Name: LED Thermo Flow - Die Kombination mit Optogenetik Flow Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Lernen Sie die optogenetische Durchflusszytometrie zur Untersuchung von Zellsignalwegen in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung optisch kontrollierbarer Substanzen mit Ramos B-Lymphozyten.

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Wir danken J. Schmidt von der Universität Freiburg für die Konstruktion des Geräts. Wir danken P. Nielsen und D. Medgyesi für ihre Unterstützung und kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Studie wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft durch den SFB746 und durch die Exzellenzinitiative der Deutschen Forschungsgemeinschaft (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Planung und Aufbau der Vorrichtung <ol><li> Pilotversuche HINWEIS: Die erforderliche Lichtintensität für eine bestimmte optogenetische Werkzeug und Zelltyp kann erheblich variieren. Pilotversuche mit Prototypen sind nützlich, notwendig, um die minimale Lichtintensität zu schätzen. Die optogenetische Werkzeug für die folgenden Experimente verwendet wird, ist ein Dronpa-Linker-Dronpa Fusionskonstrukt. Die Dronpa Sequenz wurde im Handel erhältlich (siehe Liste der Materialien). Ein langer Linker wurde zwischen zwei Dronpa Sequenzen kloniert in das exprimierte Konstrukt zu ermöglichen intramolekulare (und intermolekular) Dimere zu bilden. Die nachfolgend beschriebenen Schritte können zu vielen anderen optogenetische Werkzeuge oder optisch kontrollierten Substanzen angepasst werden. <ol><li> Transduzieren Ramos-B-Lymphozyten mit einem Dronpa-Linker-Dronpa enthaltenden Konstrukt nach den Anweisungen des Herstellers für die Transduktion von Verpackungszellen, die retroviral-enthaltende Überstand verwendet wird. Ernte und Zählen von Zellen nach einem vorherviously veröffentlichten Protokoll 13. </li><li> Die Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 6 / ml in Medium (RPMI 1640, 10% hitzeinaktiviertem FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 U / ml Streptomycin und 50 uM 2-Mercaptoethanol) und sie auf einem Glas FACS-Röhrchen. </li><li> Legen Sie das Rohr in einem Durchflusszytometer und messen die Fluoreszenzintensität von Dronpa (GFP - Kanal) 14,15. </li><li> Schutzbrille tragen für alle weiteren Schritte von möglicherweise schädlichen Wellenlängen Augen zu schützen. </li><li> Stellen Sie manuell eine 500 nm LED-Licht auf der Außenseite des Rohres und auch weiterhin die Fluoreszenzintensität von Dronpa messen. </li><li> Erhöhen Sie die Anzahl und / oder Intensität der LED-Leuchten bis Dronpa Fluoreszenzintensität abnimmt. </li><li> Stellen Sie manuell eine 400 nm LED-Licht auf der Außenseite des Rohres und auch weiterhin die Fluoreszenzintensität von Dronpa messen. </li><li> Erhöhen Sie die Anzahl und / oder Intensität der LED-Leuchten bis zum Dronpa FluoFluoreszenz Intensität zunimmt. </li><li> Verwenden Sie mindestens so viele LED-Leuchten für den Aufbau der Vorrichtung als vorhergesagt erforderlich sein, von den Photoschalten in den Schritten 1.1.5 und 1.1.7. </li></ol></li><li> Der Aufbau des Gerätes HINWEIS: Das Gerät wird von einem professionellen Bearbeitungswerkstatt, der Arbeitsgruppe Technik der Universität Freiburg gebaut wurde. Die meisten Teile sind kundenspezifisch und nicht im Handel erhältlich. Die genauen Abmessungen der einzelnen Teile sind in den 1 und 2 dargestellt. Um die Montage dieser Vorrichtung zu verdeutlichen, wird Ergänzungs Video 1 vorgesehen ist und die wesentlichsten Schritte werden nachfolgend beschrieben. <ol><li> Mühle Stück A aus Polyvinylchlorid (PVC) mit den genauen Maßen in 1A gezeigt. </li><li> Legen Sie LED-Leuchten in die Bohrungen des Stückes A und versiegeln jedes Loch mit PVC-Kleber Wasseraustritt zu verhindern. </li><li> Schließen Sie LEDs auf einen Mehrkanal-Transformator (jede Wellenlänge sollte eine separate chann besetzenel) mit einer einstellbaren Ausgangsleistung von 0 bis 29 mA. </li><li> Bringen Sie die äußere Hülle (B) mit 3 Schrauben an einem Stück, wie dargestellt, um die LEDs vor Beschädigung zu schützen. </li><li> Um das Gerät