Name: Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie IL-22-produzierende Immunzellen in transgenen Reporter-Mäusen visualisieren und charakterisieren. Diese Methode ermöglicht die In-vivo-Verfolgung von Zytokinen in Geweben.

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Wir danken Kelli Czarra und Megan Karwan für die technische Unterstützung der Tiere, Kathleen Noer und Roberta Matthai für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und Donna Butcher und Miriam R. Anver für die pathologische Analyse. Dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss der Ely and Edythe Broad Foundation (an Scott Durum) unterstützt und wurde ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, unter der Vertragsnummer finanziert. HHSN261200800001E (MRA).

Alle Tiere erhielten die richtige Pflege in Übereinstimmung mit den im Guide 2011 skizzierten experimentellen Verfahren zur Pflege und Verwendung von Labortieren Komitee Frederick National Laboratory for Cancer Research. 1. Erzeugung von IL-22-tdTomato Reporter Mäusen durch BAC Recombineering HINWEIS: Die Mäuse sollten bewusstlos sein und nicht als Reaktion auf einen schädlichen Reiz bewegen. Sterilisieren Sie den OP-Bereich mit 70% Ethanol und zu sterilisieren alle chirurgischen Werkzeuge, um eine Glasperle Sterilisator verwenden. <ol><li> Reinige BAC - DNA (RP23-401E11, clone Länge 228.391 bps) unter Verwendung eines alkalischen Extraktionsverfahren 10, 11. Charakterisieren Sie den BAC-Klon durch SpeI Verdauung von 5 ug RP23-401E11 die korrekte Größe des Zielgens zu bestätigen. HINWEIS: Die BAC DNA wurde in 14 Fragmente gespalten. </li><li> Legen Sie die tdTomato Reporter-Gen in die Not I / Sal I-Stelle des PLD53SC-A-GFP-B-Shuttle-Vektor11 und das GFP - Gen in der gleichen Stelle ersetzen. Dann als Matrize BAC RP23-401E11, verstärken die Homologie - Boxen (A und B) zu dem ersten übersetzten Exon von Il-22 (Exon 1) durch PCR (95 ° C 2 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 30 sec, und eine abschließende Extension bei 72 ° C für 10 min). In einem 50 &amp; mgr; l PCR - Reaktionssystem, werden 50 ng (1 &amp; mgr; l) von BAC - DNA, 0,5 ul Primer (10 uM), 40 ul PCR Supermix high fidelity und 8 &amp; mgr; l H 2 O. HINWEIS: Die Primer für die A- und B - Boxen sind wie folgt: Ein Feld Forward: 5 &#39;T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG und Reverse: 5&#39; CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; B - Box vorwärts: 5&#39; - G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA und Reverse: 5 &#39;T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Die Standorte der Restriktionsenzyme (Asc I und Pac I) sind unterstrichen. </li><li> Ligieren 500 ng Asc I-verdaute A und 500 ng von Pac I-verdaute B fragments in 50 ng PLD53SC-ATB (tdTomato) Vektor bei 16 ° C für 1 Stunde. </li><li> Transformieren des gereinigten PLD53SC-ATB Vektors in BAC-kompetente Zellen 11 und Kultur sie auf Luria-Bertani (LB) Agarplatten mit Chloramphenicol (20 ug / ml) und Ampicillin (30 ug / ml) bei 37 ° C. Wählen Sie zwei vor drei Kolonien von Co-Integration von den Ch / Amp Master-Platten. </li><li> Beimpfen jede Kolonie in 1 ml LB, ergänzt mit 20 ug / ml Chloramphenicol und inkubiert sie für 1 h bei 37 ° C und 225 rpm. Verbreiten 100 ul jeder Mischung auf einem LB-Agarplatte (10 g Pepton 140, 5 g Hefeextrakt, 12 g Agar und 1 l Wasser, pH 7,5), ergänzt mit Chloramphenicol und 4-4,5% Saccharose. Inkubieren der Kultur über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Wählen Sie große und kleine Kolonien und Ausstrich sie auf zwei LB-Agar-Platten mit Chloramphenicol. Dann setzen die Platten entweder mit oder ohne UV-Licht für 30 Sekunden und wählen Sie die UV-empfindlichen Kolonien zur weiteren Analyse. </li><li> Identifizieren Sie die modifizierten BAC-DNA durch PCR unter Verwendung tdTomato / IL-22 heterozygot Primer (Forward: 5 &#39;ACT TGT GCG ATC TCT GAT ggT; Reverse: 5&#39; TGT AAT Cgg ggA TGT Cgg C). Die Thermocycler-Bedingungen sind wie folgt: 95 ° C für 2 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 56 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 30 sec; und eine abschließende Extension bei 72 ° C für 10 min. </li><li> Bestätigen die Sequenz des modifizierten Bereich des BAC durch direkte Sequenzierung BAC groß prep BAC DNA 12. </li><li> Anästhesieren einen Empfänger-Maus mit einer Dosis von 0,25% Tribromethanol in die Bauchhöhle bei der mikroinjizierten Zygoten in pseudo-schwangeren C57BL / 6c Mäuse implantiert. </li><li> Linearisieren der IL-22-tdTomato BAC (10 &amp; mgr; g) durch Verdau mit 5 ul Restriktions endonucleasePi-SceI