Name: Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Erfahren Sie modifizierte Chromatin-Immunopräzipitation und DNA-Supercoiling-Assays zur Untersuchung von Protein-Assoziationen bei ortsspezifischen DNA-Schäden in humanen Zellen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung neuer pharmakologischer Ziele für die Krebstherapie.

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Die Autoren möchten die Mitglieder des Vasquez Labor für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health / National Cancer Institute unterstützt [CA097175, CA093279 zu KMV]; und die Krebsprävention und Forschungsinstitut für Texas [RP101501]. Die Finanzierung für den offenen Zugang Gebühr: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 zu KMV].

1. Herstellung von TFO-directed ICLs auf Plasmid Substrate <ol><li> Inkubieren äquimolaren Mengen von Plasmid pSupFG1 10,11 DNA (5 ug Plasmid - DNA ist ein guter Ausgangspunkt) mit Psoralen-konjugiertes TFO AG30 in 8 ul von Triplex Bindungspuffer [50% Glycerin, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl 2] und dH 2 O auf ein Endvolumen von 40 ul in einem bernsteinfarbenen Röhre. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C Wasserbad für 12 Stunden. </li><li> Wärmen Sie die UVA-Lampe bis zur vollen Leistung zu gewährleisten. Legen Sie die Triplex-Reaktion auf Paraffinfilm, und legen Sie die Paraffinfilm auf Eis unter dem UVA (365 nM) Lampe. Legen Sie eine Mylar-Filter zwischen der Lampe und der Reaktion. </li><li> UVA Bestrahlung mit einer Gesamtdosis von 1,8 J / cm 2. Lagern Sie die Proben bei 4 ° C für die weitere Verwendung. Achtung: Tragen Sie angemessene Schutzbrille und Kleidung mit UV-A-Bestrahlung. </li><li> Linearisieren 200 ng des oben hergestellten Plasmids mit der Wiederschränkung Enzym Eco R1 in einem 20 &amp; mgr; l Gesamtvolumen versorgt den Hersteller mit 10 - fach - Puffer. Wärme denaturieren das Enzym 20 min bei 65 ° C. Dreh die Proben für 10 min bei 10.000 × g und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten 50x alkalischen Puffer [1,5 M NaOH, 50 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)]. Mit 0,5 mg Agarose zu 50 ml dH 2 O. Kochen Sie die Agarose zu lösen und sie in einem Wasserbad 50 ° C. </li><li> Nachdem die Temperatur des gelösten Agarose auf 50 ° C ist nach unten, 1 ml des 50x alkalischen Puffer, es mischen und dann das Gel in den Gelträger gießen. Genügend Zeit für das Gel bei Raumtemperatur zur Verfestigung vor der Verwendung. </li><li> Hinzufügen 4 ul 0,5 M EDTA zu den 20 &amp; mgr; l linearisierte DNA-Probe und inkubiere für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen 6x alkalische Gel - Ladepuffer (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% (w / v) hochmolekulare Polysaccharid, 0,06% Bromkresolgrün in dH 2 O) zu den Proben und zu einem 1 kb DNA - Leiter. HINWEIS: Es ist wichtig, 6x alkalische Gelladepuffer zu verwenden, benutzen Sie bitte Diskussion zu sehen. </li><li> Laden Sie die Proben auf das Gel in den Kühlraum und über Nacht in 1x alkalischen Puffer (12-16 h) bei 3,2 Volt pro cm ausgeführt werden. Sobald die Proben des Gels eingegeben haben, legen Sie eine Glasplatte auf der Oberseite des Gels zu verhindern, dass schweben. </li><li> Neutralisieren der Proben durch das Gel in Neutralisationspuffer Einweichen [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, 3 M Natriumacetat (pH 5,2)] für 45 min bei Raumtemperatur. </li><li> Beflecken das Gel für DNA mit 4 ul 1% Ethidiumbromid (EtBr) in 50 ml Wasser 1 h bei Raumtemperatur. mit Wasser für 15 min entfärben. Visualisieren der DNA durch ein Abbildungssystem verwendet wird. Achtung: EtBr ist ein potenter mutagen und kann über die Haut aufgenommen werden. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit EtBr. </li></ol> 2. Transfektion und Immunopräzipitation von TFO-gerichtete ICL-haltigen Plasmide in menschlichen Zellen <ol><li> Platte 400.000 Säugerzellen (zB o U2OSsteosarcoma Zellen) pro 60 mm-Schale in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ohne Antibiotika 24 h vor der Transfektion ergänzt. