Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

Das übergeordnete Ziel der modifizierten Chromatin-Immunpräzipitations- und DNA-Supercoiling-Experimente ist es, die Assoziation und nachfolgende topologische Modifikationen, die durch architektonische Proteine induziert werden, mit ortsspezifischen DNA-Schäden zu untersuchen, die durch chemotherapeutische oder krebserregende Wirkstoffe in menschlichen Zellen induziert werden. Diese Methodik wird es uns ermöglichen, Schlüsselfragen zu DNA-Schäden und -Reparaturen zu beantworten, was die Entdeckung neuer pharmakologischer Ziele für die Krebstherapie erleichtern sollte. Unsere Technologie ermöglicht es uns, ortsspezifische DNA-Schäden zu lenken und die Bewertung kritischer DNA-Reparaturprozesse zu erleichtern, die für menschlichen Krebs relevant sind.

Zu Beginn werden 24 Stunden vor der Transfektion 400.000 Säugetierzellen pro 60-Millimeter-Schale in DMEM mit 10%FBS ohne Antibiotika ergänzt. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Kombinieren Sie in einem 14-Milliliter-Rundbodenröhrchen 30 Mikroliter Transfektionsmittel bei Raumtemperatur mit 500 Mikrolitern 1X-Wachstumsmedium, das auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde.

Kombinieren Sie in einem zweiten Röhrchen zwei Mikrogramm TFO-gerichtete ICL-haltige Plasmide in 500 Mikrolitern 1X-Wachstumsmedium. Inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Mischen Sie die erste mit der zweiten Mischung und pipettieren Sie sie auf und ab, um sie gründlich zu mischen.

Dann die Lösung 25 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie anschließend warmes PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Fügen Sie dann die Transfektionsmischung tropfenweise hinzu und verteilen Sie die Lösung gleichmäßig in der Zellplatte.

Gib einen Milliliter Wachstumsmedium in die Platte und bringe das endgültige Volumen auf zwei Milliliter. Gut mischen und die Kulturplatten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid aufstellen. Ersetzen Sie vier Stunden später das Medium durch drei Milliliter Wachstumsmedium mit 10 % FBS und inkubieren Sie weitere 16 Stunden.

Geben Sie nach der Inkubation 80 Mikroliter frisches 37%iges Formaldehyd pro Platte in die Zellen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Quälen Sie die Formaldehydvernetzung, indem Sie 300 Mikroliter gekühltes Glycin pro Platte hinzufügen und fünf Minuten lang inkubieren. Entfernen Sie dann das Medium und verwenden Sie gekühltes PBS, um die Platten zweimal zu waschen.

Nachdem Sie einen Millimeter gekühltes PBS hinzugefügt haben, sammeln Sie die Zellen, indem Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis kratzen, wobei die Proben immer auf Eis aufbewahrt werden. Bereiten Sie die Zellpellets vor, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 13, 400 G und vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie dann den Überstand und legen Sie die Pellets auf Eis.

Verwenden Sie einen Milliliter gekühlten Puffer A, um die Pellets homogen wieder zu suspendieren, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis. Pelletieren Sie dann die Zellen wie zuvor. Nun werden die Pellets mit einem Milliliter gekühltem Puffer B homogen wieder suspendiert und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert, wobei gelegentlich durch Invertieren gemischt wird.

Pelletieren Sie dann die Zellen wie zuvor. Nachdem Sie die Zellen erneut suspendiert haben, fügen Sie in 200 Mikrolitern gekühltem Puffer B zwei Mikroliter Mikrokokken-Nuklease oder MNase hinzu und inkubieren Sie die Reaktion 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Stoppen Sie dann die MNase-Reaktion, indem Sie die Röhrchen auf Eis legen und 40 Millimolare EDTA hinzufügen.