in 100 &amp; mgr; l des Reaktionssystems zu konstruieren und die linearisierte BAC DNA in befruchtete Eier von C57BL / 6 - Weibchen im Vorkernstadium 13 microinject. Screen den transgenen Mäusen durch Southern-Blot-Analyse von DNA aus Schwanzbiopsien unter Verwendung von Standardverfahren isoliert. </li></ol> 2. Single-Zell-Herstellung aus Milzen, Thymus, Lymphknoten und Peyer-Patch- HINWEIS: IL-22-tdTomato Reporter-Mäuse am National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD) gehalten wurden. Die Euthanasie-Verfahren entspricht den neuesten AVMA Richtlinien zur Euthanasie. Alle Mäuse wurden unter Verwendung von CO 2 Inhalation 14 euthanasiert. <ol><li> Euthanize eine IL-22-tdTomato Maus in einem CO 2 Kammer und legte es auf eine saubere Unterlage. Sterilisieren Sie den Bauch Haut um 70% Alkohol besprühen und schneiden Sie es auf. Entfernen Sie die Milz in der linken Flanke und den Thymus hinter dem Brustbein. </li><li> Um die mesentericlymph Knoten ernten (im mesenterialen Gewebe befindet) und Peyer-Plaques (kleine lymphoidnodules im gesamten Ileum Bereich des Dünndarms), nehmen Sie die Perlweiß mesenteric Knoten der Nähe ter Wand des Dünndarms Zange mit ersten feinen Punkt geriffelten Spitzen mit sezieren und entfernen Sie den gesamten Dünndarm und Dickdarm aus dem Körper heraus. Finden Sie die erweiterte ovale Patches (Peyer-Plaques) entlang des Darms und schneiden Sie sie mit einer Schere. Grind diese Lymphgewebe (Lymphknoten und Peyer-Plaques), die einzeln zwischen zwei mattierten Folien in eine Einzelzellsuspension in PBS / 1% fötalem Rinderserum (FBS) Puffer auf Eis. </li><li> Zerhacken der Milz oder Thymus-Gewebe unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Schritt 2.2. Zentrifugieren Sie die Milz- Suspension für 8 min bei 500 × g und 4 ° C. 1 ml ACK Lysepuffer pro Milz an die Zellpellets. </li><li> Gut mischen und lassen Sie sie für 1 min stehen. Hinzufügen 9 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Puffer zu jeder Probe. Zentrifugieren durch Zentrifugation für 8 min bei 500 xg und 4 ° C, um die roten Blutkörperchen zu entfernen. HINWEIS: Verwenden Sie keine ACK Lysepuffer in den Thymus-Zellen hinzuzufügen. </li><li> Resuspendieren der resultierenden Leukocyten in 5 ml PBS und pass die Zellen durch ein 100 &amp; mgr; m Zelle Sieb. Sammle die Zellpellets durch Zentrifugation bei 500 × g für 8 min. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 5 ml RPMI-Medium oder FACS-Puffer und zählt die lebensfähigen Zellen 0,4% Trypanblau-Farbstoff / PBS-Lösung. </li></ol> 3. Isolierung von intraepitheliale Lymphozyten und Lamina propria Zellen aus den Därmen <ol><li> Öffnen Sie die Bauchhaut, wie in Schritt 2.1, schneiden Sie den Dünndarm, von Duodenum (neben dem Magen) zu Ileum (in der Nähe der Anlage) und das gesamte Kolon, direkt über dem Anus. Entfernen Sie die zusätzlichen Fett- und mesenterialen Gewebe mit einer Pinzette. Setzen Sie den Darm sofort in eiskaltem PBS. </li><li> Geben Sie für Peyer-Plaques (kleine, raue Knoten) entlang dem distalen Bereich des Dünndarms. Entfernen Sie die Massen mit einer Pinzette andopen den Darm der Länge nach einer Schere. Gründlich spülen Darm mit 10 ml eiskaltem PBS. </li><li> Inkubieren des Gewebes in 20 ml vorgeVerdauungsPuffer (5 mM EDTAund 1 mM Dithiothreitol in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)) für 30 min bei 37 ° C unter langsamer Rotation (50 rpm) in einem Schüttler. Nach jedem von 2 Inkubationen, entfernen Sie die epithelialen Zellschicht, die intraepitheliale Lymphozyten (IELs), durch intensive Verwirbelung (30 sec bei 12.000 Umdrehungen pro Minute) und übergeben alle Gewebe durch ein 100 &amp; mgr; m Zelle Sieb enthält. </li><li> 20 ml neuer EDTA-Lösung auf das Gewebe für die zweite Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Führen Sie die IEL Fraktionen durch ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb und sie gemeinsam mit den bisherigen Fraktionen. Halten Sie die verbleibenden Darm-Fragmente auf Eis werden in Schritt 3.9 behandelt. </li><li> Zentrifugiere die gepoolten Fraktionen IEL bei 800 xg für 5 min bei 4 ° C. Waschen der vereinigten IEL Fraktionen mit 10 ml HBSS / 5% FBS und Spin sie bei 800 xg für 5 min nach unten und 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 8 ml 44% kolloidales Siliciumdioxid Medium 15 und überlagern sie mit 5 ml 67% kolloidales Siliciumdioxid Medium. Zentrifugieren Sie die 44% / 670,5% Zellgemisch Gradienten für 20 min bei Raumtemperatur und 1500 x g. </li><li> Sammeln Sie die IEL-Zellen aus dem Band an der Schnittstelle. Entfernen Sie zuerst die oberste Schicht