Visualisierung des Charcoal Agar Resazurin-Assay für Semi-quantitative, Mitteldurch Auszählung von Mykobakterien

Das übergeordnete Ziel der CARA ist es, eine semiquantitative Bewertung der Aktivität von Verbindungen gegen replizierende und nicht-replizierende Mykobakterien mit mittlerem Durchsatz zu liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das CARA als KBE-Surrogat es ermöglicht, die Dosis- und Zeitabhängigkeit einer Verbindung schnell zu testen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Tuberkulose-Wirkstoffforschung zu beantworten, z. B. die Bestimmung, ob eine Substanz bakteriostatisch oder bakterizid gegen replizierende Bakterien und bakterizid gegen nicht-replizierende Bakterien ist.

Die Methode wird von Julia Roberts, einer Mitarbeiterin in unserem Labor, demonstriert. Geben Sie 450 Milliliter Wasser in ein Ein-Liter-Glasbecherglas oder 900 Milliliter Wasser in einen Zwei-Liter-Erlenmeyerkolben. Geben Sie einen autoklavierbaren Rührstab in das Becherglas oder den Kolben.

Fügen Sie anschließend ein Middlebrook 7H11-Pulver, Aktivkohle mit einer Endkonzentration von 0,4 % und eine 50%ige Glycerinlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 % zu erreichen. Decken Sie die Öffnung des Kolbens oder Bechers mit Alufolie ab und befestigen Sie sie mit Autoklavenband am Glas. Nach dem Autoklavieren des Mediums kühlen Sie es auf einer magnetischen Rührplatte, die auf niedrige Geschwindigkeit eingestellt ist, auf etwa 55 bis 65 Grad Celsius ab, um die Holzkohle in Schwebe zu halten.

Während Sie aseptisch in einer Biosicherheitshaube arbeiten, die über eine magnetische Rührplatte verfügt, entfernen Sie die Folie vom Medium und geben Sie 100 oder 50 Milliliter OADC-Zusatz in den Zwei-Liter-Kolben bzw. den Ein-Liter-Becher und mischen Sie weiter. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette mit acht oder 12 Filterspitzen eine 96-Well-Mikroplatte mit 200 Mikrolitern 7H11-OADC-Holzkohle aus dem Reagenzreservoir oder Becherglas, wobei Sie schnell vorgehen, um eine Agarverfestigung und die Bildung von Blasen zu vermeiden. Legen Sie Stapel von CARA-Mikrotiterplatten in wiederverschließbare Plastiktüten, um ein Austrocknen zu vermeiden, und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.

Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit rundem oder konischem Boden, die vier bzw. 20 Milliliter Middlebrook 7H9-ADN oder 7H9-OADC enthalten, werden mit M.smegmatis bei einem OD580 von 0,01 bis 0,1 inokuliert. Inkubieren Sie die M.smegmatis-Kulturen bei 37 Grad Celsius und 20 % O2 unter Schütteln, wobei Sie die Kulturen auf die mittlere logarithmische Phase oder einen ungefähren OD580 von 0,5 erweitern. Um ein Experiment mit minimaler inhibitorischer Konzentration unter replizierenden und nicht-replizierenden Bedingungen durchzuführen, verteilen Sie 200 Mikroliter Zellen in 7H9-ADN bei einem OD580 von 0,01 in alle Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit klarem Boden, die mit Gewebekulturen behandelt wurde.

Verwenden Sie für den nicht-replizierenden Assay PBS mit 0,02 % Tyloxapol, um die Zellen zweimal zu waschen. Und verwenden Sie ein nicht-replizierendes Medium, um die Zellen wieder zu suspendieren. Verwenden Sie ein nicht replizierendes Medium, um die Zellen auf eine OD580 von 0,1 zu verdünnen, und fügen Sie Natriumnitrat bis zu einer Endkonzentration von 0,5 bis 5 Millimolar aus einem frisch zubereiteten Einmolstock hinzu.

Verteilen Sie 200 Mikroliter Zellen mit einem OD580 von 0,1 in alle Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit klarem Boden, die mit Gewebekulturen behandelt wurde. Nach der Vorbereitung der Testmittel gemäß dem Textprotokoll werden zwei Mikroliter des Testmittels eins in die Reihen A bis E und zwei Mikroliter des Testmittels zwei in die Reihen E bis H gegeben und gründlich gemischt. Für die Replikation von Assays inkubieren Sie M.smegmatis-Mikrotiterplatten bei 37 Grad Celsius, 20 % O2 und 5 % CO2 für ein bis 48 Stunden.