mit einer Wasserpumpe, Leim in den Rohrschellen (C) in die Bohrungen des Stückes A (dargestellt in 1a, Querschnitt Y: 9 mm und 61,5 mm) zu verbinden mit PVC - Kleber. </li><li> Schneiden Sie ein 58,5 mm lange Plexiglasröhre (D1). </li><li> Herstellung Stücke D2 und D3 aus Plexiglas , wie in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Klebestück D3 auf den Boden des D1 mit Plexiglas Klebstoff. </li><li> Bringen Sie einen Gummi-O-Ring zu Stück D2 und kleben Sie es an die Spitze der D1 mit Plexiglas Klebstoff. HINWEIS: Die Stücke D1, D2 und D3 zusammen Stück D. bilden </li><li> Einsatzstück D in Stück A mit 3 Schrauben. </li><li> Testen Sie das Gerät für Wasserleck vor der Leistung an den Transformator anzuwenden. </li></ol></li></ol> 2. Messung der Kinetik eines optogenetische Werkzeug <ol&gt; <li> Vorbereitung der Zellen <ol><li> Kultur Ramos-B-Zellen in RPMI-Medium (RPMI 1640, 10% hitzeinaktiviertem FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 U / ml Streptomycin und 50 uM 2-Mercaptoethanol) bei einer Dichte von 3- 10 x 10 6 Zellen / ml bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ernte Ramos-B-Zellen durch Zentrifugation bei 350 xg und 4 ° C für 5 min. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung einer Neubauer - Zählkammer nach den Anweisungen des Herstellers und resuspendieren 1-5 x 10 6 Zellen in 600 &amp; mgr; l Medium. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in ein Glas FACS-Röhrchen, legte sie auf Eis und schützen sie vor Licht, bis die Messung. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Durchflusszytometer und das Gerät. <ol><li> Schließen Sie das Gerät auf eine beheizte Wasserpumpe und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. </li><li> Wenn Glas FACS-Röhrchen verwenden, tauschen Sie den schwarzen O-Ring des Durchflusszytometer mit einem Gummi-O-Ring und zusätzlich Silizium gr geltenLeichtigkeit. </li></ol></li><li> Messung <ol><li> Setzen Sie vorsichtig das Glas FACS - Röhrchen in das Gerät und verbinden Sie es mit dem Durchflusszytometer (Abbildung 3). </li><li> Starten Sie die Messung und Aufzeichnung Dronpa Fluoreszenzintensität (GFP-Kanal). </li><li> Illuminate der Zellprobe mit 400 nm oder 500 nm Licht jeweils und notieren Sie die Dronpa Fluoreszenzintensität (GFP-Kanal). </li></ol></li><li> Datenanalyse <ol><li> Analysieren experimentellen Daten mit geeigneten Durchflusszytometer Software. Plot Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung und Gate die lebenden Zellen. Zeichnen Sie die Dronpa Fluoreszenzintensität über die Zeit. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+concept+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive concept of optogenetics.</a> Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
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<li>Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+feedback+for+controlling+intracellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics.</a> Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).</li>
<li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras%2FErk+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li>
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<li>Wend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+protein+kinase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
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<li>Brakemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversibly+photoswitchable+GFP-like+protein+with+fluorescence+excitation+decoupled+from+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching.</a> Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die LED Thermo Flow ist ein innovatives Gerät optogenetische Werkzeuge in einem Durchflusszytometer zu studieren. Bisher optogenetische Proben nur 11,12 mit Mikroskopie Laser oder Taschenlampe Geräte beleuchtet worden. Je nach Winkel und Abstand der Lampe zur Probe, erhebliche Variabilität in der Menge des Beleuchtungs zwischen Experimenten erwartet. Darüber hinaus gibt es eine Grenze für die Anzahl von Taschenlampen eine einzelne Person in einem Experiment arbeiten kann. Dies sch...

