LED Thermo Flow - Die Kombination mit Optogenetik Flow Cytometry

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, optisch kontrollierte Substanzen während durchflusszytometrischer Messungen zu stimulieren. Dieses neuartige Gerät kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Zellsignalisierung zu beantworten, indem es die Leistungsfähigkeit optisch kontrollierter Substanzen mit der Durchflusszytometrie kombiniert. Zum ersten Mal können optogenetische Werkzeuge mittels Durchflusszytometrie charakterisiert und analysiert werden.

Bis heute gab es keine vergleichbare etablierte Methode. Zu Beginn suspendieren Sie transduzierte Ramos-B-Lymphozyten in einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter und übertragen Sie sie in ein FACS-Glasröhrchen. Tauschen Sie anschließend den schwarzen O-Ring des Durchflusszytometers gegen einen Gummi-O-Ring aus und tragen Sie Silikonfett auf, um eine bessere Abdichtung zu erzielen.

Setzen Sie das Glasröhrchen in ein Durchflusszytometer ein und platzieren Sie den LED-Prototyp bei ausgeschaltetem Licht um das Röhrchen. Messen Sie die Fluoreszenzintensität von Dronpa im GFP-Kanal. Der kritischste Schritt des Verfahrens ist die Handhabung der Glasröhren.

Glas-FACS-Röhrchen sind sehr zerbrechlich, daher wird empfohlen, das Einführen der Glasröhrchen in das Zytometer vor der Durchführung von Experimenten zu üben. Schalten Sie dann das 500-Nanometer-LED-Licht an der Außenseite der Röhre ein und fahren Sie mit der Messung der Fluoreszenzintensität von Dronpa fort. Erhöhen Sie die Intensität der LED-Leuchten, bis die Dronpa-Fluoreszenzintensität abnimmt, um die minimale Lichtintensität abzuschätzen, die erforderlich ist, um das Photoschalten des Dronpa-Linker-Dronpa-Proteins zu messen.

Schalten Sie dann das 400-Nanometer-LED-Licht des Prototyps an der Außenseite der Röhre ein und fahren Sie mit der Messung der Fluoreszenzintensität von Dronpa fort. Erhöhen Sie die Lichtintensität der 400-Nanometer-LED-Leuchten, bis die Fluoreszenzintensität von Dronpa zunimmt. Befolgen Sie zunächst die Design- und Herstellungsanweisungen im begleitenden Textprotokoll, um die inneren und äußeren Schichten des fotoschaltenden LED-Geräts herzustellen.

Setzen Sie die LEDs mit einer Wellenlänge von 400 und 500 Nanometern in die Kanäle des Geräts ein. Kleben Sie sie fest und verdrahten Sie sie wie angegeben. Diese spezifischen Wellenlängen werden verwendet, um die Dronpa-Linker-Dronpa-Fusionsproteine zwischen ihrem dunklen und hellen Zustand zu schalten.

Montieren Sie dann das Gerät und stellen Sie sicher, dass es wasserdicht ist, um Leckagen zu vermeiden, bevor Sie den Transformator einschalten. Nach dem Zusammenbau des Geräts werden Ramos-B-Lymphozyten entnommen und in einer Dichte von drei bis zehn Millionen Zellen pro Milliliter suspendiert. Übertragen Sie 600 Mikroliter der Zellen in ein FACS-Glasröhrchen.

Legen Sie sie auf Eis und schützen Sie die Zellen vor Licht, bis sie vermessen werden. Schließen Sie das zusammengebaute Gerät an eine beheizte Wasserpumpe an und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Führen Sie dann das Glas-FACS-Rohr vorsichtig in das Gerät ein und verbinden Sie es mit dem Durchflusszytometer.

Zeichnen Sie die Intensität der Dronpa-Fluoreszenz im GFP-Kanal auf. Das Design dieses optogenetischen Geräts umfasst eine Kammer, die an eine zirkulierende Wasserversorgung angeschlossen werden kann, um die Temperatur der Probe auf einem konstanten Wert zu halten. Während das Gerät drei verschiedene Wellenlängen emittierte, war in der FACS-Probe nur ein marginaler Temperaturanstieg zu beobachten, wenn 37 Grad Celsius heißes Wasser durch das Gerät flossen.

Das Dronpa-Linker-Dronpa-Fusionskonstrukt wurde kloniert und in Ramos-B-Zellen transduziert. Wenn sie von einer 500-Nanometer-Lichtquelle in den Monomerzustand gelenkt wird, nimmt die Emissionsintensität ab. Sobald die Lichtquelle auf das 400-Nanometer-Licht umgeschaltet ist, wird das Dronpa-Monomer schnell in den Dimerzustand überführt, und die Intensität nimmt schnell zu.

Mit dieser Vorrichtung konnte das zytosolische Dronpa-Linker-Dronpa-Fusionsprotein mehrfach photogeschaltet werden. Das Umschalten in den dunklen Zustand erfolgt langsam, während das Umschalten in den hellen Zustand fast augenblicklich erfolgt. Die spontane Fluoreszenzerholung von Dronpa im Dunkeln zeigt, dass eine effiziente Photoschaltung in die helle Form eine spezifische Beleuchtung erfordert und nur langsam spontan erfolgt.

Die kinetische Analyse zeigt, dass die Photoschaltgeschwindigkeit insgesamt sehr reproduzierbar ist und dass selbst nach einer langen Inkubation im Dunkeln nur etwa zehn Prozent der Fluoreszenz ohne Photoschalten wiederhergestellt werden. Nach diesem Verfahren kann jede durchflusszytometrische Analyse, einschließlich Kalziumflussmessungen, durchgeführt werden, um die Funktionalität des von Ihnen gewählten optogenetischen Werkzeugs zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Optogenetik den Weg ebnen, die Verdrahtung der zellulären Signalwege zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Photoswitching-Protokoll für Ihr spezifisches optogenetisches Werkzeug einrichten können. Vergessen Sie nicht, dass UV-Licht extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. eine Schutzbrille, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getragen werden sollten.