Name: Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Erfahren Sie die isoliert perfundierte Nieren-Technik bei der Maus für Nephrologie-Forschung. Diese Methode ermöglicht die Analyse der Nierenfunktion ex vivo ohne systemische Einflüsse und liefert wertvolle Erkenntnisse zur akuten Nierenverletzung.

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Die Autoren danken Hans-Joachim Schurek für seine unschätzbare wissenschaftliche Beratung. Die Autoren danken Monique Carrel und Michèle Heidemeyer für die hervorragende technische Unterstützung, David Penton Ribas und Nourdine Faresse für die kritische Lektüre des Manuskripts und Carsten Wagner und Jürg Biber für den NaPi-2a-Antikörper. Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Nationalen Forschungsschwerpunkt "Kidney.CH" und durch einen Projektbeitrag (310030_143929/1) des Schweizerischen Nationalfonds.

Alle Verfahren mit Tieren in diesem Manuskript beschrieben, wurden auf Schweizer Recht durchgeführt nach und von der Veterinärverwaltung des Kantons Zürich, Schweiz genehmigt. 1. Puffer Vorbereitung <ol><li> Herstellung von Lösungen von 1 bis 4 und der ADH (ADH) -Lösung (Tabelle 1). </li><li> Bereiten Sie die Dialysepuffer (Tabelle 1). Hinweis: Dies ist der Puffer als Dialysepuffer während der Perfusion verwendet. Später werden die Erythrozyten in diesem Puffer verdünnt, um die endgültige Perfusat zu bilden. </li><li> Erythrozyt Vorbereitung. <ol><li> Verdünnte 250 ml menschlicher Erythrozyten-Konzentrat (geprüfte Material aus der lokalen Blutbank erhalten wird) auf 500 ml mit Dialysepuffer. Zentrifuge bei 2000 × g für 8 min. Entfernen Sie den Puffer, wobei keine Erythrozyten zu entfernen. 3x wiederholen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie das Albumin (Rinderserumalbumin, BSA) Puffer. <ol><li> In 200 ml dialysis Puffer, lösen sich 44 g BSA einen Rührstab verwenden. Filtern Sie die Lösung mit Filterpapier. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Perfusat. <ol><li> Filtern Sie die Erythrozyten aus Schritt 1.3.1 durch Filterpapier in den BSA-Puffer. Füllen Sie auf ein Gesamtvolumen von 800 ml mit Dialysepuffer auf. HINWEIS: Dies ist die letzte Perfusat. Der Hämatokrit sollten nun zwischen 8 und 12% liegen. Das Perfusat kann bei 4 ° C bis zu 12 Stunden gelagert werden. </li></ol></li></ol> 2. Initiieren Dialyse und Oxygenation <ol><li> Schalten Sie das Wasserbad rund um den größeren Pufferbehälter, kleiner Pufferspeicher, und die feuchte Kammer (eine kleine, doppelwandige Kammer gebracht auf 37 ° C und 100% Luftfeuchtigkeit später die Nieren halten) bis 37 ° C (Abbildung 2) . </li><li> Füllen Sie den größeren Pufferspeicher mit dem Dialysepuffer und den kleineren Behälter mit dem Perfusat. </li><li> Schalten Sie die 5% CO 2/95% O 2 Gaszufluss zu dem Dialysepuffer. </li><li> Schalten Sie kontinuierliche Dialyse des Perfusat gegen den Dialysepuffer. Achten Sie darauf, Low-Flux-Dialyseschlauch zu verwenden. Gehen Sie zu Schritt 3. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schematische Darstellung des Perfusionskreislaufes. Schema zeigt die Hauptkomponenten des Perfusionskreislaufs und die Richtung des Pufferflusses. Alle Komponenten von dunkelblau umgeben sind bei 37 ° C mit einem Wasserbad / Thermostat gehalten. 