Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Das übergeordnete Ziel dieses DNA-Assemblierungsprotokolls ist es, die wiederholbare, skalierbare, automatisierte Hochdurchsatzproduktion von DNA-Geräten zu ermöglichen. Diese Arbeit befasst sich mit dem Bedarf an einem robusten und benutzerfreundlichen Software-Workflow, der Pipettieranweisungen für einen Liquid Handler auf der Grundlage von High-Level-DNA-Gerätedesigns generieren kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die automatisierte Reaktionsvorbereitung wiederholbar und skalierbar ist und im Vergleich zur manuellen Vorbereitung nur 4 % der praktischen Zeit erfordert.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Automatisierungsschritte schwer zu erlernen sein können und eine Kombination aus experimentellen und rechnerischen Methoden sind. Für diese Studie wurde ein Softwaretool entwickelt, das die Skriptgenerierung automatisieren kann. Navigieren Sie in einem beliebigen Webbrowser zu MoCloAssembly.

com und laden Sie GenBank-Dateien für alle DNA-Teile hoch, die in das Design des kombinatorischen DNA-Geräts einbezogen werden. Nachdem alle Dateien hochgeladen wurden, wählen Sie die gewünschten DNA-Teile aus. Es können sowohl Sammlungen von Teilen als auch Einzelteile ausgewählt werden.

Ziehen Sie die Teile auf die leere Arbeitsfläche. Ordnen Sie DNA-Teile so an, dass die fünf Primzahl- und drei Primzahlüberhänge für jeden Teil übereinstimmen. Platzieren Sie Teiletypen in der vorgesehenen endgültigen Reihenfolge der DNA-Teile.

Klicken Sie unten rechts auf der Seite auf Zusammenbauen. Beachten Sie, dass das Softwaretool nur gültige baubare Baugruppen auf der Grundlage der vier Basenpaar-Überhänge generiert, die jedes Teil beim Verdau mit dem BSA1-Enzym flankieren. Navigieren Sie zur Registerkarte Pläne, und laden Sie die vom Tool generierten Dateien herunter.

Diese Dateien werden für Menschen lesbare Plattenkarten enthalten, auf denen die Wissenschaftler DNA-Proben vorbereiten können, sowie Reagenzien, die für die Reaktionen erforderlich sind, eine Auswahlliste für den Liquid Handler und vollständig annotierte GenBank-Dateien für alle zu montierenden DNA-Geräte. Bevor Sie mit der modularen DNA-Assemblierung beginnen, bereiten Sie die Plasmid-DNA vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die korrekte Bestückung der Setup-Platte und der Reagenzplatte unter Verwendung der vom Werkzeug generierten Platten-Maps.

Befolgen Sie die vom Assemblierungswerkzeug generierte Plattenkarte der PDF-Datei und platzieren Sie das angegebene Volumen jedes verdünnten DNA-Teils in der entsprechenden Vertiefung auf einer 96-Well-PCR-Platte mit vollem Rand. Halten Sie diese Setup-Platte bis zur Verwendung auf Eis. Bereiten Sie auf Eis den Reaktions-Mastermix mit den folgenden Komponenten vor.

Für jeweils 20 Mikroliter Reaktion fügen Sie zwei Mikroliter 0X T4-DNA-Ligase-Puffer, 0,5 Mikroliter T4-DNA-Ligase und einen Mikroliter BSA1-Enzym hinzu. Befolgen Sie die Plattenkarte für die Reagenzplatte in der generierten PDF-Datei und verteilen Sie den Enzym-Mastermix in die entsprechenden Vertiefungen einer neuen 96-Well-PCR-Platte mit vollem Rand. Bewahren Sie diese Reagenzplatte auf Eis oder auf einem 96-Well-Kaltblock auf.

Um diesen Vorgang zu starten, platzieren Sie die Setup-Platte und die Reagenzplatte auf dem Deck des Liquid Handlers. Fügen Sie eine leere 96-Well-PCR-Platte mit vollem Rand hinzu. Die leere Platte ist die Ausgangsplatte, auf der die Reaktionen zusammengesetzt werden.

Bereiten Sie die Steuerungssoftware für den Liquid Handler vor, indem Sie Instanzen jeder vorbereiteten Probe und Reagenzplatte erstellen und sicherstellen, dass sie genau so benannt sind, wie sie auf den von MoCloAssembly. com generierten Plattenkarten erscheinen, einschließlich eines Trogs mit sauberem, deionisiertem Wasser, das mit einem Reservoir beschriftet ist. Laden Sie mit dem Befehl Worklist in der Steuerungssoftware die von unserem Softwaretool generierte GWL-Datei, gefolgt von einem weiteren Worklist-Befehl, der die im ersten Befehl geladene GWL-Datei ausführt.

Führen Sie das Skript mit dem Befehl Ausführen der Steuerungssoftware aus. Nachdem der robotergestützte Liquid Handler die Ausführung des Skripts abgeschlossen hat, entfernen Sie alle Platten aus dem Liquid Handler-Deck. Bewahren Sie die restliche DNA auf, indem Sie die Aufstellplatte mit Aluminium-Siegelfolie versiegeln und bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Verschließen Sie die Ausgabeplatte mit Klebefolie, legen Sie sie in einen Thermocycler oder Wärmeblock und lassen Sie den Zyklus mit folgenden Parametern laufen: 37 Grad Celsius für zwei Stunden, 50 Grad Celsius für fünf Minuten, 80 Grad Celsius für 10 Minuten und halten Sie ihn bei vier Grad Celsius. Um die Sterilität zu erhalten, sollte dieses Verfahren in der Nähe einer offenen Flamme durchgeführt werden.