Verwenden Sie zu den Zeitpunkten, zu denen das CARA als Ausleseeinheit verwendet wird, eine p200-Mehrkanalpipette mit einem Fassungsvermögen von 50 bis 75 Mikrolitern, um den Well-Inhalt der MIC90-Assay-Platte vorsichtig wieder zu resuspendieren, indem Sie fünf- bis zehnmal auf und ab pipettieren. Schwenken Sie dann mit den Pipettenspitzen den Inhalt der Vertiefungen vorsichtig in kreisenden Bewegungen. Übertragen Sie 10 Mikroliter des unverdünnten Assay-Well-Inhalts in die entsprechenden Wells der CARA-Mikroplatte, um Spritzer während des Transfers zu vermeiden, und stellen Sie sicher, dass das 10-Mikroliter-Aliquot in der Mitte der CARA-Mikrotiterplatten-Wells aufgefleckt wird.

mit Plattenband Stapel von CARA-Mikrotiterplatten und legen Sie sie dann in einen wiederverschließbaren Plastikbeutel. Inkubieren Sie die M.smegmatis CARA-Mikroplatten bei 37 Grad Celsius mit 20 %O2 für ein bis zwei Tage für replizierende Platten und zwei bis drei Tage für nicht replizierende Platten. Wenn ein Film von Bakterienwachstum oder größere makroskopische Kolonien in den Negativkontrollvertiefungen sichtbar sind, verwenden Sie einen einzigen Satz von 12 p200-Spitzen mit einer Mehrkanalpipette, um 40 Mikroliter steriles PBS entlang der Seite der Vertiefungen abzugeben und das PBS über die Oberseite der Agar-/Bakterien-Mikrokolonien verteilen zu lassen.

Bereiten Sie das CARA-Entwicklungsreagenz vor, indem Sie fünf Milligramm Resazurin und 50 Milliliter 5%Tween80 in PBS mischen. Geben Sie 50 Mikroliter frisch zubereitetes CARA-Entwicklungsreagenz in jede Vertiefung der CARA-Mikroplatte. Schaukeln Sie dann die Platten ein paar Mal hin und her, um das Reagenz auf dem Agar und der Bakterienmatte in jeder Vertiefung zu verteilen.

Legen Sie die Platten in eine wiederverschließbare Plastiktüte und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius für M.smegmatis. Legen Sie die CARA-Mikrotiterplatten vor der Fluoreszenzmessung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine Biosicherheitshaube, wobei die Deckel entfernt wurden. Wenn Sie BSL3-Spektralphotometer außerhalb einer Biosicherheitswerkbank verwenden, kleben Sie einen PCR-Aufkleber in optischer Qualität auf die Platte und verwenden Sie ein weiches Papiertuch, um sie durch leichtes Drücken auf die Aufkleberoberfläche fest zu verschließen.

Bestimmen Sie die Fluoreszenz per Top-Read mit Anregung bei 530 Nanometern und Emission bei 590 Nanometern. Es ist nicht notwendig, die Platte zu leeren. Um die Daten zu analysieren, stellen Sie die Inhibitorkonzentration auf der X-Achse als log10-Skala und die Fluoreszenz auf der Y-Achse auf einer linearen Skala dar.

Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll. Die Konzentration des Prüfmittels, die dazu führt, dass die CARA-Fluoreszenz nicht über die Hintergrundwerte ansteigt, ist der CARA-MBC größer als 99, wie hier gezeigt. Der Index "größer als gleich" von 99 bedeutet, dass der CARA-MBC eine geschätzte Konzentration des Testmittels liefert, die zu einer bakteriellen Abtötung von mehr als zwei log10 führt.

Verbindungen stehen im Verdacht, eine postantibiotische Wirkung auszuüben, wenn sie ein statisches Fenster aufweisen, das als eine mehr als vierfache Verschiebung nach rechts zwischen der MIC- und der CARA-Kurve definiert ist. Das statische Fenster zeigt an, dass ein Molekül, das gegen die Replikation von M. tuberculosis aktiv ist, bakteriostatisch statt bakterizid sein kann. Bei Molekülen mit einer starken postantibiotischen Wirkung können statische Fenster schwierig zu beobachten sein und sie sind erst nach der Untersuchung einer erweiterten Y-Achse auf CARA-Fluoreszenz sichtbar, wie hier zu sehen.

Hier sind replizierende und nicht-replizierende aktive Moleküle dargestellt, die mit MIC90 und CARA getestet wurden. Während Isoniazid und Linezolid durch den MIC90-Assay eine Aktivität gegen nicht-replizierende Bakterien zu haben scheinen, deutet die CARA darauf hin, dass sie unter den getesteten nicht-replizierenden Bedingungen inaktiv sind. In diesem CARA-Experiment zeigte die Exposition von M. smegmatis gegenüber steigenden Konzentrationen von Rifampicin eine Wirkung in nur einer Stunde und zeigte eine zunehmende bakterizide Aktivität zwischen drei und 24 Stunden, die mehr als gleich zwei bis drei log10 bei etwa 10 Mikrogramm pro Milliliter bis 24 Stunden tötete.

Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, um Platten vorzubereiten, in weniger als einer Stunde für den Transfer von Zellen auf CARA-Platten und in etwa ein bis zwei Stunden für die Entwicklung und Messung der Fluoreszenz von CARA-Platten, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den CARA als prädiktiven Assay zu verwenden, um festzustellen, ob eine Verbindung eine bakterizide oder bakteriostatische Aktivität gegen Mykobakterien hat, die sich replizieren oder nicht replizieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein CARA einrichten und Daten so analysieren, dass die Art der Aktivität einer Verbindung vorhergesagt werden kann.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.