1: Dialysepuffer von mindestens 3 - fache des Volumens des Puffers Perfusion mit 95% O 2/5% CO 2 kontinuierlich geperlt. 2: Dialysepuffer und Perfusionspuffer werden gegeneinander in einen Dialyseschlauch mit einer Rollenpumpe kontinuierlich dialysiert. 3: Durch diese Dialyse, die Perfusionspuffer mit 9% O 2/5% CO 2 und der Elektrolytspiegel konstant gehalten werden througho angereichertut Perfusion. 4: Eine Rollenpumpe treibt den Perfusionspuffer in Richtung auf die Niere. 5: Ein Windkessel entfernt peristaltischen Wellen und wirkt als Blasenfalle. 6: Druckwandler (verbunden mit 4. (Rollenpumpe) Dauerdruck zu halten , während frei abwechselnd Strömung erlaubt). 7: Während der Perfusion, bleibt die Niere in einer feuchten Kammer für 100% Luftfeuchtigkeit und 37 ° C Nierentemperatur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 3. Chirurgische Verfahren Teil 1 (für ein Diagramm aller Ligaturen, siehe Abbildung 3) Hinweis: Führen Sie alle Ligatur mit 5-0 chirurgischen Faden. <ol><li> Anästhesieren einer Maus durch intraperitoneale Injektion (10 ul / g Körpergewicht, 20 mg / ml Ketamin und 1 mg / ml Xylazin in 0,9% NaCl gelöst). Bestätigen Sie eine ausreichende Tiefe von AnesthESIA durch die Prüfung für das Fehlen von hinteren Fuß Reflexe. </li><li> Befestigen Sie die Maus in Rückenlage in der feuchten Kammer. Schützen Sie die Augen mit vet Salbe. Legen Sie eine 1-ml-Spritze unterhalb der Wirbelsäule, die Lendengefäße zu erhöhen. </li><li> Führen Sie eine mittlere Laparotomie vom Schamkamm bis zum Brustbein Öffnung zuerst die Haut, dann die Bauchmuskeln, mit einer Schere. </li><li> Entfernen Sie den Darm und legen Sie sie auf der linken Seite der Maus seitlich aus dem Bauch. </li><li> Befreien Sie die Blase aus Bindegewebe und erforschen beide Harnleiter und die Harnröhre. </li><li> Legen Sie eine Ligatur um die linke Harnleiter (Ligatur I). Schließen Sie es. </li><li> Legen Sie eine Ligatur um die Harnröhre (Ligatur II). Schließen Sie es. </li><li> Setzen Sie ein &quot;Lasso&quot; Ligatur um die ganze Blase (Ligatur III). </li><li> Inzision der Blase 1 mm. </li><li> Kanülieren die Öffnung mit 2 cm PE 50 Schläuchen. </li><li> Schließen Ligatur III um das Rohr. </li><li> Schneiden Sie die linke Harnleiter und Harnröhre entfernt von der Ligatur. Die bladder wird jetzt nur auf der rechten Seite Harnleiter befestigt und frei bewegen. </li><li> Deaktivieren Sie die Bauchaorta von Bindegewebe und Fett. </li><li> Legen Sie eine Bauch Mitte Aorta Ligatur (Ligatur IV). </li><li> Legen Sie eine Ligatur um die Aorta unterhalb der Membran zwischen der A. mesenterica superior und der Zöliakie-Stamm (Ligatur V). </li><li> Legen Sie eine Ligatur um die A. mesenterica superior (Ligatur VI). </li><li> Legen Sie eine Aorten-Ligatur direkt unter dem rechten und über dem linken Nierenarterie (Ligatur VII). </li><li> Legen Sie eine Ligatur um die Schwanzvene Paket (Cava) (Ligatur VIII). Gehen Sie zu Schritt 4. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> Abbildung 3: Schematische Darstellung der Ligatures während der Operation gegeben. Mit Blick auf das offene Bauch nach der Laparotomie. Der Darm wird nach links ausgezogen. L und R zeigen die linke und die rechte Niere. Dasschwarze Linien zeigen den Bereich der jeweiligen Ligatur. Ligatures werden immer zuerst gesetzt und dann geschlossen, in der im Text angegebenen Reihenfolge. X markiert die Lage des Einschnitts für Aorta Kanülierung. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 4. Priming des Perfusionskreislaufes <ol><li> Starten Sie die Kreiselpumpe und füllen Sie den Schlauch mit Perfusat. Achten Sie darauf, alle Luftblasen aus sie zu leeren. </li><li> Füllen Sie das Windkessel Gerät etwa der mittleren Ebene mit Perfusat. </li><li> Kalibrieren Sie den Druckwandler auf 0 mm Hg, wenn alle Rohre gefüllt und Strömung ist 0. während dieser Zeit die Perfusion Nadel bei Nieren Niveau zu halten. </li><li> Halten Sie Fluss auf einem konstanten minimalen Niveau (0,6 ml / min) und gehen Sie zu Schritt 5. </li></ol> 5. Chirurgisches Verfahren Teil 2 <ol><li> Legen Sie eine Klammer zwischen Ligatur IV und der Verzweigung des linken renal Arterie. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Aorta Schwanz- der Ligatur IV, dabei nicht die Rückwand zu schneiden. </li><li> Dilatieren die Öffnung in der Aorta mit einem Gefäß Dilatator. </li><li> nur an der Klemme kanülieren die Aorta mit einer Nadel (2 cm lang, zog 50 PE), die Spitze schieben. </li><li> Öffnen Sie die Klemme. </li><li> Schieben Sie die Spitze der Nadel kranial, bis sie die Kreuzung der rechten Nierenarterie und der Aorta erreicht. </li><li> Schließen Ligatur VII. </li><li> Schließen Ligatur IV. </li><li> Öffnen Sie die Brust mit einer Schere durch die Membran zu sezieren. Mit einem einzigen Schnitt, trennen Sie die Aorta, Hohlvene, Herz und vegetative Nerven. Mit diesem Schritt wird das Tier über eine schnelle Ausbluten unter kontinuierlicher tiefer Narkose getötet. </li><li> Starten Drucksteuerung der Perfusionspumpe. Pflegen Sie den mittleren Druck zwischen 80 und 100 mmHg. </li><li> Schließen Ligatur V. </li><li> Schließen Ligatur VI. </li><li> Schließen Ligatur VIII. </li><li> Freie die rechte Niere von Binde- tissue und seine Einbettung in die adipösen Kapsel mit einer Schere. </li><li> Schneiden proximal die Aorta V. Ligatur </li><li> Schneiden Sie die A. mesenterica superior distal VI Ligatur. </li><li> Schneiden Sie die Niere tragende Gefäßbündel aus, dabei nicht in die Gefäße selbst zu schneiden. </li><li> Schneiden die Leber an der Verbindung mit der Niere. Achten Sie darauf, die Niere zu befreien, aber ein kleiner Teil der Leber verwachsen sie verlassen, so dass die Hohlvene wird durch sie offen gehalten. </li><li> Nehmen Sie die Niere Bündel aus der Maus. Entfernen Sie die Maus aus der feuchten Kammer. </li><li> Setzen Sie ein &quot;Lasso&quot; Ligatur um die Verbindung von Leber und Niere (Ligatur IX). </li><li> Kanülieren die Hohlvene mit einer venösen Leitung (2 cm PE 50). </li><li> Schließen Ligatur IX. Venöse Abfluss durch die venöse Leitung sollte sofort beginnen. </li><li> Schließen Sie die feuchte Kammer. </li></ol> 6. Downstream-Analysen <ol><li> Während der folgenden Stunde, überwachen kontinuierlich den Blutfluss und intravascular Druck 15. Sammeln Sie venösen Abfluss, die 7 für die Analyse von zum Beispiel Nierenreninfreisetzung verwendet werden kann. Sammeln Sie Urin für die Analyse der Elektrolytkonzentration und der glomerulären Filtrationsrate 14. Nach 1 Stunde Perfusion kann Nieren für Western - Blot werden schockgefroren oder für die Bildgebung Ansätze 16 festgelegt werden. </li></ol>