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Vor der Transfektion warmen Wachstumsmedien und phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf 37 ° C in einem Wasserbad. Wärmen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur. </li><li> Inkubiere 30 ul Transfektionsreagenz mit 500 ul 1x Wachstumsmedien (Mix 1) und 2 &amp; mgr; g TFO-directed ICL-haltigen Plasmide in 500 &amp; mgr; l 1x Wachstumsmedien (Mix 2) in getrennten 14 ml-Rundbodenröhrchen für 10 min bei Zimmertemperatur. </li><li> In Mischung 1 bis 2 mischen, gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Inkubieren für 25-30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit warmem PBS. Fügen Sie die Transfektionsgemisch in einer tropfenweise Art und Weise gleichmäßig über die Platte von Zellen zu verteilen. 1 ml Wachstumsmedium auf die Platte und bringt das Endvolumen auf 2 ml. mischen wirll. Legen Sie die Kulturplatten in der 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für 4 Stunden. </li><li> Ersetzen Sie die Medien mit 3 ml Wachstumsmedium mit 10% FBS, und Inkubation weiter für 16 Stunden. Nicht Antibiotika verwenden. </li><li> Behandlung von Zellen mit 80 &amp; mgr; l von 37% frischem Formaldehyd pro Platte bis zu einer Endkonzentration von etwa 1% und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur in Abwesenheit von Licht. Achtung: Formaldehyd ist giftig und sollte entsprechend seiner Sicherheitshinweisen behandelt werden. Formaldehyd Exposition kann Schäden an der Haut verursachen, Augen und Atemwege. </li><li> Quench Formaldehyd Vernetzung von 300 ul gekühltem Glycin Zugabe (in kommerziell erhältlichen Kits mitgeliefert) pro Platte und Inkubation für 5 min. Entfernen Sie die Medien und waschen zweimal mit kaltem PBS und dann Zellen sammeln, indem in 1 ml gekühlt (4 ° C) PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen Schaben. Halten Sie die Proben auf Eis zu allen Zeiten. </li><li> Bereiten Zellpellets von 5 min eine auf 4 ° C zentrifugiertt 13.400 xg eine Tischkühlzentrifuge mit. Pipettieren den Überstand aus und legen Sie das Zellpellet auf dem Eis. </li><li> Homogen Resuspendieren des Pellets in 1 ml gekühltem (4 ° C) Puffer A (in handelsüblichen Kits geliefert) und für 10 Minuten auf Eis inkubieren. Mischen Sie gelegentlich durch das Rohr zu invertieren. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 2.9 oben). </li><li> Homogen Resuspendieren des Pellets in 1 ml gekühltem (4 ° C) Puffer B (in handelsüblichen Kits geliefert) gegeben und 10 min unter gelegentlichem Mischen auf Eis inkubieren durch Invertieren. Pellet-Zellen durch Zentrifugation wie zuvor (siehe Schritt 2.9 oben). </li><li> Resuspendieren wieder die Zellen in 200 &amp; mgr; l Buffer gekühlt B. In 2 ul Mikrokokken-Nuclease (MNase) gegeben und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mischen Reaktion gelegentlich durch das Rohr schnippen. Stoppen Sie die MNase Reaktion durch das Rohr auf Eis gestellt und Zugabe von 40 mM EDTA. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 2.9 oben). </li><li> Die Zellen in 100 ul 1x Chromatin immunoprecipitation Puffer (CHIP) Puffer (in kommerziell erhältlichen Kits im Lieferumfang enthalten) mit Protease-Inhibitor-Cocktail ergänzt. </li><li> Legen Sie die resuspendierten Zellen in einem dünnwandigen Mikrozentrifugenröhrchen. Beschallen die Proben, indem sie auf dem Wasser Ultraschallbad für 20 Sekunden, gefolgt von 20 Sekunden Inkubation auf Eis schwimmt. Wiederholen Sie die Schritte 9 Beschallung mal ~ 800-1.200 bp Fragmente zu erzeugen. <ol><li> Zu 20 ul der beschallten Proben werden 3 ul 5 M NaCl und 1 &amp; mgr; l RNase A. Gut mischen durch Vortexen und Inkubation bei 37 ° C für 30 min. Anschließend fügen Sie 2 ul Proteinase K und bei 65 ° C für 2 Stunden inkubiert. Reinige die Proben eine PCR-Reinigungs-Kit. Führen Sie Proben auf 1% Agarose-Gel und visualisieren mit EtBr. HINWEIS: Die maximale Intensität der entstehenden DNA sollte bei oder unter 1.000 bp sein. </li></ol></li><li> In drei getrennten Röhren, fügen Sie 30 ul Lysat in einem vorgekühlten silikonisierten Röhrchen und dann 70 ul von ChIP-Puffer mit Zusatz von Protease-Inhibitoren gekühlt 1x hinzufügen. 