des Überstandes (ca. 5 ml) unter Verwendung von 1 ml Pipette. Dann Ernte IELs an der Phasen des kolloidalen Silica mit mittlerer Steigung. </li><li> Waschen Sie die IELs von 10 ml RPMI-Medium hinzugefügt wird. Drehen Sie die Zellen nach unten für 5 Minuten bei 800 × g und 4 ° C. Resuspendieren der IELs in 5 ml RPMI für Schritt 3.15. </li><li> Zur Isolierung der Lamina propria-Lymphozyten (LPLs), Hackfleisch Darm Gewebefragmente aus Schritt 3.4 in kleine Stücke Schere (1 mm) und zu verdauen, die Stücke mit 10 ml Aufschlusspuffer (0,05 g Kollagenase, 0,05 g DNaseI verwenden, und 0,3 g Dispase II in RPMI / 5% FBS) für 15-20 min bei 37 ° C. </li><li> Filtern des Gemisches durch eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb. Die Durchflussüberstand enthält das frei LPL. </li><li> verdauen Voll Darm-Fragmente durch Schritte 3,9-3,10 Wiederholung (in der Regel müssen sie sein3-mal wiederholt). Jedes Mal, bündeln die Überstände der LPLs enthält. </li><li> Sammle die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 xg und Raumtemperatur und Resuspendieren der Pellets in RPMI / 5% FBS. Übergeben sie durch ein 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb. </li><li> Resuspendieren der Zellpellets in 10 ml der 40% Anteil an einem 40:80 kolloidalen mittlerer Steigung Kieselsäure und überziehe sie auf 5 ml der 80% Fraktion in einem 15-ml-Tube. </li><li> Führen des Dichtegradienten Trennung durch Zentrifugation für 20 min bei 1500 xg und Raumtemperatur 15. </li><li> Sammeln Sie die LPLs, wie in Schritt 3.7 beschrieben. Wasche sie einmal mit 10 ml PBS und Resuspendieren der Pellets in 1 ml PBS / 1% FBS RPMI Medium oder Puffer. </li><li> Zählen Sie die lebenden Zellen (beide IELs und LPLs) unter Verwendung von 0,4% Trypanblaufarbstoff / PBS-Lösung. </li></ol> 4. Expression von IL-22-tdTomato in Kolitis <ol><li> Bereiten einzelnen Milzzellsuspensionen von IL-22-tdTomato Mäusen bei einer Konzentration von 1 x 10 &lt;sup&gt; 7 Zellen / ml in sterilem PBS, wie 2,1-2,4 in Schritten beschrieben. </li><li> Reinige die CD4 + T - Zellen der Maus CD4 - Zell Negative Isolation Methode unter Verwendung von 10. Etikettieren sie mit anti-CD4-APC (Klon RM4-5, 0,5 &amp; mgr; l / 1 x 10 6 Zellen in PBS / 1% FBS - Puffer) und anti-CD45RB-FITC (Klon 16A, 0,5 &amp; mgr; l / 1 x 10 6 Zellen in PBS FBS Puffer / 1%) durch Inkubation bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Drehen Sie die Zellen nach unten für 5 Minuten bei 500 × g und 4 ° C. Waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS / 1% FBS-Puffer und Resuspension sie in 1 ml PBS / 1% FBS Färbepuffer. </li><li> Führen Sie die markierten T - Zellen auf einer Durchflusszytometrie Maschine 16. Tor die Zellen auf einer T-Zell - Population und Art CD4 + CD45RB hoch doppelt positiven Zellen (die Wellenlänge bei 488 nm detektiert und 633 nm Laser). </li><li> Ernte der sortierten Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 500 xg und 4 ° C. Resuspension der Zellpellets in sterile PBS - Puffer auf 1 x 10 &amp; sup6 ; </sup&gt; Zellen / ml. Injizieren der Zellen (0,5 x 10 6) in das Peritoneum ofeach Rag1 - / - Empfängermaus. </li><li> Opfern , um die Empfängermäuse unter CO 2 zu verschiedenen Zeitpunkten. Ernten die mesenteriale Lymphknoten und die Dünn- und Dickdarm, wie in den Schritten 2.1 und 2.2 beschrieben. Setzen Sie jeden Mesenteriallymphknoten und aufgeschnittenem Darm (Papier / Darm / Papier Sandwich) in 4% Paraformaldehyd (PFA; Griff unter einem Abzug) über Nacht das Gewebe zu reparieren. Ersetzen Sie die PFA mit 18% Saccharose für 16-24 h und dann das Gewebe einzufrieren für das Schneiden. </li><li> Verwenden Sie den Kryostaten Maschine des Gewebes 17, 18, 19 zu schneiden. Warm die Gewebeabschnitte auf Raumtemperatur für ca. 60 min und sie in Aceton für 10 min bei Raumtemperatur. Trocknen Sie sie bei Raumtemperatur für ca. 5 min. </li><li> In FBS über, entfernen Sie sie mit einer Pipette, und fügen Sie anti-RFP bei einer 1: 200-Verdünnung in 0,1% BSA / 1x PBS. Inkubieren des Antikörpers bei 37 ° C für 60 min. </li><li> Spülen Sie die Abschnitte in 1x PBS für 10 min und Anwendung der entsprechenden Sekundärantikörper (Ziege-anti-Kaninchen-568) auf das Gewebe, verdünnt 1: 300 in 1% BSA / 1x PBS, für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie Dias in 1x PBS für 10 min, wischen Sie sie trocken und Deck hinzuzufügen. </li><li> Visualisieren Sie alle Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop unter gleichmäßige Ausleuchtung (RFP: Anregungsfilter 540-580 nm), um das 40X-Objektiv verwendet wird. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