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<li>Poosti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+kidney+slices+%28PCKS%29+to+study+development+of+renal+fibrosis+and+efficacy+of+drug+targeting+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).</li>
<li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney%3A+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen und nichts anderes offenzulegen.

Die Maus perfundierte Niere isoliert ist ein Werkzeug für die Untersuchung der Nierenfunktion in einer kontrollierten Umgebung ex vivo für 1 h, die Lücke zwischen den in vivo Experimenten in intakten Tieren, die durch die Wirkung zahlreicher systemischer Faktoren fehlerhaft sein kann, und in vitro - Experimenten in isoliert nephron Segmente oder kultivierten Zellen, die notwendigerweise die Auswirkungen der intakten Organstruktur auf Funktion vernachlässigen. Es ist, nach Kenntnis der Autoren,...

Die isolierte Perfusion von Organen hat unter Physiologen seit vielen Jahrzehnten ein Gegenstand einer laufenden Bemühungen gewesen. Die Technik ermöglicht es, die Funktion des Organs, ohne systemische Einflüsse wie Blutdruck, Hormone oder Nerven, untersucht werden. Carl Eduard Loebell gilt als der erste sein , um die erfolgreiche Perfusion eines isolierten Niere beschrieben haben, im Jahr 1849 2. Seitdem hat sich die Perfusionsgerät erhebliche Verfeinerung erfahren. Frey und Gruber führte eine künstliche Lunge für die Sauerstoffversorgung und pulsatile Pumpen für kontinuierliche Perfusion 2. Während frühe Forscher vor allem die Nieren von großen Säugetieren nämlich sucht, Schweine und Hunde 2 3 -der erste Bericht über die Verwendung von Rattennieren, die von Weiss et al. , War in der Studie der kleinen Säuger-Organperfusion 4 ein Meilenstein. Schurek et al. die Notwendigkeit der Zugabe von Säugetieren Erythrozyten zu dem Perfusat, wenn eine ausreichende renale tubuläre berichtetOxygenierung wurde auf 5 erreicht werden. Kritisch für Langzeitversuchen war die Einführung der kontinuierlichen Dialyse des Puffers von der gleichen Arbeitsgruppe 6. Im Jahr 2003 Schweda et al. waren die ersten , eine funktionelle Maus isoliert perfundierten Niere (MIPK) 7, verfeinert später von Rahgozar et al berichten. 18 und Lindell et al. 14. Während technisch schwieriger als die Ratte perfundierten Nieren isoliert, trägt die Verwendung des MIPK den Vorteil, die Verwendung einer Vielzahl von genetisch veränderten Mäusen ermöglichen. Dieses Papier stellt die Einzelheiten des Verfahrens der Autoren für die Perfusion von isolierten Maus-Nieren für 1 Stunde. Das Verfahren ermöglicht die kontinuierliche Messung der Nierendurchflussrate, Gefäßwiderstand, Hormonfreisetzung, Blutgasanalyse, Urinanalyse und die Anwendung von Medikamenten. Nach dem Verfahren könnte Nieren für molekulare und biochemische Analyse verarbeitet werden, für die Mikroskopie festgelegt werden, odertransplantierten in eine Empfängermaus (Abbildung 1). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> Abbildung 1: Übersicht über die möglichen Input / Output an den isolierten perfundierten Nieren. BGA: Blutgasanalyse. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Diese Technik wird wahrscheinlich erhalten Aufmerksamkeit in den kommenden Jahren zu erhöhen, da viele innovative Anwendungen sind mit dem Beginn der verlängerten normothermic Nierenperfusion vor der Transplantation diskutiert (mit oder ohne die Anwendung von Anti-Ablehnung oder Genom-Bearbeitung Drogen) 8, 9, 10 , 11, die Bioengineering von ganzen Nieren von dezellularisierten Gerüste 12 und die Anwendung von hohen Dosen von fluoreszierenden Farbstoffen für Mehrphotonenabbildungs 13 </sup&gt;. Es ist auch ein ideales Modell , mit dem 14 die Rolle spezifischer Gene während der akuten Nierenschädigung zu untersuchen. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll gegeben anderen Labors zu ermöglichen isolierten Maus Nierenperfusion erfolgreich durchzuführen. Zuerst wird die Zusammensetzung und die Herstellung des Puffers spezifiziert. Dann wird die Operation im Detail beschrieben und die kritischen Schritte gezeigt. Drittens werden Daten vorgestellt, die repräsentativ für eine erfolgreiche Vorbereitung: Nierendurchblutung, Gefäßwiderstand, glomeruläre Filtrationsrate und fraktionierte Elektrolytausscheidung-alle als funktionelle Messungen der Lebensfähigkeit-und transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen der Morphologie verschiedener nephron Segmente perfundiert Nieren nach 1 Stunde der Perfusion fixiert.