1 μg anti-Immunglobulin G (IgG), anti-Histon H3 (als positive Kontrolle), oder Anti-HMGB1-Antikörper zu den jeweiligen Rohren. Inkubieren über Nacht in einem kalten Raum mit kontinuierlicher Rotation. </li><li> Resuspendieren Protein G-Kügelchen homogen im kalten Raum. Hinzufügen 4 ul Protein G-Kügelchen pro Röhrchen und Inkubation für weitere 2-4 h in einem kalten Raum mit Rotation. </li><li> Mit Hilfe eines magnetischen Rack, Pellet, das die Perlen und den Überstand zu entfernen. Mit 200 &amp; mgr; l 1x ChIP-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail zu dem Pellet vermischt und wasche für 5 min in einem kalten Raum mit Rotation. Wiederholen Sie zweimal waschen. </li><li> Führen Sie eine zusätzliche Wäsche mit hohem Salz 1x ChIP-Puffer (enthaltend 70 mM NaCl). </li><li> Resuspendieren der Pellets mit 160 &amp; mgr; l Elutionspuffer (in handelsüblichen Kits geliefert) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C mit Rotation. </li><li> Pellet die Perlen und den Überstand in ein frisches Röhrchen sammeln. In 6 ul 5 M NaCl und 2 ul Proteinase K, und Inkubation über Nacht bei 65° C. </li><li> Reinige den DNA ein PCR - Produkt Purification Kit verwendet und Eluieren der DNA unter Verwendung von 50 &amp; mgr; l dH 2 O. </li><li> Führen PCR Reaktionen unter Verwendung von 16 Primersets an die Region (en) von Interesse und lösen die Produkte auf einem 1% Agarosegel , gefärbt mit Ethidiumbromid. </li></ol> 3. Superspiralisierung Assay und 2-dimensional Agarosegelelektrophorese <ol><li> Vorbereitung der DNA - Reparatur - Synthese - Puffer (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; 70 mM KCl; 7,4 mM MgCl 2; 0,9 mM DTT, 0,4 mM EDTA, 2 mM ATP, 20 uM dNTPs, 3,4% Glycerin und 18 ug Rinderserumalbumin) . Bei -80 ° C. Thaw auf Eis und vor der Verwendung 40 mM phosphocreatine hinzufügen und 2,5 ug Kreatinphosphokinase. </li><li> Bereiten 10x supercoiling Puffer [500 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 25 mM MgCl 2, 1 mM EDTA], und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Linearisieren 300 ng supercoiled Plasmid pSupFG1 DNA vollständig unter Verwendung von 1 &amp; mgr; l Vaccinia Topoisomerase I (5-15 U / ul) mit 1xsupercoiling Puffer in einer 10 ul Reaktion. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Auftauen HeLa zellfreien Extrakt 24 auf dem Eis. Zu den ganz entspannt Plasmide, fügen Sie 25 ul HeLa zellfreien Extrakt und DNA-Reparatur-Synthese-Puffer. Gut mischen. Fügen Sie zusätzliche 1 ul Vaccinia Topoisomerase I auf die Mischung, und Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS) (1% Endkonzentration) und Proteinase K (0,25 mg / ml Endkonzentration). Inkubieren bei 65 ° C für 2 Stunden. </li><li> Werfen Sie einen 1% Agarose-Gel mit 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer. In Farbstoff DNA Laden und laden Sie die Reaktionen direkt auf das Gel mindestens 4 Bahnen auseinander. Führen des Gels für 8-10 h bei 2 V / cm in 1x TBE (Dimension 1) bei Raumtemperatur, um die Topoisomere lösen. HINWEIS: Bereiten Sie eine Lösung Lager 5x TBE in 1 l dH 2 O mit 54 g Tris - Base hinzugefügt wird . 27,5 g Borsäure und 20 ml von 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Bereiten Sie 2 l 1xTBE mit 3 &amp; mgr; g / ml Chloroquin-phosphat. Einweichen des Gels in 200 ml dieser Lösung für 20 min. Decken Sie den Gelträger mit Aluminiumfolie. </li><li> Um das Gel in der zweiten Dimension elektrophoretisch, drehen Sie das Gel 90 ° im Uhrzeigersinn und führen Sie es für 4-6 Stunden bei 2 V / cm in Chloroquin 1x TBE mit den positiven und negativen supercoils zu lösen. </li><li> Stain das Gel mit EtBr für 1 Stunde auf einer Wippe. Mit einem Imager Entfärben des Gels mit dH 2 O für 15 Minuten und anschließend die thermische Verteilung der Topoisomere visualisieren. </li></ol>