Tauen Sie die erforderliche Anzahl an kompetenten E.coli-Zellaliquoten auf Eis auf. Während die Zellen auftauen, bereiten Sie LB-Agarplatten vor, die das entsprechende Antibiotikum enthalten. Erstellen Sie einen Mastermix aus IPTG und X-GAL.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter des Mastermixes auf die Oberfläche jeder Platte und verwenden Sie Glasperlen, um die Platte gleichmäßig zu beschichten. Inkubieren Sie die Platten mindestens 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Bakterien plattieren. Bereiten Sie die Transformationsplatte vor, indem Sie 10 Mikroliter kompetenter Zellen für jede Reaktion in eine neue 96-Well-PCR-Platte auf Eis aliquotieren.

Geben Sie ein bis drei Mikroliter jeder Reaktion aus der Ausgangsplatte in die entsprechende Vertiefung in der Transformationsplatte und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf Eis. Versiegeln Sie die Transformationsplatte mit Klebefolie und Hitzeschock in einem Thermocycler bei 42 Grad Celsius für 30 Sekunden. Stellen Sie den Teller sofort für zwei Minuten auf Eis.

In die gleichen Vertiefungen der Transformationsplatte werden 150 Mikroliter SOC-Medien gegeben, mit einem Klebesiegel verschlossen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und Schütteln bei 900 U/min inkubiert. Nach einer Stunde wird der gesamte Inhalt jeder Vertiefung der Transformationsplatte auf die zuvor vorbereiteten LB-Agarplatten aufgetragen. Verwenden Sie Glasperlen, um die Oberfläche der Platte gleichmäßig zu beschichten.

Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie am Tag nach der Umwandlung einen oder mehrere 96-Well-Tiefbrunnen-Kulturblöcke mit 1,5 Millilitern LB-Bouillon pro Vertiefung vor. Entnehmen Sie mit einem sterilen Zahnstocher in der Nähe einer offenen Flamme einzelne weiße Kolonien aus jeder LB-Agarplatte mit transformierten Reaktionen und beimpfen Sie den Vertiefungskulturblock.

Verschließen Sie den Kulturblock mit einer gasdurchlässigen Versiegelung und inkubieren Sie ihn bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 900 U/min über Nacht. Isolieren Sie anschließend Plasma-DNA aus Bakterienkulturen mit einem handelsüblichen Kit und reichen Sie sie für eine Sanger-Sequenzierung ein, um die Klone zu verifizieren. Die Reaktionszeiten wurden über alle drei Modalitäten hinweg verglichen.

manuelle Montage dauerte zwei Stunden und 10 Minuten, was alles praktische Arbeit war. Der Liquid Handler benötigte ähnlich viel Zeit, um die Pipettierbefehle auszuführen, aber nur fünf Minuten davon waren praktisch. Der akustische Dispenser benötigte deutlich weniger Zeit, um den Flüssigkeitstransfer durchzuführen, und das mit minimalem Zeitaufwand.

Dieses Diagramm zeigt die Kosten pro Reaktion für jede Assemblierungsmethode. Diese Kosten beinhalten den Preis für die verwendeten Enzyme und Pipettenspitzen. Für 95 % der 96 manuellen und Liquid-Handler-Sets wurden korrekte Sequenzen erhalten.

Nur 12 der vollen 96 Baugruppen wurden aus den mit dem Akustikspender vorbereiteten Proben transformiert und 83 % waren korrekt. Zwei Reaktionen führten zu keinen weißen Kolonien, wahrscheinlich aufgrund einer unzureichenden Mischung von DNA- und Enzym-Mastermix-Tröpfchen in der Ausgangsplatte. Ein Vergleich der Wirkungsgrade von Klonierungsreaktionen, gemessen anhand des Verhältnisses der weißen Kolonien zur Gesamtzahl der Kolonien, zeigt vergleichbare Prozentsätze für manuell montierte und mit einem Liquid-Handler montierte Reaktionen.

Mit unserem Tool können Forscher Liquid-Handling-Roboter nutzen, um kombinatorische DNA-Bibliotheken zu erstellen. Diese Methode ist wiederholbar, skalierbar, spart dem Forscher wertvolle Zeit und verringert die Wahrscheinlichkeit von Pipettierfehlern, die durch sich wiederholende komplexe Pipettieraufgaben durch Menschen entstehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie wissen, wie Sie mit unserem Online-Tool kombinatorische Baugruppen für modulare Klonierungsreaktionen generieren und wie Sie zwei generierte Pipettierskripte auf einem Liquid-Handling-Roboter ausführen.

Wir sehen die automatisierte DNA-Assemblierung mit Liquid-Handling-Robotern als nur einen Schritt in zukünftigen Laboratorien für synthetische Biologie. Mit zunehmender Designkomplexität gehen wir davon aus, dass sich solche Ansätze immer mehr durchsetzen werden, und freuen uns, diesen ersten Schritt in diesem Prozess dargestellt zu haben.