<table><tbody><tr><td>Perfusion Circuit:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moist chamber 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Kanüle mit Korb und seitlichem Port</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat TC120-ST5&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Rollenpumpe Reglo Analogue</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Behälter ummantelt für Pufferlösung 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Behälter ummantelt für Pufferlösung 0,5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Druckmessumformer APT300&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Transmitter</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys Servo</td><td>Controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB Datenerfassung</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfon</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>PE-Schlauch für die Aortenkanüle 1,19 mm I.D. x 1,70 mm O.D.</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Pufferreagenzien:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasma 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure-Mononatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Apfelsäure-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-L-L-Lactat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-Ketoglutarsäure-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kreatinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2</td><td>O Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 * 6H2O&nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&euml; n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antidiuretikum Hormon dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter zur Erythrozytenfiltration</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analyse:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmikroskop:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die maus isoliert perfundierten nieren-technik

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Die Maus isoliert perfundierten Nieren (MIPK) ist eine Technik zum Halten einer Mausniere unter ex vivo - Bedingungen durchbluteten und funktionell für 1 Std. Dies ist eine Voraussetzung für die Physiologie des isolierten Organs zu studieren und für viele innovative Anwendungen, die in der Zukunft möglich sein, einschließlich Perfusion Dezellularisierung für Nieren Biotechnik oder die Verabreichung von anti-Ablehnung oder Genom-Bearbeitung Medikamente in hohen Dosen zu grundieren der Niere für die Transplantation. Während der Zeit der Perfusion kann die Niere manipuliert werden, kann die Nierenfunktion bewertet werden, und verschiedene Arzneimittel verabreicht. Nach dem Verfahren kann die Niere für die Molekularbiologie, biochemische Analyse oder Mikroskopie transplantierten oder verarbeitet werden. Dieses Papier beschreibt die Perfusat und die chirurgische Technik für die ex vivo Perfusion von Mausnieren benötigt. Einzelheiten der Perfusionsgerät gegeben und Daten vorgestellt, die v zeigtAFTUNG der Zubereitung der Niere: Nierendurchblutung, Gefäßwiderstand und Urin Daten als funktionelle, Transmissionselektronenmikrographien verschiedener nephron Segmente als morphologische Ablesungen und Western-Blots von Transportproteinen verschiedener nephron Segmente als molekulare Anzeige.