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<li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li>
<li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+number+of+2%27-O-%282-aminoethyl%29+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li>
<li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li>
<li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Die effiziente Bildung von TFO-directed ICLs hängt von zwei entscheidenden Faktoren: Erstens richtigen Pufferkomponenten (zB MgCl 2) und die Zeit der Inkubation des TFO mit seiner Ziel - DNA - Substrat (abhängig von der Bindungsaffinität des TFO an seine Ziel duplex, und die Konzentrationen verwendet werden); und zweitens, die richtige Dosis an UVA (365 nm) Bestrahlung Psoralen Vernetzungen effizient bilden. Optimale Triplex-Bildung kann durch die Verwendung HPLC oder gelgereinigt TFOs erreicht werde...

Triplex Forming Oligonucleotide (TFOs) bind duplex DNA in einer sequenzspezifischen Art und Weise via Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindung tripelhelicalen 1-5 Strukturen zu bilden. Triplex - Technologie verwendet, um eine Vielzahl von biomolekularen Mechanismen, wie Transkription, DNA - Schäden zu reparieren, und Gen - Targeting ( zusammengefasst in Referenzen 6-8) zu befragen. TFOs wurden 9,10 ausgiebig zu induzieren ortsspezifische Schäden an Reporter - Plasmide verwendet. Unser Labor und andere haben bislang auf einer TFO, AG30, gebunden an ein Psoralen Molekül 5,10-12 ortsspezifische DNA - Quervernetzungen zwischen (ICL) im supF - Gen auf dem Plasmid pSupFG1 zu induzieren. ICLs sind hochcytotoxisch wie diese Läsionen kovalente Verknüpfung der beiden DNA - Stränge zu vernetzen, und wenn nicht repariert, kann Gen - Transkription blockieren und die DNA - Replikationsmaschinerie 13,14 behindern. Wegen ihres zytotoxischen Potentials ICL-induzierende Mittel wurden als chemotherapeutische Wirkstoffe in der Behandlung verwendetvon Krebs und anderen Krankheiten , 15. Jedoch ist die Bearbeitung und die Reparatur von ICLs in menschlichen Zellen nicht gut verstanden. So kann ein besseres Verständnis der bei der Verarbeitung von ICLs Mechanismen in menschlichen Zellen helfen, die Wirksamkeit der ICL-basierten chemotherapeutischen Therapien zu verbessern. TFO-induzierte ICLs und deren Reparatur Zwischenprodukte haben das Potenzial, erhebliche strukturelle Verzerrungen bei der DNA-Helix zu verursachen. Solche Verzerrungen sind wahrscheinlich Ziele für architektonische Proteine, die mit einer höheren Affinität zu verzerrten DNA binden als an kanonischen B-Form Duplex - DNA - 16-20. Hier untersuchten wir die Assoziation eines hoch reichlich architektonischen Protein HMGB1 mit ICLs in menschlichen Zellen durch Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Assays auf Psoralen netzten Plasmiden und identifiziert eine Rolle für HMGB1 in Modulieren der Topologie des Psoralen netzten Plasmid DNA in menschlichen Krebs Zelllysaten. HMGB1 ist ein sehr reichlich vorhanden und ubiquitär exprimiert nicht seinTon architektonischen Protein , das als 17-20 DNA kanonischen B-Form , um beschädigte DNA und alternativ strukturierten DNA - Substrate mit einer höheren Affinität bindet. HMGB1 ist 16,21-23 in mehreren DNA - Stoffwechselprozesse, wie beispielsweise Transkription, DNA - Replikation und DNA - Reparatur beteiligt. Wir haben zuvor gezeigt , dass HMGB1 bindet an TFO-directed ICLs in vitro mit hoher Affinität 20. Gerichtet TFO-ICLs und identifiziert HMGB1 als Nukleotidexzisionsreparatur (NER) Cofaktor 23,24 weiteren haben wir gezeigt , dass der Mangel an HMGB1 des mutagenen Verarbeitung erhöht. Vor kurzem haben wir festgestellt , dass mit HMGB1 TFO-directed ICLs in menschlichen Zellen und ihre Einstellung auf solche Läsionen auf dem NER - Protein, XPA 16 abhängig zugeordnet ist. Negative Supercoiling von DNA wurde von NER 25, und wir haben festgestellt , die effiziente Entfernung von DNA - Läsionen zu fördern gezeigt , dass HMGB1 negativen supercoiling induziert bevorzugt auf TFO-directed ICL enthaltenden plasmid Substrate (bezogen auf nicht-beschädigten Plasmiden Substrate) 16, um ein besseres Verständnis der möglichen Rolle (n) von HMGB1 als NER Cofaktor bereitstellt. Die Verarbeitung von ICLs ist nicht vollständig in menschlichen Zellen zu verstehen; Somit entwickelt die Techniken und Assays auf der Basis der molekularen Werkzeugen hierin beschrieben könnte in ICL-Reparatur beteiligt zur Identifikation von zusätzlichen Proteinen führen, die wiederum dienen als pharmakologische Ziele, die ausgenutzt werden können, um die Wirksamkeit von Krebs-Chemotherapie zu verbessern. Hierbei ist ein wirksamer Ansatz, die Effizienz der TFO-directed ICL Bildung in Plasmid-DNA zu beurteilen durch Agarosegelelektrophorese denaturierenden diskutiert. Ferner Techniken unter Verwendung der Plasmide, die die TFO-gerichtete ICLs enthält, die Assoziation von HMGB1 mit ICL geschädigten Plasmide in einem zellulären Kontext mit modifizierten ChIP Assays zu bestimmen, wurden beschrieben. Zusätzlich zu eine einfache Methode topologische Modifikationen durch th eingeführt studierene architektonischen Protein HMGB1, insbesondere on-ICL beschädigt Plasmid Substrate in menschlichen Zell-Lysaten wurde durch Durchführung supercoiling Assays über zweidimensionale Agarose-Gelelektrophorese bestimmt. Die beschriebenen Techniken können das Verständnis der Beteiligung von DNA-Reparatur und architektonischen Proteine ​​in der Verarbeitung von gezielten DNA-Schädigung auf Plasmiden in menschlichen Zellen zu fördern verwendet werden. Wir beschreiben detaillierte Protokolle für die Bildung von TFO-gerichtete ortsspezifische Psoralen ICLs auf Plasmid-DNA und anschließende Plasmid ChIP und Supercoiling Assays Proteine ​​zu identifizieren, die mit den Läsionen assoziiert, und Proteine, die die DNA-Topologie zu verändern, respectively. Diese Assays können modifiziert werden, um mit anderen DNA-schädigenden Mitteln durchzuführen, TFOs Plasmid Substrate und Säugerzelllinien von Interesse. In der Tat haben wir gezeigt , dass es mindestens eine potentielle einzigartige und hochaffinen TFO-Bindungsstelle innerhalb jedes kommentierten Gen im menschlichen Genom ist 26. Wiehaupt, aus Gründen der Klarheit beschrieben wir diese Techniken für die Verwendung eines spezifischen Psoralen-konjugiertes TFO (pAG30) auf einer spezifischen Mutation Reporterplasmid (pSupFG1) in menschlichen U2OS - Zellen , wie wir in Mukherjee &amp; Vasquez 2016 16 genutzt haben.

