Die arteriovenöse (AV) Loop in einem Kleintiermodell zur Untersuchung Angiogenesis und Vaskularisierte Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel dieses mikrochirurgischen Ansatzes besteht darin, eine arteriovenöse Schleife zur Herstellung axiolarer, vaskularisierter und transplantierbarer Gewebe sowie zur Analyse der Vaskularisierung in vivo und in einer isolierten und gut charakterisierten Umgebung zu erzeugen. Mit dieser Methode können wir unseren eigenen Körper als lebenden Bioreaktor zur Erzeugung verschiedener Arten axiolar vaskularisierter Gewebe nutzen, die auf die individuellen Anforderungen des jeweiligen Patienten zugeschnitten sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das erzeugte Gewebe mit seinem vaskulären Zugang transplantiert und an lokale Gefäße der Empfängerstelle angeschlossen werden kann, um eine sofortige Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen zu gewährleisten.

Neben Gewebeengineering-Studien kann diese Methode Einblicke in die Angiostenosereaktionen in einem lebenden Organismus liefern. Sie kann auch auf pathologische Situationen wie die Tumorangio­genese angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten aufgrund der hohen Komplexität des chirurgischen Eingriffs, beispielsweise der mikrochirurgischen Anastomosierung des submillimetergroßen Gefäßes.

Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir mit klinischen Fällen konfrontiert wurden, bei denen große Gewebedefekte vorlagen und die eine Transplantation atholo vascularisierten Gewebes erforderten, was eine erhebliche Mobilität der Spenderstelle zur Folge hatte. Nach Bestätigung einer adäquaten Anästhesie wiegen Sie die Ratte, um die Medikamentendosen zu berechnen. Tragen Sie anschließend Augensalbe auf, um eine Austrocknung während der Anästhesie zu verhindern.

Nach der Verabreichung von Schmerzmitteln und Antibiotika legen Sie die Ratte auf eine Heizplatte und führen kontinuierlich Isofluran zu. Überprüfen Sie anschließend den Narkosezustand durch einen Zehenquetschtest. Wenn möglich, verwenden Sie zusätzlich die Pulsoxymetrie, um den Narkosezustand der Ratte zu kontrollieren.

Fahren Sie fort, indem Sie die Innenseiten der Hintergliedmaßen rasieren. Anschließend desinfizieren Sie den Operationsbereich abwechselnd mit Betadine und Alkohol. Danach spreizen Sie die Hintergliedmaßen und fixieren sie mit Klebeband.

Schließlich positionieren Sie die Ratte unter einem Operationsmikroskop und drapieren Sie sie. Führen Sie die Operation unter sterilen Bedingungen durch. Öffnen Sie die Haut in der Mitte des linken Oberschenkels mit einem Längsschnitt vom oberen Knie bis zur Leiste unter Verwendung eines Skalpells.

Danach mit einer Präzisionsschere und feinen Pinzetten das Unterhautgewebe und die Faszie in Schichten von etwa drei Zentimetern Länge schneiden. Anhalten, sobald das femorale Gefäßbündel von der Beckenarterie in der Leiste bis zum Knie freigelegt ist. Danach mit Gewebeschere und feinen Pinzetten die Gefäße voneinander trennen und das umgebende Gewebe entfernen.

Koagulieren Sie bei Bedarf die Seitenäste mithilfe der elektrischen Koagulation. Sobald dies abgeschlossen ist, bedecken Sie das operierte Gebiet mit einer feuchten Kompresse und wiederholen Sie den Vorgang auf der rechten Seite der Ratte. Nachdem der erste Eingriff symmetrisch durchgeführt wurde, beginnen Sie nun mit der Entnahme des Venentransplantats.

Zunächst ligieren Sie die rechte Femoralvene mithilfe elektrischer Koagulation an den proximalen und distalen Enden, um ein Transplantat von etwa ein bis 1,5 Zentimetern zu erhalten. Danach entfernen Sie das venöse Transplantat mit einer Mikrozange. Zur Erweiterung der Öffnung des venösen Transplantats verwenden Sie den Gefäßdilatator.

Dann spülen Sie den Venus-Transplantat mit einer Heparin-Lösung unter Verwendung einer Irrigationsschleuse. Übertragen Sie den präparierten Transplantat auf den linken Oberschenkel und bedecken Sie das Operationsfeld auf der rechten Seite mit einer feuchten Kompresse. Danach ligieren Sie die linke Femoralvene proximal im Leistenbereich mit einer Mikrovaskularklammer.

