyse - Software, sowie eine Bildverarbeitungssoftware, scannen und analysieren , wie zuvor von Brogden et al. 23. </li></ol></li><li> Hochleistungs - Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , um die Menge des Cholesterins zu quantifizieren <ol><li> Anhängen einer 100 x 4,6 mm-Säule auf eine 5 &amp; mgr; m / 4,6 mm guard Patrone und erhitzen Sie es auf 32 ° C. Verwenden von Methanol als mobile Phase bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min bei 65 bar und einem UV-Detektor bei 202 nm Mess die Menge des Cholesterins in jeder Probe zu quantifizieren. </li><li> Waschen Sie die HPLC Maschine gründlich vor der Proben zu analysieren, die folgenden Schritte: Reinigen der Pumpe, um die Nadel Waschen, Spülen, den Topf, Spülen der Spritze, und Waschen des Pumpenspülung. Waschen Sie alle mit Wasser. Schließlich mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min für 5 min ein System Spülung mit Methanol durchzuführen. </li><li> Um eine Cholesterin-Standardkurve herzustellen, bereiten mindestens 4 Konzentrationen im Bereichvon 0,05 mg / ml bis 2 mg / ml Cholesterin in Chloroform / Methanol (1: 1) 24. </li><li> Resuspendieren der erhaltenen Proben von Schritt 2.1.10 in 500 ul Chloroform / Methanol (1: 1) in bernsteinfarbenen 1,5 ml Glasflaschen mit Schraubdeckel-rot PTFE / weiß Silikon Deckel. </li><li> Quantifizierung der Cholesterinkonzentrationen des Standard in Schritt 2.3.3 unter Verwendung. HINWEIS: Füllen Sie das Probenahmeprotokoll, beginnend mit mindestens einem Standard und eine Negativkontrolle, die von den Proben verfolgt wird. </li><li> Die Ergebnisse sind als die Fläche unter der Kurve und vergleichen Sie zwischen entsprechenden Proben jeder statistische Software. HINWEIS: Die Ergebnisse können auch gegen eine Standardkurve quantifiziert werden und können als Gesamtcholesterinmenge pro ml, g, oder die Anzahl der Zellen gezeigt werden. Die Standardkurve sollte Gleichung unter Verwendung der Werte in Schritt 2.3.3 erhalten wurden, berechnet werden. </li></ol></li></ol> 3. Visualisierung und Quantifizierung von NETs <ol><li> Visualization von NETs HINWEIS: Die Visualisierung von NETs basiert auf zuvor veröffentlichte Arbeit von Neumann et al. 15. <ol><li> Waschen der fixierten Proben aus Schritt 1.3.8 3-mal mit 200 ul 1x PBS. </li><li> Block und Permeabilisierung mit 100 ul 2% BSA, 0,2% Triton X-100 in PBS pro Well für 45 min bei RT. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l primären Antikörper: monoklonaler Maus-anti-DNA-Histon-1-Antikörper (verdünnt das Lager mit 2,2 mg / ml 1: 5000 in PBS, enthaltend 2% BSA und 0,2% Triton X-100) oder polyklonalen Antikörper gegen Myeloperoxidase (MPO; anti-Kaninchen-MPO; verdünnt 1: 300 in PBS 2% BSA und 0,2% Triton X-100) enthält. Inkubiere über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen 3 mal mit 200 ul 1x PBS. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l des sekundären Antikörpers (Fluoreszenz-markierte Ziege-anti-Maus; 1: 1000 in BSA-PBS-Triton X-100 und Ziegen-anti-Kaninchen, 1: 1000 BSA-PBS-Triton X-100) für 1 h bei RT im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie 3-mal mit 200 &amp; #181; l 1x PBS. </li><li> Entfernen Sie Deckgläser mit einer Pinzette und legen Sie sie mit 3 &amp; mgr; l Eindeckmedium enthält DAPI auf Glasplättchen Gesicht nach unten. </li><li> Untersuchen der Proben eines konfokales invertiertes Basisfluoreszenzmikroskop mit einem HCX PL APO 40X 0,75-1,25 -Ölimmersionsobjektiv 15 ausgestattet ist . </li></ol></li><li> Quantifizierung des NET-freisetzenden Kern <ol><li> Öffnen Sie eine Bildbearbeitungssoftware (zB ImageJ) und per Drag &amp; Drop Bild von Interesse in der Werkzeugleiste. </li><li> Klicken Sie auf „Plugins“, „Analysieren“ und „Zellzähler.“ </li><li> Die Taste „Initialisieren“ in den Zählerfenstern und wählt einen Zählertyp (zB, klicken Sie auf 7 in rot für NET-Releasing - Zellen und 8 in gelb für nicht-Releasing - Zellen, wie dargestellt in 6B-I und II). HINWEIS: Die Kriterien für die NET-positive Zellen: positiv gefärbter grüner Kern + ein weniger dicht nucleus (Verlust der Lobularität) oder ein Verlust der runden Form des Kerns + eine erhöhte Größe des Kerns oder ein Auftreten einer deutlichen extrazellulären off-shoot. </li><li> Klicken Sie auf jede Zelle der Einhaltung der oben genannten Kriterien und schreibt die gezählte Anzahl von Zellen in ein Datenblatt einer Analyse-Software. </li><li> Berechnen des Prozentsatzes der NET-Releasing-Zellen unter Verwendung des gezählten Zellzahlen von NET-freisetzenden und nicht-freisetzende Zellen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden , um bestimmte Lipide zu analysieren, wie Cholesterin, durch HPTLC oder HPLC und die Auswirkungen der pharmakologischen Lipidveränderungen auf der Bildung von NETs zu untersuchen (siehe Neumann et al. 15). HPTLC ist eine relativ kostengünstige und einfache Methode, ein breites Spektrum von Lipiden in einer großen Anzahl von Proben zu analysieren. Dieses Verfahren wurde in vielen Forschungsgebieten, einsc...