Mit dem Verfahren isolierten Maus-Nieren beschrieben, kann für mindestens 1 h lebensfähig bleiben. Wir testeten die Gewebelebensfähigkeit nach 1 Stunde der kontinuierlichen Perfusion mit funktionellen (Nierendurchblutung und Gefäßwiderstand, Blutgasanalyse von venösen Abflusses, der glomerulären Filtrationsrate, Harn- fraktionierte Na + und K + -Ausscheidung und Urinosmolalität) und morphologischen (Transmissionselektronenmikroskop Mikroskopie TEM) Methods in vier N...

Die Maus isoliert perfundierten Nieren (MIPK) ist eine Technik zum Halten einer Mausniere unter ex vivo - Bedingungen durchbluteten und funktionell für 1 Std. Die Puffer und die chirurgische Technik werden ausführlich beschrieben.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Funktion einer isolierten Niere in einer ex vivo perfundierten Mausniere zu analysieren, wobei der Einfluss von Blutdruck, Hormonen oder dem autonomen Nervensystem ausgeschlossen wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Nephrologie zu beantworten.Die Untersuchung der Funktion isolierter Organe und die Anwendung als elegantes Werkzeug zur Erforschung akuter Nierenschädigungen. Der Hauptvorteil der IPK besteht darin, dass die Organfunktion unabhängig von systemischen Einflüssen untersucht wird. Nach der Vorbereitung der Maus für die Operation führen Sie mit einer Schere einen mittleren Laparotomieschnitt von der Schambeinfuge bis zum Brustbein durch.Öffnen Sie zuerst die Haut und danach die Bauchmuskulatur. Entfernen Sie anschließend die Eingeweide und legen Sie sie auf die linke Seite der Maus, seitlich vom Abdomen. Befreien Sie nun die Harnblase vom Bindegewebe und legen Sie beide Harnleiter sowie die Harnröhre frei.Verwenden Sie für diese Verfahren alle Ligaturen mit 5-0-Nähten. Die erste zu setzende Ligatur befindet sich um den linken Harnleiter. Schließen Sie diese mit einem doppelten外chirurgischen外Knoten fest.Als Nächstes führen Sie eine Ligatur um die Harnröhre mit der gleichen Technik durch. Danach legen Sie eine Lassoligatur um die gesamte Harnblase, lassen sie jedoch noch nicht zugezogen. Mit den ersten drei Nähten an Ort und Stelle machen Sie mit einer Augenschere einen einen Millimeter langen Schnitt in die Harnblase.In diesen Einschnitt wird eine Kanüle aus zwei Zentimetern PE-50-Schlauch eingebracht. Danach wird die Ligatur, die die Harnblase umschlingt, festgezogen, um die Kanüle zu sichern. Nachdem die Harnblase kanüliert ist, wird nun der linke Harnleiter und die Harnröhre distal zu den Ligaturen durchtrennt.Die Harnblase sollte nun nur noch am rechten Harnleiter befestigt sein und sich frei bewegen lassen. Entfernen Sie anschließend das Bindegewebe und das Fettgewebe um die Bauchaorta herum. Bringen Sie dann Ligaturen um die Mitte der freigelegten Aorta und direkt unterhalb des Zwerchfells zwischen der Arteria mesenterica superior und dem Truncus coeliacus an.Halten Sie auch jeden von diesen locker. Als Nächstes legen Sie eine Ligatur um die Arteria mesenterica superior. Nun setzen Sie eine dritte Ligatur um die Aorta direkt unterhalb der rechten Nierenarterie und oberhalb der linken Nierenarterie.Dies ist Ligatur Nummer sieben. Schließen Sie nun eine Ligatur um das kaudale Venenbündel. Platzieren Sie jetzt eine Klemme zwischen Ligatur Nummer sieben und der Abzweigung der linken Nierenarterie.Danach einen kleinen Einschnitt in die Aorta kaudal zur Ligatur sieben vornehmen, wobei darauf zu achten ist, die dorsale Wand nicht zu durchtrennen, und die Öffnung mit einem Gefäßerweiterer weiten. In die Öffnung eine 2 cm lange gezogene PE-50-Kanüle einführen, wobei die Spitze gerade in die Klemme geschoben wird. Anschließend die Klemme öffnen.Als Nächstes die Nadelspitze kranial vorstoßen, bis sie die Verbindung der rechten Nierenarterie mit der Aorta