Optogenetische Werkzeuge wurden an Popularität gewinnt, zum Teil , weil sie verwendet werden können , die Verdrahtung von Signal 1-4 Wege zu entziffern. Sie basieren auf der Fähigkeit von photoaktivierbaren Proteine ​​anhand ihrer Konformation und Bindungsaffinität zu ändern, wenn sie mit Licht bestrahlt. Fusing diese Proteine Signalelemente ermöglicht die spezielle Regelung eines einzelnen Spielers in komplexen intrazellulären Signalwege 5-12. Folglich kann ein Signalweg mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung untersucht werden. Die meisten zellbasierten optogenetische Studien verwenden Mikroskopie-basierten Methoden mit Kultivierungs kombiniert in Gegenwart von Licht, 11,12 durch biochemische Analyse verfolgt. Im Gegensatz dazu Zytometer ein Fluss singularizes Zellen entlang einer Kapillare und misst Zellgröße, Granularität und Fluoreszenzintensitäten. Dieses Verfahren hat wesentliche Vorteile gegenüber der Mikroskopie oder biochemische Methoden, einschließlich der Fähigkeit zu analysieren thousands von Zellen bei Single-Cell-Auflösung in einer sehr kurzen Zeit zu leben. Daher ist es wünschenswert Optogenetik mit Durchflusszytometrie zu kombinieren. Unseres Wissens gibt es kein anerkanntes Protokoll für optogenetische Durchflusszytometrie. Ein breit akzeptiertes Verfahren ist die manuelle Zellen von außerhalb des Reaktionsrohres mit Taschenlampe Geräte beleuchten. Allerdings erfordert eine manuelle Beleuchtung im Durchflusszytometer das Licht durch das Reaktionsrohr zu passieren, und für Live Cell Imaging, eine zylindrische, beheizte Wasserkammer. Dies führt zu einer wesentlichen Lichtstreuung und Lichtverlust. Außerdem ist die Lichtintensität durch manuelle Beleuchtung vorgesehen nicht reproduzierbar zwischen den Experimenten (Winkel, Abstand, etc.) und es gibt eine praktische Grenze für die Anzahl von Wellenlängen in einem Experiment. die LED-Thermo Flow-Gerät Durch die Konstruktion, wir waren in der Lage, diese Einschränkungen zu überwinden. Mit diesem Gerät können die Zellen mit spezifischen Wellenlängen in einem temporären beleuchtbareratur gesteuert während der Messungen durchflusszytometrischen. Dies ermöglicht eine präzise und reproduzierbare Lichtmengen innerhalb und zwischen den Experimenten. Um die Nützlichkeit unseres Gerätes in vivo zeigen, nahmen wir das Fluoreszenzsignal von Dronpa in Ramos B - Zellen während der Photoschalten . Ramos-B-Zellen von einem humanen Burkitt-Lymphom abgeleitet. Dronpa ein fluoreszierendes Protein, das als ein Monomer, Dimer oder Tetramer vorliegt. In seiner monomeren Form ist es nicht fluoreszierend. Beleuchtung mit 400 nm-Licht induziert die Dimerisierung und Tetramerisierung und macht das Dronpa Protein fluoreszierend. Dieser Prozess kann durch Beleuchtung mit Licht von 500 nm umgekehrt werden. Das Dronpa Protein verwendet worden ist, die Funktion und Position zu steuern Signalproteinen 4,13. Hier ausgedrückt wir eine Dronpa-Linker-Dronpa Protein in Ramos-B-Zellen Photoschaltbarkeit von Dronpa in einem Durchflusszytometer zu studieren. Mit unserem Gerät waren wir in der Lage, effizient undreproduzierbar Photoschalter Dronpa während in Echtzeit die Aufnahme seiner Fluoreszenzintensität. Dieses Verfahren bietet wesentliche Vorteile gegenüber aktuellen Beleuchtungs Protokolle mit manueller Beleuchtung und erweitert signifikant das experimentelle Repertoire für optogenetische Werkzeuge und Käfigverbindungen. Mit unserem Gerät die Entdeckung und Entwicklung von neuartigen optogenetische Werkzeuge erheblich vereinfachen und beschleunigen.