<table><tbody><tr><td>5'HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>Sonderanfertigung</td><td>HPLC (oder Gel) gereinigtes</td></tr><tr><td>einfaches ChIP Enzymatisches Chromatin IP Kit</td><td>Zellsignalisierung Inc.</td><td>9003</td><td>Das vom Hersteller vorgeschlagene Protokoll ist für Chromatin-IP und nicht für Plasmid-IP optimiert. Die Kontroll-IgG- und H3-Antikörper sowie die Protein-G-Kügelchen und die Mikrokokken-Nuklease werden vom Hersteller zur Verfügung gestellt.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR-Mastermix</td></tr><tr><td>HMGB1-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel und PCR-Aufreinigungskit</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquin-Diphosphat-Salz</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>Für die zweidimensionale Agarose-Gel-Elektrophorese</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>GenePORTER Transfektionsreagenz</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray langwellige UV-Lampe</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>UVA-Lampe</td></tr><tr><td>EpiSonic Multifunktionaler Bioprozessor 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>Wasserbad-Ultraschallgerät</td></tr><tr><td>Mylar-Filter</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td>80112939</tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>BIO-RAD</td><td>XRS+ System</td><td>DNA-Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Wird zum Vernetzen verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher 25200056</td><td></td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Bromokresol grün</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>DNA-Ladefarbstoff</td></tr><tr><td>Silikonisierte Röhrchen</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>02-681-320</td><td>Mikrofuge-Röhrchen mit niedriger Retention</td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td>Photometer</td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>UVA-Dosismessung</td></tr><tr><td><stark>Zelllinien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humanes U2OS-Osteosarkom</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>Kultiviert nach Lieferanten' Empfehlung</td></tr><tr><td>Humanes zervikales Adenokarzinom HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Kultiviert gemäß Lieferant Empfehlung</td></tr><tr><td>Proximaler Forward Primer</td><td>5&prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac Proximaler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>reverse Primer</td><td>5&prime;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distaler Forward Primer</td><td>5&prime;-aat acc gcg cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distaler reverse Primer</td><td>5&prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tools, um die rolle der architektur-protein hmgb1 zur untersuchung bei der verarbeitung von helix verzerrenden, ortsspezifische dna-quervernetzungen zwischen

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

High-Mobility-Group-Box 1 (HMGB1) Protein ein Nicht-Histon-Protein, das in Architektur Regulieren viele wichtige Funktionen im Genom, wie beispielsweise Transkription, DNA-Replikation und DNA-Reparatur beteiligt ist. HMGB1 bindet strukturell verzerrten DNA mit einer höheren Affinität als zu kanonischen B-DNA. Beispielsweise fanden wir, dass HMGB1 bindet an DNA Interstrang-Vernetzungen (ICLs), die die beiden Stränge der DNA kovalent verknüpfen, Verzerrung der Wendel verursachen und nicht reparierten wenn links kann zum Zelltod führen. Aufgrund ihrer zytotoxische Potential sind mehrere ICL auslösende Mittel, die gegenwärtig als chemotherapeutische Mittel in der Klinik eingesetzt. Während ICL bildende Mittel Präferenzen für bestimmte Basensequenzen zeigen (zB 5&#39;-TA-3 &#39;ist die bevorzugte Vernetzungsstelle für Psoralen), DNA - Schäden in einer wahllos Art und Weise sie weitgehend induzieren. Jedoch durch kovalentes Koppeln des ICL-induzierenden Mittels zu einem Triplex Forming Oligonucleotid (TFO), die in einer sequenzspezifischen DNA bindetWeise gezielte DNA-Schädigung erreicht werden. Hier verwenden wir einen TFO kovalent auf der &#39;Ende zu einem 4&#39;-Hydroxymethyl-4,5&#39; 5 konjugiert, 8-trimethylpsoralen (HMT) Psoralen eine ortsspezifische ICL auf einem mutations Reporterplasmid zu erzeugen als ein Werkzeug zu verwenden, die architektonische Modifizierung, Verarbeitung und Reparatur von DNA-Komplex Läsionen durch HMGB1 in menschlichen Zellen zu untersuchen. Wir beschreiben experimentelle Techniken TFO-gerichtete ICLs auf Reporter-Plasmide herzustellen, und die Assoziation von HMGB1 mit den TFO-gerichtete ICLs in einem zellulären Kontext mit Chromatinimmunpräzipitation Assays zu verhören. Ferner beschreiben wir DNA-Supercoiling Assays spezifische architektonische Modifikation des beschädigten DNA zu bewerten, indem die Menge der superhelikalen Windungen Messung auf dem Psoralen-vernetzt Plasmid durch HMGB1 eingeführt. Diese Techniken können verwendet werden, um die Rollen von anderen Proteinen in der Verarbeitung und Reparatur von TFO-directed ICLs oder anderen zielgerichteten DNA-Schäden in jeder Zelllinie von Interesse beteiligt zu studieren.