IL-22 spielt eine wesentliche Rolle bei der angeborenen Immunabwehr und Gewebeumbau. IL-22-produzierenden Zellen wurden ex vivo durch intrazelluläre Anfärbung identifiziert. Allerdings bleibt es immer noch schwierig , IL-22 - Expression in situ zu verfolgen, entweder im normalen Zustand oder in entzündlichen Erkrankungen. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren ein IL-22 - Reporter Mausmodell, das uns die Reporter-exprimierenden Zellen in vivo zu lokalisieren ermöglicht zu entwickeln. ...

Zelltyp-spezifische Expression von Reportergenen ist nützlich exprimierenden Zellen in das Zielgewebe unter homöostatischen und gestörter Zustände aktiv zu identifizieren. Es ermöglicht auch die Reinigung dieser Zellen, die lebensfähig bleiben, ihre anderen Eigenschaften zu untersuchen. Reporter-Mäuse wurden bei der Aufklärung der Wirkmechanismus für bestimmte Zytokine, Transkriptionsfaktoren und regulatorische Elemente verwendet. Bisherigen Strategien 1, 2, 3 haben sich auf Klopfen der Reporter in den Ziel - Locus in der Maus - Chromosom, ein zeitraubende und kostspieliges Verfahren weitgehend verlassen. Somit ist eine einfachere Methode zur Erzeugung von Reportermäusen wünschenswert. Cytokine sind eine breite Klasse von kleinen, sekretierte Proteine ​​/ Peptide, die Immunreaktionen durch interzelluläre Signalübertragung regulieren. Interleukin 22 (IL-22) ist ein Zytokin mit vielen Aktivitäten berichtet, einschließlich Barriere function, die Reparatur von Gewebe und Entzündungen 4. Obwohl IL-22 anfangs als T-Zellprodukt 5 demonstrierte nachfolgende entdeckt wurde berichtet seine Expression in natürlichen Killer (NK) -Zellen in Menschen und Mäusen 6 7 und in anderen Klassen von angeborenen Lymphozyten 8. Trotz intensiver Beobachtung von IL-22-produzierenden Zellen, die Visualisierung von IL-22 bisher erforderlichen ex vivo Stimulation und Permeabilisierung zu Flecken mit Antikörpern. Daher wäre Roman IL-22-Reporter-Mäuse ein sehr nützliches Werkzeug, um die Funktion von IL-22 in Homöostase und pathogenen Prozessen zu untersuchen. Hier entwickelten wir ein vereinfachtes transgenes Mausmodell reporter die IL-22-produzierenden Zellen in vivo und in vitro zu beobachten. Mit Hilfe eines BAC Recombineering Methode 9, legten wir die tdTomato cDNA - Sequenz mit Poly - A - Signal - Fragmente in die IL-22 locuns und ersetzt Exon 1. Die anderen untranslatierten Regionen, Exons und regulatorische Elemente nicht gestört wurden, da wir die natürliche Regulation von IL-22, so viel wie möglich zu imitieren möchten. Der Ort der Reporter Insertion unterbricht die Signalsequenz, was zu der Ansammlung des Reporter innerhalb der produzierenden Zellen, im Gegensatz zu IL-22 selbst, die schnell ausgeschieden wird. Dieses neue Verfahren kann auch zur Erzeugung von Reportermäusen für andere sekretierte Proteine ​​angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>RP23-401E11 BAC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RPCI23. C</td><td>Gen-ID erforderlich: 50929</td></tr><tr><td>NucleoBond BAC 100</td><td>Takara Clontech</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790020</td><td></td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10855-001</td><td>1 L: 10 g SELECT Pepton 140, 5 g SELECT Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD3</td><td>eBioscience</td><td>11-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD4</td><td>eBioscience</td><td>17-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MCD4530</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45RB</td><td>eBioscience</td><td>11-0455</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175145</td><td>KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysingpuffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Gesundheitswesen Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II (neutrale Protease, Grad II)</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>IX70 inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Angebot anfordern</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 80i Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Angebot anfordern</td></tr><tr><td>Dynal Shaker</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>61050-10</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Angebot anfordern</td></tr><tr><td>LSRII SORP/Durchflusszytometrie</td><td>Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td></td><td>Angebot anfordern</td></tr></tbody></table>