<html> Lipids wurden 1 eine wichtige Rolle in Zellhomöostase, Zelltod, Wirt-Pathogen - Interaktionen und Zytokin - Freisetzung gezeigt spielen. Im Laufe der Zeit das Interesse für und das Wissen über die Auswirkungen von Lipiden in der Wirt-Pathogen-Interaktionen oder Entzündung haben zugenommen, und mehrere Publikationen bestätigen die zentrale Rolle bestimmter Lipide, vor allem das Steroid Cholesterin, in zellulären Antworten. Pharmakologische Behandlung mit Statinen, die durch die Blockierung 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase) als Inhibitoren der Cholesterin-Biosynthese verwendet werden, können als entzündungshemmende Mittel wirken, indem sie die Serumspiegel von Interleukin Senkung 6 und C-reaktives Protein 2. Cholesterin- und Glycosphingolipid angereicherten Strukturen können durch verschiedene Pathogene, wie Bakterien und Viren verwendet werden, als Gateway in das Wirts 3, 4, 5,class = &quot;xref&quot;&gt; 6. Sphingolipide (zB Sphingomyelin) wurde von Pathogenen verwendet gezeigt werden , um ihre Pathogenität 7 zu fördern. In Makrophagen, Mykobakterien Verwendung Domänen-Cholesterin angereicherten Zellen für die Eingabe; ein Abbau von Cholesterin hemmt Mykobakterien - Aufnahme 8. Weiterhin Infektion von Makrophagen mit Francisella tularensis, einem Zoonoseerregers verantwortlich für Tularämie (auch als Kaninchen Fieber bekannt) 9, führte zu einer Infektion , die aufgehoben wurde , wenn Cholesterin aus den Membranen 10 aufgebraucht wurde. In ähnlicher Weise wurde die Invasion von Wirtszellen durch Escherichia coli über lipidreichen Strukturen demonstriert Cholesterin-abhängige 4 sein. Darüber hinaus zeigten S. typhimurium Infektionsversuche von Epithelzellen , dass Cholesterin für Erreger Eintritt in die Zellen 11 wesentlich ist. Cholesterin Verarmungs inhibited die Aufnahme von Salmonella - 11. Ferner ist eine aktuelle Studie von Gilk et al. gezeigt , dass Cholesterin 12 eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Coxiella burnetii spielt. Zusätzlich Tuong et al. festgestellt , dass 25-hydroxycholesterol spielt stimulierte eine entscheidende Rolle bei der Phagozytose durch Lipopolysaccharide (LPS) Makrophagen 13. Phagozytose reduziert wurde , wenn pharmakologisch Makrophagen Cholesterin 14 verarmen behandelt wurden. So Cholesterin und andere Lipide scheinen eine wichtige Rolle bei Infektionen und Entzündungen zu spielen, da ihre Erschöpfung des Risiko einer Invasion von mehreren Erregern 10, 11 zu reduzieren, 12. Vor kurzem konnten wir feststellen, dass Lipid-Veränderungen zeigen, vor allem den Abbau von Cholesterin aus der Zelle, induziert die Bildung von neutrophilen Extrazellulärr Fallen (NETS) in menschlichem Blut abgeleitetes Neutrophile 15. Seit der Entdeckung von NETs im Jahr 2004 wurde sie gezeigt entscheidende Rolle bei der bakteriellen Einschluss zu spielen und damit in behindern die Ausbreitung der Infektion 16, 17. NETs besteht aus einem DNA - Rückgrat mit Histonen, Proteasen assoziiert und antimikrobielle Peptide 16. Die Freisetzung des NETs durch Neutrophile durch eindringende Krankheitserreger 18, 19 und chemische Substanzen wie Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) oder Statine 16, 20 induziert werden. Allerdings sind die detaillierten zellulären Mechanismen, und vor allem die Rolle von Lipiden in diesem Verfahren sind noch nicht ganz klar. Die Analyse von Lipiden kann in einer Vielzahl von zellulären Prozessen und Interaktionen, wie zB die Freisetzung von NETs beteiligt zu einem besseren Verständnis der Mechanismen führen. Cholesterol und Sphingomyelin sind wichtige Bestandteile der Zellmembran und Lipid - Mikrodomänen, in denen sie die Stabilität hinzuzufügen und die Clusterbildung der in den Proteintransport und Signalereignisse 21 beteiligten Proteine zu erleichtern. Um die mechanistische Rolle bestimmter Lipiden, amphiphilen pharmakologischer Mittel, wie die cyclische Oligosaccharid Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) zu untersuchen , kann verwendet werden , um die Lipidzusammensetzung einer Zelle zu verändern , und zur Verringerung von Cholesterin in vitro 15. Hier präsentieren wir eine Methode HPTLC zu verwenden, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen in Reaktion auf MßCD zu analysieren. HPLC wurde verwendet, um das Niveau des Cholesterins in der neutrophilen Population zu bestätigen. Weiterhin beschreiben wir ein Verfahren, um die Bildung von NETs durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie in menschlichem Blut abgeleiteten Neutrophilen als Reaktion auf MßCD sichtbar zu machen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Neutrophilenisolierung, NET-Färbung und -Quantifizierung</td></tr><tr><td>Alexa Mehl 633 Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21070</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MPO&alpha; Antikörper</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3912-100G</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld-Neubauer verbesserte Zählkammer</td><td>Celeromics</td><td>MF-0640010</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop TCS SP5 AOBS mit Tandemscanner</td><td>Leica</td><td>DMI6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td>1:10 in Wasser verdünnen für 1x Arbeitslösung</td></tr><tr><td>Dy Light 488 konjugiert hochgradig kreuzabsorbiert</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35503</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>DNA/Histon 1 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB3864</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.8</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>VWR</td><td>630-1554</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&beta;-Cyclodextrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4555-1G</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td>in Wasser auflösen, erhitzen auf 65 > C und fügen Sie 1 N NaOH zur klaren Lösung</td></tr><tr><td>hinzu PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td>Stock 16 & micro; M, gelöst in 1x PBS</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>AXIS-SHIELD</td><td>AN1114683</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifading-Reagenz mit DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>PAA</td><td>E 15-848</td><td></td></tr><tr><td>HBSS mit CaCl und Mg</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblue</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>0,4% Lösung</td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Carl Roth</td><td>3255.1</td><td>endotoxinfrei</td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>><>Unternehmen</td><td>Katalognummer&nbsp; </td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Lipidisolierung und -analyse</strong</td></tr><tr><td>>1-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33538</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Spritze</td><td>Hamilton</td><td>701 NR 10 &micro; l</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Carl Roth</td><td>7336.2</td><td></td></tr><tr><td>Canullla 26 G</td><td>Braun</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)sulfatpentahydrat</td><td>Merck</td><td>1027805000</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth</td><td>7331.1</td><td></td></tr><tr><td>CP ATLAS Software</td><td>Lazarsoftware</td><td>2.0</td><td></td></tr><tr><td>Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4,6 mm Säule</td><td>Merck</td><td>152022</td><td></td></tr><tr><td>Hochleistungsflüssigkeitschromatograph Chromaster</td><td>Hitachi</td><td>HITA 892-0080-30Y</td><td>Parameter sind abhängig von der individuellen HPLC-Maschine</td></tr><tr><td>HPLC UV-Detektor</td><td>Hitachi</td><td>5410</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Säulenofen</td><td>Hitachi</td><td>5310</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Auto Probenehmer</td><td>Hitachi</td><td>5260</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Pumpe</td><td>Hitachi</td><td>5160</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexan</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30417</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Merck</td><td>49.361.000</td><td></td></tr><tr><td>Töpfer</td><td>LAT Garbsen</td><td>5 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>HPTLC Kieselgel 60</td><td>Merck</td><td>105553</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge plus Basisgerät</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Zellkultur 48-Well-Platte, flacher Boden</td><td>Sigma</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1198882</td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>BD Tuberkulinspritze nur 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden lipidveränderungen in neutrophilen und die anschließende bildung von neutrophilen extracellular traps zu studieren