Der Grad der Verdauung durch Mikrokokken-Nuklease ist sehr kritisch, da eine Überverdauung zu Signalverlusten führen kann, während eine Unterverdauung eine Menge unspezifischen Hintergrunds verursachen kann. Nach dem Pelletieren der Zellen werden die Pellets in 100 Mikrolitern Chromatin-Immunpräzipitation oder ChIP-Puffer, ergänzt mit einem Proteasehemmer-Cocktail, wieder suspendiert. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein dünnwandiges Mikrozentrifugenröhrchen.

Beschallen Sie die Proben, indem Sie sie 20 Sekunden lang auf einem Wasserbad-Ultraschallgerät schweben lassen, gefolgt von 20 Sekunden auf Eis. Wiederholen Sie die Beschallungsschritte neunmal, um etwa 800 bis 1.200 Basenpaarfragmente zu erzeugen. Zu 20 Mikrolitern der beschallten Proben werden drei Mikroliter fünf molare Natriumchlorid und ein Mikroliter RNase A.Vortex in die Röhrchen gegeben und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Fügen Sie dann zwei Mikroliter Proteinase K hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Nach der Reinigung der Proben gemäß dem Textprotokoll werden sie auf 1%Agarose-Gel aufgetragen und mit Ethidiumbromid visualisiert. In drei separaten, vorgekühlten silikonisierten Röhrchen 30 Mikroliter Lysat und 70 Mikroliter gekühlter 1X-ChIP-Puffer mit Zusatz von Proteaseinhibitoren hinzufügen.

Geben Sie ein Mikrogramm Anti-IgG-, Anti-Histon-H3- oder Anti-HMGB1-Antikörper in die entsprechenden Röhrchen. Über Nacht in einem Kühlraum mit kontinuierlicher Rotation inkubieren. Geben Sie im Kühlraum nach dem erneuten Suspendieren der Protein-G-Kügelchen vier Mikroliter der Kügelchen in jedes Reaktionsröhrchen und inkubieren Sie in einem Kühlraum mit Rotation für weitere zwei bis vier Stunden.

Lege die Röhrchen auf ein magnetisches Gestell, um die Kügelchen zu pelletieren, und entferne den Überstand. Geben Sie 200 Mikroliter 1X ChIP-Puffer mit Proteaseinhibitor-Cocktail zu den Pellets und waschen Sie sie fünf Minuten lang in der Kälte mit Rotation. Führen Sie anschließend mit einem 1X-ChIP-Puffer mit hohem Salzgehalt eine zusätzliche Wäsche durch.

Verwenden Sie dann 160 Mikroliter Elutionspuffer, um die Pellets wieder zu suspendieren, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit einer Rotation für 30 Minuten. Kügeln Sie die Kügelchen und sammeln Sie den Überstand in einer frischen Tube. Fügen Sie sechs Mikroliter fünf molare Natriumchloride und zwei Mikroliter Proteinase K hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 65 Grad Celsius.

Nach der Aufreinigung der DNA gemäß dem Textprotokoll PCR-Reaktionen mit Primer-Sets für die Region oder die interessierenden Regionen durchführen und die Produkte auf einem 1%igen Agarose-Gel auflösen, das mit Ethidiumbromid gefärbt ist. Tauen Sie vor der Verwendung den zuvor vorbereiteten DNA-Reparatursynthesepuffer auf Eis auf und fügen Sie 40 millimolare Phosphokreatin und 2,5 Mikrogramm Kreatinphosphokinase hinzu. Nach der Herstellung von 10X Supercoiling-Puffer gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie einen Mikroliter Vaccinia-Topoisomerase 1 mit 1X Supercoiling-Puffer in einer 10-Mikroliter-Reaktion, um 300 Nanogramm supercoiled Plasmid, PCA FG1, zu linearisieren.

Zu den entspannten Plasmiden fügen Sie 25 Mikroliter frisch aufgetauten HeLa-Zellextrakt und DNA-Synthesepuffer hinzu. Gut mischen, dann einen Mikroliter Vaccinia Topoisomerase 1 zur Reaktion hinzufügen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Beenden Sie die Reaktionen durch Zugabe von 1 % SDS und 0,25 Milligramm Proteinase K pro Milliliter und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 65 Grad Celsius.