<table><tbody><tr><td>Glas-FACS-Rohr</td><td>Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA</td><td>14-961-26</td><td>Borosilikatglasrohre 12x75 mm</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Bioscienceg; Heidelberg, Deutschland</td><td>Fortessa II</td><td>Special Order</td></tr><tr><td>Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N Addgen</td><td>; Cambridge, USA</td><td>41645</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen, Rockville, USA</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>LED 505 nm</td><td>Avago Technologies; Böblingen, Deutschland</td><td>HLMP-CE34-Y1CDD</td><td></td></tr><tr><td>LED 400 nm</td><td>Avago Technologies; Böblingen, Deutschland</td><td>UV5TZ-400-15</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglasrohr 15 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Deutschland</td><td>76999</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 3 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Deutschland</td><td>692230</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 2,5 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Deutschland</td><td>692225</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglas 1,5 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Deutschland</td><td>692215 PVC-Fliese</td><td></td></tr><tr><td>5 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Deutschland</td><td>690020.005</td><td></td></tr><tr><td>PVC-Fliesen 6 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Deutschland</td><td>690020.006</td><td></td></tr><tr><td>PVC-Block 50 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Deutschland</td><td>690020.050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Deutschland</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>EMD; Deutschland</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech; Aidenbach, Deutschland</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Strptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Deutschland</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acrifix Plexiglaskleber</td><td>Evonic industries, Essen, Deutschland</td><td>1R0192</td><td></td></tr><tr><td>Tangit PVC-U Kleber</td><td>Henkel, D&uuml; Düsseldorf, Deutschland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

led thermo flow - die kombination mit optogenetik flow cytometry

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetische Werkzeuge ermöglichen isolierte, funktionelle Untersuchungen fast aller Signalmoleküle innerhalb komplexer Signalwege. Ein großes Hindernis ist die kontrollierte Abgabe von Licht an die Zellprobe, weshalb die beliebtesten Werkzeuge für optogenetische Studien mikroskopiebasierte Zellanalysen und In-vitro-Experimente sind. Das Durchflusszytometer hat gegenüber einem Mikroskop große Vorteile, einschließlich der Möglichkeit, Tausende von Zellen schnell mit einer Einzelzellauflösung zu messen. In der Optogenetik ist es jedoch noch nicht weit verbreitet. Hier stellen wir ein Gerät vor, das die Leistungsfähigkeit von Optogenetik und Durchflusszytometrie vereint: den LED Thermo Flow. Dieses Gerät beleuchtet Zellen bei bestimmten Wellenlängen, Lichtintensitäten und Temperaturen während durchflusszytometrischer Messungen. Es kann kostengünstig gebaut und mit den meisten gängigen Durchflusszytometern verwendet werden. Um ihren Nutzen zu demonstrieren, haben wir die Photoswitching-Kinetik von Dronpa-Proteinen in vivo und in Echtzeit charakterisiert. Dieses Protokoll kann an nahezu alle optisch kontrollierten Substanzen angepasst werden und erweitert die Anzahl der möglichen Versuche erheblich. Noch wichtiger ist, dass es die Entdeckung und Entwicklung neuer optogenetischer Werkzeuge erheblich vereinfachen wird.

Mit der LED-Thermo Fluss mit einem Durchflusszytometer Die funktionelle Kern der Vorrichtung ist eine zylindrische Kammer, in der LED-Leuchten in einer kreisförmigen Weise angeordnet sind nach innen gerichtet. Diese Kammer kann mit einer Wasserversorgung und der Pumpe verbunden sein, der zur Steuerung der Temperatur der LEDs sowie der Zellprobe ermöglicht. Die LEDs sind an einen Transformator angeschlossen ist und somit die Lich...