Bildung des TFO-directed ICL ist kritisch für die Plasmid-basierte Assays, die verwendet werden, um die Rollen von architektonischen Proteine ​​in ICL Verarbeitung in menschlichen Zellen zu befragen. denaturierender Agarosegelelektrophorese ist ein facile Weg, um die Effizienz der TFO-directed ICL Formation zu bestimmen. Die Plasmide TFO-gerichtete ICLs beherbergen wandern mit einer geringeren Mobilität durch die Agarosegelmatrix (1A, Spur 3) im Vergleich zu den nicht-ve...

Gezielter DNA-Schaden kann durch Bindung eines DNA-schädigenden Wirkstoffs an ein Triplex-bildendes Oligonukleotid (TFO) erreicht werden. Unter Verwendung modifizierter TFOs können DNA-Schadens-spezifische Proteinassoziationen und DNA-Topologiemodifikationen in menschlichen Zellen durch die Verwendung von modifizierten Chromatin-Immunpräzipitationsassays und DNA-Supercoiling-Assays, die hierin beschrieben werden, untersucht werden.

Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Das übergeordnete Ziel der modifizierten Chromatin-Immunpräzipitation und der DNA-Supercoiling-Experimente besteht darin, die Assoziation und nachfolgenden topologischen Veränderungen zu untersuchen, die durch Architekturproteine an standortspezifischen DNA-Schäden verursacht werden, welche wiederum durch chemotherapeutische oder kanzerogene Substanzen in menschlichen Zellen induziert wurden. Diese Methodik ermöglicht es uns, zentrale Fragen zur DNA-Schädigung und -Reparatur zu klären, was die Entdeckung neuer pharmakologischer Zielstrukturen für die Krebstherapie fördern sollte. Unsere Technologie erlaubt es uns, standortspezifische DNA-Schäden gezielt herbeizuführen, und erleichtert die Bewertung kritischer DNA-Reparaturprozesse, die für den menschlichen Krebs von Relevanz sind.Beginnen Sie 24 Stunden vor der Transfektion mit dem Ansäen von 400.000 Säugetierzellen pro 60-Millimeter-Platte in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, ohne Antibiotika. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. In einem 14-Milliliter-Rundbodentestgefäß mischen Sie 30 Mikroliter Transfektionsreagenz bei Raumtemperatur mit 500 Mikrolitern 1× Wachstumsmedium, das auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde.In einem zweiten Reagenzglas zwei Mikrogramm TFO-gerichteter, ICL-haltiger Plasmide in 500 Mikroliter 1× Wachstumsmedium kombinieren. Die Reagenzgläser 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Mischung eins mit Mischung zwei vereinigen und mehrmals auf- und abpipettieren, um gründlich zu mischen.Anschließend die Lösung 25 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach die Zellen zweimal mit warmer PBS waschen. Dann die Transfektionsmischung tropfenweise hinzufügen und die Lösung gleichmäßig über die Zellkulturplatte verteilen.Geben Sie ein Milliliter Wachstumsmedium in die Platte und stellen Sie das Endvolumen auf zwei Milliliter ein. Mischen Sie gründlich und stellen Sie die Kulturplatten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Vier Stunden später ersetzen Sie das Medium durch drei Milliliter Wachstumsmedium mit 10 % FBS und inkubieren Sie weitere 16 Stunden.Nach der Inkubation 80 µL frisches 37 % Formaldehyd pro Platte zu den Zellen geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Die Formaldehyd-Vernetzung durch Zugabe von 300 µL kaltem Glycin pro Platte abspülen und 5 Minuten inkubieren. Anschließend das Medium entfernen und die Platten zweimal mit kaltem PBS waschen.Anschließend, nach Zugabe von einem Milliliter kaltem PBS, sammeln Sie die Zellen durch Abkratzen in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und halten Sie die Proben stets auf Eis. Bereiten Sie die Zellpellets durch Zentrifugation bei 13.400 × g und vier Grad Celsius über fünf Minuten vor. Entfernen Sie dann den Überstand und stellen Sie die Pellets auf Eis.Verwenden Sie ein Milliliter gekühlte Pufferlösung A, um die Pellets homogen zu resuspendieren, und inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis. Anschließend pelletieren Sie die Zellen wie zuvor. Suspendieren Sie die Pellets nun mit einem Milliliter gekühlter Pufferlösung B homogen und inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis mit gelegentlichem Mischen durch Vorsichtig-Invertieren.Anschießend die Zellen erneut pelletieren. Nach dem erneuten Aufschwemmen der Zellen in 200 Mikroliter kaltem Puffer B, zwei Mikroliter Mikrokokken-Nuklease (MNase) hinzufügen und die Reaktion 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach die MNase-Reaktion stoppen, indem die Röhrchen auf Eis gestellt werden und 40 Millimolar EDTA zugegeben wird.Der Grad der Verdauung durch Mikrokokken-Nuklease ist sehr kritisch, da eine Überverdauung zu Signalverlust führen kann, während eine Unterdigestion eine hohe unspezifische Hintergrundreaktion verursachen kann. Nach dem Pellettieren der Zellen die Pellets in 100 Mikrolitern Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-Puffer, ergänzt mit Proteaseinhibitor-Cocktail, resuspendieren. Anschließend die Zellsuspension in ein dünnwandiges Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Sonizieren Sie die Proben, indem Sie sie neunmal für jeweils 20 Sekunden in einem Wasserbad-Sonikator schwimmen lassen, jeweils gefolgt von 20 Sekunden auf Eis. Wiederholen Sie die Sonikationsschritte insgesamt neunmal, um Fragmentgrößen von etwa 800 bis 1.200 Basenpaaren zu erzeugen. Geben Sie zu 20 Mikroliter der sonizierten Proben drei Mikroliter fünfmolaren Natriumchlorid und ein Mikroliter RNase A hinzu. Vortexen Sie die Röhrchen und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.Fügen Sie dann zwei Mikroliter Proteinase K hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden bei 65 Grad Celsius. Nach der Aufreinigung der Proben gemäß dem Textprotokoll werden diese auf einem 1 %igen Agarosegel laufen gelassen und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. In drei getrennten, vorab gekühlten silikonisierten Röhrchen geben Sie jeweils 30 Mikroliter Lysat und 70 Mikroliter kalten 1× ChIP-Puffer mit zugesetzten Proteaseinhibitoren hinzu.Fügen Sie ein Mikrogramm Anti-IgG-, Anti-Histon-H3- oder Anti-HMGB1-Antikörper zu den jeweiligen Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie über Nacht im Kühlschrank mit