visualisierung von il-22-exprimierenden lymphozyten unter verwendung reporter mäuse

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter-Mäuse wurden weithin verwendet, um die Lokalisierung der Expression von Genen gezielt zu beobachten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf eine Strategie einen neuen transgenen Reporter Mausmodell zu etablieren. Wir entschieden uns für Interleukin (IL) 22 Genexpression zu visualisieren, da dieses Zytokin wichtige Aktivitäten im Darm hat, wo sie einen Beitrag durch eine Entzündung beschädigte Gewebe zu reparieren. Reporter - Systeme bieten erhebliche Vorteile gegenüber anderen Methoden der Produkte in vivo zu identifizieren. Im Falle von IL-22, hatte andere Studien ersten Zellen aus Geweben isoliert und dann die Zellen in vitro erneut stimuliert. IL-22, das normalerweise ausgeschieden wird, wurde in den Zellen unter Verwendung eines Arzneimittels gefangen, und die intrazelluläre Färbung wurde verwendet, um es zu visualisieren. Dieses Verfahren identifiziert Zellen, die Herstellung von IL-22, aber nicht bestimmen , ob sie in vivo Dabei wurden. Der Reporter Design enthält ein Gen für ein fluoreszierendes Protein (tdTomato) in den IL-22-Gen in einer solchen wa Einfügeny , die das fluoreszierende Protein nicht sezerniert werden und bleibt daher in den produzierenden Zellen in vivo gefangen. Fluoreszierende Produzenten können dann in Gewebeschnitten oder durch ex vivo Analyse durch Durchflusszytometrie visualisiert werden. Die eigentlichen Bauprozess für die Reporter enthalten ein bakterielles künstliches Chromosom Recombineering, die die IL-22-Gen enthielt. Dieses erzeugte Chromosom wurde dann in das Mausgenom eingeführt. Homöostatischen IL-22-Reporter-Expression in verschiedenen Mausgeweben, einschließlich der Milz, Thymus, Lymphknoten, Peyerschen Plaques und Darm, durch Durchflusszytometrie-Analyse beobachtet. Kolitis wurde von T-Zellen (CD4 + CD45RBhigh) Transfer induziert und Reporterexpression sichtbar gemacht wurde. Positive T-Zellen wurden zunächst die in den mesenterischen Lymphknoten und dann akkumuliert sie in der Lamina propria des distalen Dünndarm und Dickdarm Gewebe. Die Strategie BACs gab gute Treue Reporterexpression im Vergleich zu IL-22 Expres mitsion, und es ist einfacher als Knock-in-Verfahren.

Ein Maus - IL-22 Reporter - Transgen wurde unter Verwendung von Recombineering erstellt eine bakterielle künstliche Chromosom tragen die IL-22 - Locus zu ändern. Figur 1 zeigt ein Diagramm von pBACe3.6 Vektor , der das Gen sacBII, einen positiven Selektionsmarker enthält, und Chloramphenicol - Antibiotikum - Resistenzgen 11. Nach der Einführung tdTomato in Exon 1 wurde die Signalpeptidsequenz unterbrochen wird , wie in Abbildung 2...

