Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses genetischen Modifikationsverfahrens der Maus ist es, IL-22-produzierende Immunzellen zu identifizieren, zu reinigen und zu charakterisieren. Zellen des Immunsystems setzen Mediatoren, sogenannte Zytokine, frei, die dafür verantwortlich sind, uns gegen Fremdstoffe wie Bakterien zu verteidigen und geschädigtes Gewebe wiederherzustellen. IL-22 ist ein solches Zytokin und es werden viele Aktivitäten zugeschrieben, die von der Gewebereparatur bis zur Pathologie reichen.

Und es wurde berichtet, dass eine Reihe verschiedener Zelltypen des Immunsystems in der Lage sind, es zu produzieren. Um zu klären, welche Zellen tatsächlich IL-22 produzieren, haben wir eine neue IL-22-Reportermaus entwickelt. Dies ermöglichte es uns, relevante IL-22-Produzenten in vivo in Mäusen unter normalen Bedingungen und in einem Modell für entzündliche Darmerkrankungen zu identifizieren.

Wir verwendeten auch Reporterzellen, um IL-22-Expressoren aufzureinigen, um ihre anderen Eigenschaften zu bestimmen. Das Verfahren zur Erzeugung von Reportermäusen wird kurz skizziert und die Methoden der Analyse werden beschrieben. Die beschriebenen Verfahren können auf andere Gene angewendet werden, um die Exprimoren zu identifizieren und lebensfähige exprimierende Zellen für eine weitere Charakterisierung zu reinigen.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie über die biologischen Aktivitäten von IL-22 und die Eigenschaften der Zellen, die es produzieren, zu beantworten. Julie Hixon, eine Biologin, Caroline Andrews, eine Postdoktorandin, und Wenqing Li, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin, alle aus Dr. Durhams Labor, werden das Verfahren mit mir demonstrieren. Nach dem Einfügen des tdTomato-Reportergens in einen Shuttle-Vektor und dem Ersetzen des GFP-Gens an derselben Stelle verwenden Sie das entsprechende bakterielle künstliche Chromosom oder BAC-Template, um die A- und B-Homologieboxen auf das erste translatierte Exon von IL-22 in einem 50-Mikroliter-PCR-Reaktionssystem zu amplifizieren.

Verwandeln Sie dann die gereinigten Vektoren in BAC-kompetente Bakterienzellen auf Luria-Bertani- oder LB-Agarplatten, die Chloramphenicol und Ampicillin bei 37 Grad Celsius enthalten. Am Ende der Inkubation beimpfen Sie zwei bis drei Kolonien in einem Milliliter LB-Brühe, ergänzt mit Chloramphenicol bei 37 Grad Celsius und 225 U/min. Nach einer Stunde werden 100 Mikroliter jeder Mischung auf eine LB-Agarplatte verteilt, die mit Chloramphenicol und Saccharose für eine Übernachtkultur bei 37 Grad Celsius ergänzt wird.

Am nächsten Morgen werden die großen Kolonien wieder auf eine neue LB-Agarplatte mit Chloramphenicol und die kleinen Kolonien auf eine andere LB-Agarplatte aufgefüllt und die Platten 30 Sekunden lang UV-Licht ausgesetzt. Wählen Sie dann eine UV-empfindliche Kolonie aus und verwenden Sie einen heterozygoten tdTomato IL-22-Primer, um das Vorhandensein der modifizierten BAC-DNA durch PCR zu bestätigen. Nach der Entfernung von Milz und Thymus verwenden Sie eine feine gezackte Dissektionszange, um die perlweißen mesenterialen Lymphknoten nahe der Dünndarmwand zu entnehmen.

Entfernen Sie als Nächstes den gesamten Dünndarm und den Dickdarm und extrahieren Sie mit einer Schere die ausgedehnten ovalen Peyer-Flecken entlang des Darms. Wenn das gesamte Lymphgewebe gesammelt wurde, schleifen Sie die mesenterialen Lymphknoten und Peyer-Pflaster zwischen zwei gefrorenen Objektträgern in PBS zusammen, ergänzt mit FBS auf Eis. Nach der Erzeugung einzelner Milz- und Thymus-Einzelzellsuspensionen auf die gleiche Weise zentrifugierten die Milzzellen nach einer Milzlyse der roten Blutkörperchen mit einem Milliliter ACK Lysing Buffers Milz.

Stellen Sie nach einer Minute die Isotonie mit neun Millilitern PBS wieder her und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern PBS und filtrieren Sie die Zellen durch ein 100-Mikron-Zellsieb. Sammeln Sie dann die Zellen durch eine weitere Zentrifugation, wobei das Pellet in fünf Millilitern RPI-Medium resuspendiert wird, um es durch Trypanblau-Ausschluss zu zählen.