kontinuierlicher Rotation. Im Kühlschrank, nachdem die Protein-G-Kügelchen erneut suspendiert wurden, geben Sie vier Mikroliter der Kügelchen zu jedem Reaktionsröhrchen hinzu und inkubieren Sie weitere zwei bis vier Stunden im Kühlschrank unter Rotation.Stellen Sie die Röhrchen auf einen Magnethalter, um die Perlen zu pelletieren, und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 200 Mikroliter 1X ChIP-Puffer mit Proteaseinhibitorcocktail zu den Pellets und waschen Sie diese unter Rötation fünf Minuten lang bei Kälte. Führen Sie anschließend eine zusätzliche Wäsche mit 1X ChIP-Puffer mit hohem Salzgehalt durch.Verwenden Sie dann 160 Mikroliter Elutionspuffer, um die Pellets erneut aufzusuchen, und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Rotation. Zentrifugieren Sie die Bäumchen und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Röhrchen. Geben Sie sechs Mikroliter Fünf-Molar-Natriumchlorid und zwei Mikroliter Proteinase K hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 65 Grad Celsius.Nach der DNA-Reinigung gemäß dem schriftlichen Protokoll führen Sie PCR-Reaktionen unter Verwendung von Primer-Sets für den bzw. die gewünschten Bereich(e) durch und trennen die Produkte in einem 1 %igen Agarosegel, das mit Ethidiumbromid gefärbt ist. Vor der Verwendung tauen Sie den zuvor hergestellten Puffer für die DNA-Reparatursynthese auf Eis auf und geben 40 Millimolar Phosphokreatin sowie 2,5 Mikrogramm Kreatinphosphokinase hinzu. Nach der Herstellung des 10X-Supercoiling-Puffers gemäß dem schriftlichen Protokoll verwenden Sie ein Mikroliter Vaccinia-Topoisomerase 1 zusammen mit 1X Supercoiling-Puffer in einer 10-Mikroliter-Reaktion, um 300 Nanogramm supercoiled Plasmid PCA FG1 zu linearisieren.Zu den entspannten Plasmiden 25 Mikroliter frisch aufgetauten HeLa-Zellextrakt und DNA-Synthese-Puffer hinzufügen. Gut mischen, dann ein Mikroliter Vaccinia-Topoisomerase 1 zur Reaktion geben und eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Reaktionen durch Zugabe von 1 % SDS und 0,25 Milligramm pro Milliliter Proteinase K beenden und zwei Stunden bei 65 Grad Celsius inkubieren.Nachdem ein 1 %igen Agarosegel mit 1X TPE-Puffer hergestellt wurde, DNA-Ladefarbstoff zu den Reaktionen hinzufügen und die Proben direkt mindestens vier Gelen weit auseinander auf das Gel auftragen. Das Gel acht bis zehn Stunden lang bei zwei Volt pro Zentimeter in 1X TBE bei Raumtemperatur für die erste Dimension laufen lassen, um die Topoisomere aufzutrennen. Zwei Liter 1X TBE mit drei Mikrogramm pro Milliliter Chloroquinphosphat herstellen.Die Gele in 200 Milliliter der Lösung einweichen, abgedeckt mit Aluminiumfolie, für 20 Minuten. Um das Gel in der zweiten Dimension elektrophoretisch aufzutrennen, das Gel um 90 Grad im Uhrzeigersinn drehen und vier bis sechs Stunden bei zwei Volt pro Zentimeter in Chloroquin enthaltendem 1X TBE laufen lassen, um die positiven und negativen Supercoils aufzutrennen. Die Menge an Chloroquin im Elektrophoresepuffer sowie im Gel ist sehr kritisch, ebenso wie das Laufenlassen des Gels bei einer sehr niedrigen Spannung in der zweiten Dimension, um die positiven und negativen Supercoils zu trennen.Nach der Färbung und Entfärbung des Gels gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie ein Bildgebungssystem, um die Thermoverteilung der Topoisomere zu visualisieren. Wie auf diesem Gel zu sehen ist, wandern etwa 79 % der Plasmide, die TFO-gesteuerte ICLs enthalten, langsamer durch die Agarosegel-Matrix im Vergleich zu den nicht vernetzten Kontrollplasmiden. ChIP-Assays, die an Lysaten aus humanen U2OS-Zellen durchgeführt wurden, die entweder mit Kontrollplasmid oder mit Plasmiden, die TFO-gesteuerte ICLs enthalten, transfiziert worden waren, zeigen eine Anreicherung von HMGB1 in der P-ICL-Region im Vergleich zur Kontrollregion, wenn sie mit anti-HMGB1-Antikörper immunpräzipitiert wurden.Wenn HMGB1 durch siRNA-Behandlung aus den Zellen entfernt wurde, war die P-ICL-spezifische Anreicherung verringert. Bei denselben Proben wurde nach Immunpräzipitation mit einem Anti-IgG-Antikörper eine minimale PCR-Amplifikation detektiert. Schließlich zeigt in dieser Abbildung die zweidimensionale Agarose-Gelelektrophorese eine strukturelle Modifikation der TFO-vermittelten, ICL-haltigen Plasmide durch negative Supercoiling von HMGB1 in HeLa-Zellextrakten.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa fünf Tagen durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, daran zu denken, dass alle Waschschritte im Kühlschrank erfolgen sollten, da Waschungen bei Raumtemperatur das Hintergrundsignal erhöhen können. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie zum Beispiel siRNA-vermittelte Proteindepletion, gefolgt von Mutations-Screening-Assays, durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, beispielsweise: Ist das Protein von Interesse an der DNA-Reparatur beteiligt?Oder verändert es die Mutationsprofile während des Prozesses signifikant? Diese Technik ebnete den Weg, um die Assoziation zwischen Proteinen und standortspezifischen DNA-Schäden zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine klare Vorstellung davon haben, wie man die Assoziation architektonischer Proteine mit gezielten DNA-Quervernetzungen untersucht und anschließend den Effekt einer solchen Assoziation auf die Topologie der DNA bestimmt.Es sollte nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit Bromid-Ethidium äußerst gefährlich sein kann, und daher sollte während der Durchführung dieses Experiments stets die richtige Schutzausrüstung getragen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Hallo-C-Methode ermöglicht unvoreingenommene, genomweite Identifizierung von Chromatin-Wechselwirkungen (1). Hallo-C Paare Ligationssysteme und massiv parallele Sequenzierung. Die resultierenden Daten können verwendet werden, um genomische Architektur auf mehreren Skalen zu studieren: die ersten Ergebnisse identifizierten Features wie Chromosom Gebiete, Segregation von offenen und geschlossenen Chromatin und Chromatin-Struktur an der Megabasen.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung eines DNA Doppelstrangbruch Signalprotein als Reaktion auf DNA-Schäden sowie seine Lokalisierung während der Mitose aktiviert.