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid-Analyse durch Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie durchgeführt (HPTLC) ist ein relativ einfaches, kostengünstiges Verfahren zur Herstellung eine breite Palette von Lipiden analysiert. Die Funktion von Lipiden ( zum Beispiel in der Wirt-Pathogen - Interaktionen oder Host - Eintrag) wurde eine entscheidende Rolle bei zellulären Prozessen spielen gemeldet. Hier zeigen wir ein Verfahren Lipidzusammensetzung, um zu bestimmen, mit dem Fokus auf dem Cholesterinspiegel des primären Blut abgeleiteten Neutrophilen, durch HPTLC im Vergleich zur Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Ziel war es, die Rolle der Lipid / Cholesterin Veränderungen bei der Bildung von Neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) zu untersuchen. NET-Release wird als Abwehrmechanismus bekannt Erreger zu verhindern innerhalb des Host-Ausbreitung. Daher Blut gewonnenen humanen Neutrophilen wurden mit Methyl-β-cyclodextrin (MßCD) behandelt, um Lipidveränderungen in den Zellen zu induzieren. Mit HPTLC und HPLC haben wir gezeigt, dass MßCD Behandlung der Zellen zu Lipid führtmit einer signifikanten Verringerung des Cholesteringehalt der Zelle verbunden sind Veränderungen. Zur gleichen Zeit, MßCD Behandlung der Neutrophilen führte zur Bildung von NETs, ​​wie durch Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt. Zusammenfassend hier präsentieren wir eine detaillierte Methode Lipid Veränderungen in Neutrophilen und die Bildung von NETs zu studieren.