erreicht. Schließen Sie nun Ligatur sieben und danach die Ligatur in der Mitte der Aorta abdominalis. Öffnen Sie anschließend den Brustkorb mit der Schere, indem Sie das Zwerchfell dissektieren.Danach mit einem einzigen Schnitt die Aorta, Vena cava, das Herz und die vegetativen Nerven voneinander trennen. Nun die Druckregelung der Perfusionspumpe starten und den mittleren Druck zwischen 80 und 100 Millimeter Quecksilber einstellen. Danach die drei verbleibenden nicht verschlossenen Ligaturen um das Aorta- und Caudalvenenbündel schließen.Lösen Sie mit einer Schere die rechte Niere vom umgebenden Bindegewebe und befreien Sie sie aus der Fettkapsel. Durchtrennen Sie die Aorta proximal zur Ligatur zwischen der Arteria mesenterica superior und dem Truncus coeliacus. Schneiden Sie anschließend die Arteria mesenterica superior distal zur Ligatur um die Arteria mesenterica superior durch.Entfernen Sie nun das die Niere tragende Gefäßbündel, wobei darauf zu achten ist, die Gefäße selbst nicht anzuschneiden. Anschließend wird die Leber an der Verbindung zur Niere durchtrennt, wobei ein kleiner Teil der Leber an der Niere belassen wird, damit die Vena cava davon offen gehalten bleibt. Im nächsten Schritt wird das Nierenbündel vom Maus entfernt.Lassen Sie die Niere nun in der Kammer und entfernen Sie die Maus. Setzen Sie am Übergang zwischen Leber und Niere eine Lasso-Ligatur an. Dann katheterisieren Sie die Vena cava mit einer venösen Kanüle und schließen Sie die Lasso-Ligatur.Die Niere sollte nun stabil in der Box sitzen. Der venöse Abfluss über die Venenleitung sollte sofort beginnen. Der Harnabfluss setzt nach etwa drei Minuten ein.Die Peristaltik des Harnleiters sollte unmittelbar beginnen und mindestens eine Stunde lang stabil bleiben. Schließen Sie die Box. Die Vorbereitung ist nun abgeschlossen und sollte mindestens eine Stunde lang funktionsfähig bleiben.Nach Anwendung der beschriebenen Methode an C57 black 6 Mäusen wurde die Gewebeviabilität von vier Nieren nach einer einstündigen kontinuierlichen Perfusion überprüft. Der Druck wurde konstant bei 100 Millimeter Quecksilber gehalten. Der Perfusatsfluss und der vaskuläre Widerstand blieben in allen vier Nieren stabil.Die glomeruläre Filtrationsrate wurde mittels FITC-Inulin-Clearance bestimmt, die mit der Zeit ansteigen sollte, jedoch nicht signifikant. Die fraktionelle Ausscheidung von Natrium und Kalium wurde nach 55 Minuten Perfusion ermittelt. Diese Parameter waren im Vergleich zur In-vivo-Situation erhöht.Nach 55 Minuten stieg die Osmolalität der Harns nicht über die Osmolalität des venösen Abflusses an. Die Nieren wurden daraufhin fixiert und ihre Ultrastruktur mittels TEM untersucht. Die Glomeruli in den S1-Segmenten der proximalen Tubuli erschienen weitgehend unverändert.Einige, aber nicht alle S2- und S3-Segmente der proximalen Tubuli in den dicken aufsteigenden Ästen, die nicht in der Nähe von vaskulären Bündeln lagen, wiesen Anzeichen von Organschäden auf. Bei genauerer Untersuchung zeigten die distalen gewundenen Tubuli und Sammelrohre keine Anzeichen von Nekrose. Insgesamt spiegelten die Nieren das wider, was für isoliert perfundierte Nieren von Ratten berichtet wurde.Nach diesem Verfahren können Analysemethoden wie Bildgebung oder anschließende Protein- oder RNA-Analysen am Gewebe durchgeführt werden, um weitere Erkenntnisse zu gewinnen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine genaue Mausmodell für akute Nierenschädigung (AKI) aufgrund einer Ischämie ist ein wichtiges Instrument, um akutes Nierenversagen zu untersuchen und möglicherweise finden therapeutische Werkzeuge zur Nierenschädigung zu behandeln. Die hängende Gewicht System bietet ein Werkzeug für die sofortige und zuverlässige Nierenarterie Okklusion und Reperfusion ohne Nieren Staus.