Danach die femorale Vene distal am oberen Kniegelenk vor der Verzweigung koagulieren. Für die Anastomose verbinden Sie das proximale Ende des venösen Transplantats mit dem proximalen Ende der Vene mithilfe einer End-zu-End-Technik unter Verwendung einer 11-0-Naht. Beginnen Sie damit, die ersten beiden Nähte in den Positionen 12 Uhr und 6 Uhr zu setzen.

Danach zwei bis drei weitere Nähte zwischen diesen Punkten auf der Vorderseite anbringen. Anschließend zwei bis drei weitere Nähte auf der Rückseite setzen. Die Anastomose der Schleifengefäße ist der kritischste Schritt des Protokolls.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Nähte so genau wie möglich durchgeführt werden, um das Risiko einer Verengung oder Schließung der geschlossenen Gefäße zu verringern. Danach ligieren Sie die Arteria femoralis mit einer Mikrogefässklemme und verwenden elektronische Koagulation, ähnlich wie bei der Ligatur der Vena femoralis. Stellen Sie vor Fortsetzung sicher, dass die geschlossenen Gefäße nicht verdreht sind.

Dann anastomosieren Sie das distale Ende des Venentransplantats mit dem proximalen Ende der Arterie, wobei die gleiche Nahttechnik wie zuvor gezeigt verwendet wird. Nach der zweiten Anastomose verabreichen Sie 25 IE Heparin intravenös. Überprüfen Sie nun erneut, ob die Schleifengefäße nicht verdreht sind, und entfernen Sie anschließend die Klammern.

Beobachten Sie die Schleife etwa fünf Minuten lang auf Dichtheit und Durchgängigkeit. Bei Durchgängigkeit wird sich die Schleife erweitern und der Puls der Arterie sichtbar sein. Tröpfeln Sie während der Beobachtung Papaverin auf die Gefäße, um vaskuläre Spasmen zu verhindern.

Füllen Sie als Nächstes die Implantationskammer mit der ersten Hälfte der Matrixmischung, etwa einem halben Milliliter, vor. Anschließend wird die Schleife in die Implantationskammer eingebettet. Verschließen Sie den Kammereingang mit zwei Fibrinpfropfen und füllen Sie die Kammer mit der zweiten Hälfte der Matrixmischung auf, sodass sich ein Gesamtvolumen von einem Milliliter ergibt.

Legen Sie nun die Kammer am Oberschenkel an, verschließen Sie die Kammer mit ihrem Deckel und befestigen Sie den Deckel mit einer nicht resorbierbaren 6-0-Naht. Befestigen Sie die Implantationskammer anschließend mit einer zusätzlichen nicht resorbierbaren 6-0-Naht am Oberschenkel. Stoppen Sie jede Blutung mittels elektrischer Koagulation.

Schließen Sie die Haut abschließend mit resorbierbaren 4-0-Nähten und bedecken Sie die Wunde mit Aluminiumspray. Zu Zwecken der Knochen-Gewebetechnik wurden verschiedene Knochenersatzstoffe im kleinen Tier-Ratten-A-V-Schleifenmodell implantiert. Die Angiogenese wurde mittels 3D-Mikro-Computertomographie beobachtet.

Die Prävaskularisierung einer aufbereiteten bovinen Spongiosa-Matrix über sechs Wochen führte zu einer besseren Überlebensrate der injizierten Osteoblasten. Schleifen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Implantation entnommen, geschnitten und gefärbt. Beispielsweise zeigte die H-E-Färbung, dass die Verwendung eines beta-Tricalciumphosphat-Hydroxylapatit-Knochenersatzmaterials zusammen mit mesenchymalen Stammzellen innerhalb von sechs Wochen zu zahlreichen Gefäßverbindungen führte.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Mit dieser Methode können eine Vielzahl unterschiedlicher Zellen, Faktoren oder Antikörper implantiert werden, um ein breites Spektrum an Erkrankungen zu untersuchen. Diese Technik funktioniert auch in einem Großtier-Schaf-Venus-Schleifen-Modell.

Es sollte Forschern daher ermöglichen, vaskularisiertes Gewebe in großen, klinisch relevanten Mengen herzustellen. Dieses Modell könnte die Möglichkeit bieten, die Vaskularisierung unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Beispielsweise könnten die Einflüsse verschiedener Wachstumsfaktoren und Zellen während der Bildung von Tumorgefäßnetzwerken untersucht werden.