Humanblut abgeleitetes Neutrophile wurden durch Dichtegradientenzentrifugation (Abbildung 2) isoliert. Um die Wirkung von Lipid-Veränderungen auf Neutrophilen zu untersuchen, wurden die Zellen mit 10 mM MßCD behandelt, der Cholesterin aus der Zelle verarmt. Anschließend wurden die Lipide aus den Proben von Bligh und Dyer (1, linkes Feld) isoliert, wie von Brogden et al. 23. Die hergestellten Lipidproben wurden auf Kieselg...

Lipids sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der zellulären Funktionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen, um zu bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf dem Cholesterinspiegel, sowohl durch HPTLC und HPLC mit einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der neutrophilen extrazellulären Falle Bildung zu gewinnen.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Veränderungen in der Lipidzusammensetzung von Neutrophilen während der Freisetzung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit Hilfe von Dünnschichtchromatographie und HPLC zu untersuchen. Mit dieser Methode können detailliertere Informationen über die Mechanismen gewonnen werden, die an der Bildung von extrazellulären Fallen für neutrophile Zellen, kurz NET-Bildung, beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es Informationen über die Rolle der Lipide in der allgemeinen Funktion von Neutrophilen liefert, indem ein leicht verständliches Protokoll verwendet wird.Die Isolierung von Zellen aus menschlichem Blut wird von einer ehemaligen Doktorandin unseres Labors, Ariane Neumann, demonstriert. Unterstützt wird sie dabei von Friederike Reuner. Die Vorbereitung von Zellen für die Lipidanalyse wird von Graham Brogden, einem Postdoktorand in meinem Labor, und Diab Husein, einem Masterstudenten im Biochemie-Programm, demonstriert.Zur Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut werden etwa 20 ml Blut auf 20 ml Natriumdiatrizoat/Dextran-Lösung in der Nähe einer Flamme gelegt, ohne zu mischen. 30 Minuten lang bei 4