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Elektronenspektroskopische Bildgebung kann Nukleinsäuren und Proteine mit Nanometerauflösung abbilden und unterscheiden. Es kann mit dem miniSOG-System kombiniert werden, das in der Lage ist, markierte Proteine in Transmissionselektronenmikroskopie-Proben spezifisch zu markieren. Den Einsatz dieser Technologien veranschaulichen wir am Beispiel von Doppelstrangbruch-Reparaturschwerpunkten.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Das vorliegende Protokoll zeigt eine modifizierte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) und deren posttranslationalen Modifikationen (PTMs), einschließlich Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung, die durch Topoisomerase-Inhibitoren und Formaldehyd induziert werden, wodurch die Bildung und Reparatur von DPCs und ihren PTMs untersucht werden kann.

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Hier stellen wir ein einfaches und schnelles Protokoll für den Nachweis von Proteininteraktionen an DNA-Schadensstellen vor.

Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

Dieses Protokoll demonstriert die Durchführung eines Einzelmolekül-Assays zur Live-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase. Sie beschreibt (1) die Herstellung eines DNA-Substrats, (2) die Reinigung der fluoreszenzmarkierten Drosophila melanogaster CMG-Helikase, (3) die Vorbereitung einer mikrofluidischen Durchflusszelle für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) und (4) den Einzelmolekül-DNA-Entwindungsassay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Wir stellen eine schnelle und effiziente Methode vor, um häufige Brüche an fragilen Stellen durch native γH2A.X-Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zu detektieren. Dieser Ansatz reduziert sowohl den Zeit- als auch den Arbeitsaufwand, der mit herkömmlichen γH2A.X ChIP-Assays verbunden ist, erheblich und behält gleichzeitig eine hohe Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse bei.

Erfassung häufiger fragiler Stellenbrüche durch natives γH2A. X ChIP

Erfahren Sie modifizierte Chromatin-Immunopräzipitation und DNA-Supercoiling-Assays zur Untersuchung von Protein-Assoziationen bei ortsspezifischen DNA-Schäden in humanen Zellen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung neuer pharmakologischer Ziele für die Krebstherapie.

Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen (Video) | JoVE Journal

Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

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