Wir beschreiben hier ein transgenes Reporter-Mausmodell, um die IL-22-produzierenden Zellen in verschiedenen Mausgeweben sichtbar zu machen. Mit dieser Methode kann die Position anderer Zytokine oder Sekretärsproteine in der Maus verfolgt werden.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Das übergeordnete Ziel dieses genetischen Modifikationsverfahrens der Maus ist es, IL-22-produzierende Immunzellen zu identifizieren, zu reinigen und zu charakterisieren. Zellen des Immunsystems setzen Mediatoren, sogenannte Zytokine, frei, die dafür verantwortlich sind, uns gegen Fremdstoffe wie Bakterien zu verteidigen und geschädigtes Gewebe wiederherzustellen. IL-22 ist ein solches Zytokin und es werden viele Aktivitäten zugeschrieben, die von der Gewebereparatur bis zur Pathologie reichen.Und es wurde berichtet, dass eine Reihe verschiedener Zelltypen des Immunsystems in der Lage sind, es zu produzieren. Um zu klären, welche Zellen tatsächlich IL-22 produzieren, haben wir eine neue IL-22-Reportermaus entwickelt. Dies ermöglichte es uns, relevante IL-22-Produzenten in vivo in Mäusen unter normalen Bedingungen und in einem Modell für entzündliche Darmerkrankungen zu identifizieren.Wir verwendeten auch Reporterzellen, um IL-22-Expressoren aufzureinigen, um ihre anderen Eigenschaften zu bestimmen. Das Verfahren zur Erzeugung von Reportermäusen wird kurz skizziert und die Methoden der Analyse werden beschrieben. Die beschriebenen Verfahren können auf andere Gene angewendet werden, um die Exprimoren zu identifizieren und lebensfähige exprimierende Zellen für eine weitere Charakterisierung zu reinigen.Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie über die biologischen Aktivitäten von IL-22 und die Eigenschaften der Zellen, die es produzieren, zu beantworten. Julie Hixon, eine Biologin, Caroline Andrews, eine Postdoktorandin, und Wenqing Li, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin, alle aus Dr. Durhams Labor, werden das Verfahren mit mir demonstrieren. Nach dem Einfügen des tdTomato-Reportergens in einen Shuttle-Vektor und dem Ersetzen des GFP-Gens an derselben Stelle verwenden Sie das entsprechende bakterielle künstliche Chromosom oder BAC-Template, um die A- und B-Homologieboxen auf das erste translatierte Exon von IL-22 in einem 50-Mikroliter-PCR-Reaktionssystem zu amplifizieren.Verwandeln Sie dann die gereinigten Vektoren in BAC-kompetente Bakterienzellen auf Luria-Bertani- oder LB-Agarplatten, die Chloramphenicol und Ampicillin bei 37 Grad Celsius enthalten. Am Ende der Inkubation beimpfen Sie zwei bis drei Kolonien in einem Milliliter LB-Brühe, ergänzt mit Chloramphenicol bei 37 Grad Celsius und 225 U/min. Nach einer Stunde werden 100 Mikroliter jeder Mischung auf eine LB-Agarplatte verteilt, die mit Chloramphenicol und Saccharose für eine Übernachtkultur bei 37 Grad Celsius ergänzt wird.Am nächsten Morgen werden die großen Kolonien wieder auf eine neue LB-Agarplatte mit Chloramphenicol und die kleinen Kolonien auf eine andere LB-Agarplatte aufgefüllt und die Platten 30 Sekunden lang UV-Licht ausgesetzt. Wählen Sie dann eine UV-empfindliche Kolonie aus und verwenden Sie einen heterozygoten tdTomato IL-22-Primer, um das Vorhandensein der modifizierten BAC-DNA durch PCR zu bestätigen. Nach der Entfernung von Milz und Thymus verwenden Sie eine feine gezackte Dissektionszange, um die perlweißen mesenterialen Lymphknoten nahe der Dünndarmwand zu entnehmen.Entfernen Sie als Nächstes den gesamten Dünndarm und den Dickdarm und extrahieren Sie mit einer Schere die ausgedehnten ovalen Peyer-Flecken entlang des Darms. Wenn das gesamte Lymphgewebe gesammelt wurde, schleifen Sie die mesenterialen Lymphknoten und Peyer-Pflaster zwischen zwei gefrorenen Objektträgern in PBS zusammen, ergänzt mit FBS auf Eis. Nach der Erzeugung einzelner Milz- und Thymus-Einzelzellsuspensionen auf die gleiche Weise zentrifugierten die Milzzellen nach einer Milzlyse der roten Blutkörperchen mit einem Milliliter ACK Lysing Buffers Milz.Stellen Sie nach einer Minute die Isotonie mit neun Millilitern PBS wieder her und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern PBS und filtrieren Sie die Zellen durch ein 100-Mikron-Zellsieb. Sammeln Sie dann die Zellen durch eine weitere Zentrifugation, wobei das Pellet in fünf Millilitern RPI-Medium resuspendiert wird, um es durch Trypanblau-Ausschluss zu zählen.Nach der Entnahme des Dünndarms vom Zwölffingerdarm zum Ileum zusammen mit dem gesamten Dickdarm verwenden Sie eine Pinzette, um das überschüssige Fett- und Mesenterialgewebe aus dem Darm zu entfernen, und legen Sie das Darmgewebe sofort in eiskaltes PBS. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Peyer-Flecken entlang der distalen Region des Dünndarms zu entnehmen. Öffnen Sie dann mit einer Schere den Darm der Länge nach und spülen Sie das Gewebe gründlich mit 10 Milliliter eiskaltem PBS aus.Übertragen Sie die Probe in 20 Milliliter Vorverdauungspuffer für zwei 30-minütige Inkubationen bei 37 Grad Celsius und 50 U/min in einen Schüttler, wirbeln Sie das Gewebe 30 Sekunden lang bei 12.000 U/min und drücken Sie alle Fragmente am Ende jeder Inkubation durch ein 100-Mikron-Zellsieb, um die Epithelzellschicht zu sammeln. Geben Sie anschließend 20 Milliliter frische EDTA-Lösung in die Zellaufschlämmung für eine weitere 30-minütige Inkubation unter Schütteln bei 37 Grad Celsius, filtrieren und kühlen Sie die Darmepithelzellen am Ende der Inkubation, wie gerade gezeigt. Legen Sie die restlichen Darmfragmente auf Eis und sammeln Sie die gepoolten Darmepithelzellen durch Zentrifugation, gefolgt von einer Wäsche in 10 Millilitern HBSS, ergänzt mit FBS.Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in acht Millilitern 44 % kolloidalem Kieselsäuremedium und überlagern Sie die Zellsuspension mit fünf Millilitern 67 % kolloidalem Kieselsäuremedium. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um die oberen fünf Milliliter des Zelltrennmediums zu entfernen. Sammeln Sie dann die Zellen an der Grenzfläche und waschen Sie die Darmepithelzellen in 10 Millilitern RPMI-Medium, wobei Sie das Pellet in fünf Millilitern frischem RPMI resuspendieren.Nach der Herstellung von einzelnen Milzzellsuspensionen von IL-22 td-Tomato-Mäusen, wie gerade gezeigt. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von eins mal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter in sterilem PBS und verwenden Sie die Methode der negativen Isolierung von CD4-Zellen der Maus, um die CD4-positiven T-Zellen zu reinigen. Als nächstes markieren Sie die T-Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit Anti-CD4- und Anti-CD45RB-Antikörpern.Am Ende der Inkubation werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, gefolgt von einer Wäsche in zwei Millilitern PBS, das mit FBS ergänzt wird. Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in einem Milliliter frischem PBS und FBS und sortieren Sie die markierten T-Zellen mittels Durchflusszytometrie nach ihrer CD4- und CD45RB-Koexpression. Wenn alle Zellen sortiert sind, sammeln Sie sie durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einer Konzentration von einmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in sterilem PBS zur Injektion der Zellen in RAG1-Knockout-Mausempfänger.Um das murine IL-22-Reportertransgen zu erzeugen, wurde die Rekombinierung verwendet, um ein bakterielles künstliches Chromosom zu modifizieren, das die IL-22-Heuschrecke trägt und auch einen positiven Selektionsmarker und ein Chloramphenicol-Antibiotikaresistenzgen enthält. Nach der Einführung von tdTomato in exon1 wurde die Signalpeptidsequenz gestört, wodurch der tdTomato-Reporter in den IL-22-exprimierenden Zellen gefangen wurde und deren Nachweis und Isolierung durch Durchflusszytometrie ermöglicht wurde. Um die Genauigkeit der IL-22-Reporter zu testen, können in vitro erzeugte Splenozyten unter Th22 oder neutralen Bedingungen kultiviert werden, wobei die IL-22 tdTomato-Expression sowohl durch Durchflusszytometrie als auch durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar wird.In vivo wurden die IL-22-Reporter in verschiedenen Mausgeweben unter homöostatischen Bedingungen nachgewiesen, wobei der größte Teil des Signals in den Zellen der Lamina propria aus dem Darm beobachtet wurde, nicht jedoch im axillären Lymphknoten, in der Milz oder im Thymus. In einem Maus-Colitis-Modell, das durch den Transfer von Reporter-CD4-positiven CD45RB-High-T-Zellen in RAG1-Knockout-Mäuse induziert wurde, wurden die tdTomato-Reporter zunächst in den mesenterialen Lymphknoten sichtbar gemacht, ihre eventuelle Akkumulation jedoch in den Lamina propria des distalen Dünndarms und des Dickdarmgewebes. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den richtigen BAC-Klon auszuwählen.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie die Etablierung von Lungen- oder Hautinfektionsmodellen, mit dieser Reportermaus durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Rolle von IL-22 bei der Wirtsabwehr und Gewebereparatur zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Funktion von sezernierten Proteinen, die eine geringe Expression aufweisen, mit einem Mausmodell wie diesem zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine transgene Reportermaus erzeugt und IL-22-Reportergene in vitro und in vivo identifiziert.