Optisch kontrollierte Substanzen sind mächtige Werkzeuge, um Signalwege zu untersuchen. Um das Spektrum der möglichen Experimente zu erweitern, haben wir ein Gerät entwickelt, mit dem sich optisch gesteuerte Substanzen in Echtzeit mittels Durchflusszytometrie untersuchen lassen: die LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Die Kombination mit Optogenetik Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, optisch kontrollierte Substanzen während durchflusszytometrischer Messungen zu stimulieren. Dieses neuartige Gerät kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Zellsignalisierung zu beantworten, indem es die Leistungsfähigkeit optisch kontrollierter Substanzen mit der Durchflusszytometrie kombiniert. Zum ersten Mal können optogenetische Werkzeuge mittels Durchflusszytometrie charakterisiert und analysiert werden.Bis heute gab es keine vergleichbare etablierte Methode. Zu Beginn suspendieren Sie transduzierte Ramos-B-Lymphozyten in einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter und übertragen Sie sie in ein FACS-Glasröhrchen. Tauschen Sie anschließend den schwarzen O-Ring des Durchflusszytometers gegen einen Gummi-O-Ring aus und tragen Sie Silikonfett auf, um eine bessere Abdichtung zu erzielen.Setzen Sie das Glasröhrchen in ein Durchflusszytometer ein und platzieren Sie den LED-Prototyp bei ausgeschaltetem Licht um das Röhrchen. Messen Sie die Fluoreszenzintensität von Dronpa im GFP-Kanal. Der kritischste Schritt des Verfahrens ist die Handhabung der Glasröhren.Glas-FACS-Röhrchen sind sehr zerbrechlich, daher wird empfohlen, das Einführen der Glasröhrchen in das Zytometer vor der Durchführung von Experimenten zu üben. Schalten Sie dann das 500-Nanometer-LED-Licht an der Außenseite der Röhre ein und fahren Sie mit der Messung der Fluoreszenzintensität von Dronpa fort. Erhöhen Sie die Intensität der LED-Leuchten, bis die Dronpa-Fluoreszenzintensität abnimmt, um die minimale Lichtintensität abzuschätzen, die erforderlich ist, um das Photoschalten des Dronpa-Linker-Dronpa-Proteins zu messen.Schalten Sie dann das 400-Nanometer-LED-Licht des Prototyps an der Außenseite der Röhre ein und fahren Sie mit der Messung der Fluoreszenzintensität von Dronpa fort. Erhöhen Sie die Lichtintensität der 400-Nanometer-LED-Leuchten, bis die Fluoreszenzintensität von Dronpa zunimmt. Befolgen Sie zunächst die Design- und Herstellungsanweisungen im begleitenden Textprotokoll, um die inneren und äußeren Schichten des fotoschaltenden LED-Geräts herzustellen.Setzen Sie die LEDs mit einer Wellenlänge von 400 und 500 Nanometern in die Kanäle des Geräts ein. Kleben Sie sie fest und verdrahten Sie sie wie angegeben. Diese spezifischen Wellenlängen werden verwendet, um die Dronpa-Linker-Dronpa-Fusionsproteine zwischen ihrem dunklen und hellen Zustand zu schalten.Montieren Sie dann das Gerät und stellen Sie sicher, dass es wasserdicht ist, um Leckagen zu vermeiden, bevor Sie den Transformator einschalten. Nach dem Zusammenbau des Geräts werden Ramos-B-Lymphozyten entnommen und in einer Dichte von drei bis zehn Millionen Zellen pro Milliliter suspendiert. Übertragen Sie 600 Mikroliter der Zellen in ein FACS-Glasröhrchen.Legen Sie sie auf Eis und schützen Sie die Zellen vor Licht, bis sie vermessen werden. Schließen Sie das zusammengebaute Gerät an eine beheizte Wasserpumpe an und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Führen Sie dann das Glas-FACS-Rohr vorsichtig in das Gerät ein und verbinden Sie es mit dem Durchflusszytometer.Zeichnen Sie die Intensität der Dronpa-Fluoreszenz im GFP-Kanal auf. Das Design dieses optogenetischen Geräts umfasst eine Kammer, die an eine zirkulierende Wasserversorgung angeschlossen werden kann, um die Temperatur der Probe auf einem konstanten Wert zu halten. Während das Gerät drei verschiedene Wellenlängen emittierte, war in der FACS-Probe nur ein marginaler Temperaturanstieg zu beobachten, wenn 37 Grad Celsius heißes Wasser durch das Gerät flossen.Das Dronpa-Linker-Dronpa-Fusionskonstrukt wurde kloniert und in Ramos-B-Zellen transduziert. Wenn sie von einer 500-Nanometer-Lichtquelle in den Monomerzustand gelenkt wird, nimmt die Emissionsintensität ab. Sobald die Lichtquelle auf das 400-Nanometer-Licht umgeschaltet ist, wird das Dronpa-Monomer schnell in den Dimerzustand überführt, und die Intensität nimmt schnell zu.Mit dieser Vorrichtung konnte das zytosolische Dronpa-Linker-Dronpa-Fusionsprotein mehrfach photogeschaltet werden. Das Umschalten in den dunklen Zustand erfolgt langsam, während das Umschalten in den hellen Zustand fast augenblicklich erfolgt. Die spontane Fluoreszenzerholung von Dronpa im Dunkeln zeigt, dass eine effiziente Photoschaltung in die helle Form eine spezifische Beleuchtung erfordert und nur langsam spontan erfolgt.Die kinetische Analyse zeigt, dass die Photoschaltgeschwindigkeit insgesamt sehr reproduzierbar ist und dass selbst nach einer langen Inkubation im Dunkeln nur etwa zehn Prozent der Fluoreszenz ohne Photoschalten wiederhergestellt werden. Nach diesem Verfahren kann jede durchflusszytometrische Analyse, einschließlich Kalziumflussmessungen, durchgeführt werden, um die Funktionalität des von Ihnen gewählten optogenetischen Werkzeugs zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Optogenetik den Weg ebnen, die Verdrahtung der zellulären Signalwege zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Photoswitching-Protokoll für Ihr spezifisches optogenetisches Werkzeug einrichten können. Vergessen Sie nicht, dass UV-Licht extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. eine Schutzbrille, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getragen werden sollten.