methods-to-study-lipid-alterations-neutrophils-subsequent-formation

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Erzeugung und Isolierung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs). Neutrophile werden aus peripherem Blut isoliert und mit Phorbolmyristatacetat (PMA) stimuliert, um NETs zu produzieren. Während der Inkubation durchlaufen die Neutrophilen einen Prozess des Zelltods (NETose), um NETs freizusetzen, die aus dekondensiertem Chromatin bestehen, das mit granulären zytoplasmatischen Proteinen gemischt ist.

Eine In-vitro-Technik zur Erzeugung von extrazellulären Fallen für humane Neutrophile

Dieses Video zeigt die Induktion und Visualisierung von extrazellulären Neutrophilen-Fallen oder NETs in vormarkierten Neutrophilen unter Verwendung von Patientenserum, das zytoplasmatische Antikörper gegen Neutrophile enthält. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines undurchlässigen DNA-Farbstoffs und der Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung von NETs.

Induktion und Visualisierung von extrazellulären Fallen von Neutrophilen in vormarkierten Neutrophilen

Wir beschreiben Methoden zum isolieren eckzahn Neutrophils aus Vollblut und NET Bildung in live Neutrophilen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren. Protokolle, NET Bildung und citrullinierte Histon H3 zu quantifizieren sind auch beschrieben (citH3) Ausdruck mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt einen hochempfindliche und hohen Durchsatz Neutrophilenzahl extrazelluläre Falle (NET) Assay für die halbautomatische Quantifizierung von ex-Vivo NET Bildung durch Immunfluoreszenz dreidimensionale konfokalen Mikroskopie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um NET Bildung und Abbau nach verschiedenen Reize zu bewerten und kann verwendet werden, um mögliche NET gezielte Therapien zu studieren.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Hier wird ein Protokoll zum Nachweis der Produktion extrazellulärer Makrophagen (MET) in der Lebendzellkultur mittels Mikroskopie und Fluoreszenzfärbung vorgestellt. Dieses Protokoll kann weiter erweitert werden, um spezifische MET-Proteinmarker durch Immunfluoreszenzfärbung zu untersuchen.

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Hier wird ein Protokoll für die Induktion und Analyse von in vitro neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) vorgestellt. Die Quantifizierung von DNA, Cathelicidin (LL37) und Enzymaktivität ergab Daten, die die Variabilität in der Zusammensetzung und Morphologie von NETs zeigen, die durch mikrobielle und chemische Stimuli unter ähnlichen kontrollierten Bedingungen induziert werden.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.

Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Es wird eine Reihe von Verfahren beschrieben, darunter die Isolierung von Low-Density-Lipoprotein (LDL) aus menschlichem Plasma, die Differenzierung von HL-60-Zellen in neutrophilenähnliche Zellen, die Herstellung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) in Gegenwart von LDL und die Stimulation menschlicher Aorten-Endothelzellen mit einer Mischung aus NETs und LDL.

Stimulation von vaskulären Endothelzellen mit Hilfe von extrazellulären Fallen für Neutrophile in Gegenwart von Lipoproteinen niedriger Dichte

Neutrophile niedriger Dichte (LDN) nehmen bei mehreren Krankheiten signifikant zu. LDN werden in der Regel durch Zellsortierung isoliert. Wir stellen eine praktische Methode vor, um reines und lebensfähiges LDN zu erhalten. Nach der Dichtegradientenzentrifugation von peripherem Blut werden die Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen inkubiert und dann LDN durch magnetische Säulen getrennt.

Schnelle magnetische Mikrobead-Methode zur effizienten Aufreinigung von Neutrophilen niedriger Dichte

Erfahren Sie die Analyse von Lipidveränderungen in Neutrophilen mit HPTLC und HPLC. Diese Methode liefert Einblicke in die Mechanismen der NET-Bildung und die Rolle von Lipiden in der Immunantwort.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

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