Nach der Entnahme des Dünndarms vom Zwölffingerdarm zum Ileum zusammen mit dem gesamten Dickdarm verwenden Sie eine Pinzette, um das überschüssige Fett- und Mesenterialgewebe aus dem Darm zu entfernen, und legen Sie das Darmgewebe sofort in eiskaltes PBS. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Peyer-Flecken entlang der distalen Region des Dünndarms zu entnehmen. Öffnen Sie dann mit einer Schere den Darm der Länge nach und spülen Sie das Gewebe gründlich mit 10 Milliliter eiskaltem PBS aus.

Übertragen Sie die Probe in 20 Milliliter Vorverdauungspuffer für zwei 30-minütige Inkubationen bei 37 Grad Celsius und 50 U/min in einen Schüttler, wirbeln Sie das Gewebe 30 Sekunden lang bei 12.000 U/min und drücken Sie alle Fragmente am Ende jeder Inkubation durch ein 100-Mikron-Zellsieb, um die Epithelzellschicht zu sammeln. Geben Sie anschließend 20 Milliliter frische EDTA-Lösung in die Zellaufschlämmung für eine weitere 30-minütige Inkubation unter Schütteln bei 37 Grad Celsius, filtrieren und kühlen Sie die Darmepithelzellen am Ende der Inkubation, wie gerade gezeigt. Legen Sie die restlichen Darmfragmente auf Eis und sammeln Sie die gepoolten Darmepithelzellen durch Zentrifugation, gefolgt von einer Wäsche in 10 Millilitern HBSS, ergänzt mit FBS.

Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in acht Millilitern 44 % kolloidalem Kieselsäuremedium und überlagern Sie die Zellsuspension mit fünf Millilitern 67 % kolloidalem Kieselsäuremedium. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um die oberen fünf Milliliter des Zelltrennmediums zu entfernen. Sammeln Sie dann die Zellen an der Grenzfläche und waschen Sie die Darmepithelzellen in 10 Millilitern RPMI-Medium, wobei Sie das Pellet in fünf Millilitern frischem RPMI resuspendieren.

Nach der Herstellung von einzelnen Milzzellsuspensionen von IL-22 td-Tomato-Mäusen, wie gerade gezeigt. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von eins mal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter in sterilem PBS und verwenden Sie die Methode der negativen Isolierung von CD4-Zellen der Maus, um die CD4-positiven T-Zellen zu reinigen. Als nächstes markieren Sie die T-Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit Anti-CD4- und Anti-CD45RB-Antikörpern.

Am Ende der Inkubation werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, gefolgt von einer Wäsche in zwei Millilitern PBS, das mit FBS ergänzt wird. Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in einem Milliliter frischem PBS und FBS und sortieren Sie die markierten T-Zellen mittels Durchflusszytometrie nach ihrer CD4- und CD45RB-Koexpression. Wenn alle Zellen sortiert sind, sammeln Sie sie durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einer Konzentration von einmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in sterilem PBS zur Injektion der Zellen in RAG1-Knockout-Mausempfänger

Um das murine IL-22-Reportertransgen zu erzeugen, wurde die Rekombinierung verwendet, um ein bakterielles künstliches Chromosom zu modifizieren, das die IL-22-Heuschrecke trägt und auch einen positiven Selektionsmarker und ein Chloramphenicol-Antibiotikaresistenzgen enthält. Nach der Einführung von tdTomato in exon1 wurde die Signalpeptidsequenz gestört, wodurch der tdTomato-Reporter in den IL-22-exprimierenden Zellen gefangen wurde und deren Nachweis und Isolierung durch Durchflusszytometrie ermöglicht wurde. Um die Genauigkeit der IL-22-Reporter zu testen, können in vitro erzeugte Splenozyten unter Th22 oder neutralen Bedingungen kultiviert werden, wobei die IL-22 tdTomato-Expression sowohl durch Durchflusszytometrie als auch durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar wird.

In vivo wurden die IL-22-Reporter in verschiedenen Mausgeweben unter homöostatischen Bedingungen nachgewiesen, wobei der größte Teil des Signals in den Zellen der Lamina propria aus dem Darm beobachtet wurde, nicht jedoch im axillären Lymphknoten, in der Milz oder im Thymus. In einem Maus-Colitis-Modell, das durch den Transfer von Reporter-CD4-positiven CD45RB-High-T-Zellen in RAG1-Knockout-Mäuse induziert wurde, wurden die tdTomato-Reporter zunächst in den mesenterialen Lymphknoten sichtbar gemacht, ihre eventuelle Akkumulation jedoch in den Lamina propria des distalen Dünndarms und des Dickdarmgewebes. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den richtigen BAC-Klon auszuwählen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie die Etablierung von Lungen- oder Hautinfektionsmodellen, mit dieser Reportermaus durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Rolle von IL-22 bei der Wirtsabwehr und Gewebereparatur zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Funktion von sezernierten Proteinen, die eine geringe Expression aufweisen, mit einem Mausmodell wie diesem zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine transgene Reportermaus erzeugt und IL-22-Reportergene in vitro und in vivo identifiziert.