Nach dem Gießen eines 1%igen Agarosegels mit 1X TPE-Puffer fügen Sie den Reaktionen DNA-Ladefarbstoff hinzu und laden Sie die Proben im Abstand von mindestens vier Bahnen direkt auf das Gel. Lassen Sie das Gel acht bis 10 Stunden lang bei zwei Volt pro Zentimeter in 1X TBE für die erste Dimension bei Raumtemperatur laufen, um die Topoisomere aufzulösen. Bereiten Sie zwei Liter 1X FSME mit drei Mikrogramm pro Milliliter Chloroquinphosphat vor.

Weichen Sie das Gel 20 Minuten lang in 200 Millilitern der Lösung ein, die mit Alufolie bedeckt ist. Um das Gel in der zweiten Dimension zu elektrophoresieren, drehen Sie das Gel um 90 Grad im Uhrzeigersinn und lassen Sie es vier bis sechs Stunden lang bei zwei Volt pro Zentimeter in Chloroquin laufen, das 1X TBE enthält, um die positiven und negativen Superspulen aufzulösen. Die Menge an Chloroquin im Elektrophoresepuffer und im Gel ist sehr kritisch, ebenso wie das Betreiben des Gels mit einer sehr niedrigen Spannung für die zweite Dimension ist sehr wichtig, um die positiven und negativen Superspulen zu trennen.

Nach dem Färben und Entfärben des Gels gemäß dem Textprotokoll wird mit einem Imager die Thermoverteilung der Topoisomere visualisiert. Wie in diesem Gel zu sehen ist, wandern etwa 79% der Plasmide, die TFO-gerichtete ICLs beherbergen, im Vergleich zu den unvernetzten Kontrollplasmiden mit einer langsameren Mobilität durch die Agarosegelmatrix. ChIP-Assays, die an Lysaten aus humanen U2OS-Zellen durchgeführt wurden, die entweder mit Kontrollplasmiden oder mit Plasmiden, die TFO-gerichtete ICLs enthalten, transfiziert wurden, zeigen eine Anreicherung von HMGB1 in der P-ICL-Region im Vergleich zur Kontrollregion, wenn sie mit Anti-HMGB1-Antikörpern immunpräzipitiert wurde.

Wenn HMGB1 durch siRNA-Behandlung aus den Zellen depletiert wurde, war die P-ICL-spezifische Anreicherung vermindert. Wenn dieselben Proben mit einem Anti-IgG-Antikörper immunpräzipitiert wurden, wurde eine minimale PCR-Amplifikation nachgewiesen. In dieser Abbildung zeigt die zweidimensionale Agarose-Gelelektrophorese schließlich die architektonische Modifikation der TFO-gerichteten ICL-haltigen Plasmide als negatives Supercoiling durch HMGB1 in HeLa-Zellextrakten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa fünf Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es sehr wichtig, daran zu denken, dass alle Wäschen im Kühlraum durchgeführt werden sollten, da Waschgänge bei Raumtemperatur das Hintergrundsignal verstärken können. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die siRNA-vermittelte Proteindepletion, gefolgt von Mutations-Screening-Assays, durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, wie z. B. ob das Protein von Interesse an der DNA-Reparatur beteiligt ist.

Oder verändert es die Mutationsspektren während des Prozesses erheblich? Diese Technik ebnete den Weg für die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Proteinen und ortsspezifischen DNA-Schäden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie die Assoziation von Architekturproteinen untersuchen können, um DNA-Querverbindungen zu erreichen, und anschließend die Auswirkungen einer solchen Assoziation auf die Topologie der DNA zu bestimmen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ethidiumbromid extrem gefährlich sein kann, und daher sollte bei der Durchführung dieses Experiments immer die richtige Schutzausrüstung getragen werden.