visualization-of-il-22-expressing-lymphocytes-using-reporter-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Verfahren beschreibt die Detektion und Isolation von Maus-TH17 Leukozyten, die sich aktiv sezernieren IL-17 nach Stimulation.

Detektion und Isolation von lebensfähigen Maus IL-17-sezernierenden T-Zellen

Die stabile intravitale hochauflösende Bildgebung von Immunzellen in der Leber ist eine Herausforderung. Hier bieten wir eine hochempfindliche und zuverlässige Methode zur Untersuchung der Migration und Zell-Zell-Interaktionen von Immunzellen in der Leber von Mäusen über lange Zeiträume (ca. 6 Stunden) mittels intravitaler Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopie in Kombination mit intensivmedizinischem Monitoring.

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Visualisierung der IL-8-Promotor-abhängigen Entzündungsaktivierung in den Lungen von Mäusen durch nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung (BLI). Das gleiche Tier kann BLI mehrmals für bis zu zwei Monate ab dem Zeitpunkt der Auslieferung des Luciferase-Reporter-Konstrukts unterworfen werden.

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die<em&gt; In vivo</em&gt; Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen

Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung der mehrere Zytokin Ziele gleichzeitig in Gewebekultur Überstände von stimulierten Maus Splenocyten Multiplex-Perle-basierte Immunoassay-Plattform mit einem Durchflusszytometer gesammelt.

Multiplex-Zytokin Profilierung der stimulierten Maus Splenocyten mit Hilfe einer durchflusszytometrischen Bead-basierte Immunoassay-Plattform

Hier zeigen wir die Methoden zur in Vivo Quantifizierung der Leukozyten Ausstieg aus naiv, entzündet, und bösartigen murinen Haut. Wir führen einen direkten Vergleich der beiden Modelle: transdermale FITC Anwendung und in Situ Ladungszustand. Darüber hinaus zeigen wir den Nutzen der Ladungszustand für die Verfolgung von Leukozyten Egress von kutanen Tumoren.

Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Hier beschreiben wir eine einfache konfokale Bildgebungsmethode, um die In-situ-Lokalisierung von Zellen zu visualisieren, die das Zytokin Interferon-Gamma in murinen sekundären Lymphorganen absondern. Dieses Protokoll kann für die Visualisierung anderer Zytokine in verschiedenen Geweben erweitert werden.

Bildgebung der In Situ Interferon Gamma Produktion in der Maus Milz nach Listeria monocytogenes Infektion

Angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 2 (ILC2), die an Typ-2-Entzündungen beteiligt sind, sind hauptsächlich an der Reaktion auf Helmintheninfektionen, allergische Erkrankungen, metabolische Homöostase und Gewebereparatur beteiligt. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Isolierung von ILC2s aus der murinen Nasenschleimhaut und zum Nachweis der Expression von CD226 demonstriert.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe 2 aus der Nasenschleimhaut der Maus zum Nachweis der Expression von CD226

IL-9-exprimierende T- und ILC2-Zellen werden während einer N. brasiliensis-Infektion induziert, ihre Charakterisierung wurde jedoch im infizierten Darm aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und differentiellen Kinetik weitgehend übersehen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung dieser Zellen aus verschiedenen Zielorganen und die Bestätigung ihrer Identität mittels Durchflusszytometrie in verschiedenen Infektionsstadien.

Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

Wir beschreiben eine Methode, um tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) von Mäusen mittels Durchflusszytometrie für den adoptiven Zelltransfer zu nutzen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die spezifische Zytotoxizität von TILs gegen Tumore in einem syngenen Pankreaskarzinom-Mausmodell zu verifizieren und Einblicke in die Entwicklung adoptiver Zelltherapien für Bauchspeicheldrüsenkrebs zu geben.

Durchflusszytometrie-basierte Isolierung und therapeutische Bewertung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten in einem Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Erfahren Sie, wie Sie IL-22-produzierende Immunzellen in transgenen Reporter-Mäusen visualisieren und charakterisieren. Diese Methode ermöglicht die In-vivo-Verfolgung von Zytokinen in Geweben.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

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