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Biologie

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Durchflusszytometrischer Assay zur Quantifizierung von oxidativem Stress: Ein Assay zur Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies in Darmorganoiden mit fluorogenen Sonden

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Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines asymmetrischen Detektions-Zeitstreck-Optikmikroskopiesystems für die Einzelzell-Bildgebung in ultraschnellen mikrofluidischen Strömung und seine Anwendungen bei der Bildgebungsdurchflusszytometrie.

Mikrofluidische Imaging-Durchflusszytometrie durch asymmetrische Detektion Zeitstreck-Optische Mikroskopie (ATOM)

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu analysieren von Zelle zu Zelle Übertragung der oszillierenden Informationen durch optogenetische Kontrolle und Überwachung der Genexpression zu leben. Dieser Ansatz bietet eine einzigartige Plattform, um eine funktionale Bedeutung der dynamischen Ausdruck Genprogramme in mehrzelligen Systeme zu testen.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Diese Arbeit beschreibt eine Methode für Hochdurchsatz-Experimente mit einem 3D-gedruckten LED-Array, um die lichtinduzierbare Genexpression in HEK293T Zellen zu optimieren.

Schnelle Optimierung eines lichtinduzierbaren Systems zur Kontrolle der Genexpression von Säugetieren

Lernen Sie die optogenetische Durchflusszytometrie zur Untersuchung von Zellsignalwegen in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung optisch kontrollierbarer Substanzen mit Ramos B-Lymphozyten.

LED Thermo Flow - Die Kombination mit Optogenetik Flow Cytometry

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