Die Verwendung eines Hanging-weight-System für Isolated Nierenarterie Occlusion

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Nierenextraktion aus dem retroperitonealen Raum der Maus. Die entnommene Niere kann weiter mikropräpariert werden, um eine intakte Niere ohne Nierenkapsel und die umgebende Fettschicht zu erhalten.

Extraktion einer intakten Niere aus einer Maus: Eine Technik zur Gewinnung einer Niere ohne Nierenkapsel aus Mausmodellen

Dieses Video beschreibt die Methode zur Isolierung intakter Glomeruli aus Mausnieren. Die so erhaltenen verkapselten und entkapselten Glomeruli können weiterhin zur Kultivierung von parietalen Epithelzellauswüchsen aus der Mausniere verwendet werden.

Glomeruli-Isolierung: Eine Technik zur Gewinnung intakter Glomeruli aus der Murine

Wir beschreiben Modelle der mittelschweren und schweren Ischämie-Reperfusion-induzierte Nierenschädigung, in denen die Mäuse unterziehen einseitige renale Stiel Klemm gefolgt durch gleichzeitige oder verzögerte kontralaterale Nephrektomie sind. Diese Modelle konsequent führen zu Nierenfunktionsstörungen und posttraumatische Fibrose, aber Verletzungsschwere und Überleben sind abhängig von Maus Hintergrund, Alter und chirurgischen Einrichtungen.

Ischämie-Reperfusion-Modell des akuten Nierenschädigung und nach der Verletzung Fibrose bei Mäusen

Techniken, die zuverlässig und effizient für die Isolierung von Nierenimmunzellen sind, werden für nachgelagerte Anwendungen benötigt. Dies erfordert die Markierung einer kleinen Anzahl von Nierenimmunzellen mit Oberflächenantikörpern. Im Folgenden beschreiben wir eine prägnante Methode zur Isolierung von Immunzellen der Niere, mit der dieses Ziel scheinbar erreicht wird.

Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen

Dieses Protokoll bietet eine kostengünstige Möglichkeit zu isolieren und zu charakterisieren Maus primäre renale tubuläre Zellen, die anschließend südlich kultiviert werden können, um renale biologischen Funktionen ex Vivo, einschließlich der mitochondrialen Bioenergetik zu beurteilen.

Isolierung, Charakterisierung und hohem Durchsatz extrazelluläre Flux-Analyse der Maus primäre renale tubuläre Epithelzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine mit Biotin murinen in Vivo . Dieses Protokoll enthält Informationen zur Maus Nieren durchspülen, Glomeruli zu isolieren und endogenen Immunopräzipitation des Proteins des Interesses durchführen.

Isolierung der Glomeruli und In Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine

Die Kombination aus Antikörperkennzeichnung, optischer Lichtreinigung und fortschrittlicher Lichtmikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Analyse kompletter Strukturen oder Organe. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, um die Immunkennzeichnung dicker Nierenscheiben, die optische Reinigung mit Ethyl-Cinnamat und die konfokale Bildgebung zu kombinieren, die die Visualisierung und Quantifizierung dreidimensionaler Nierenstrukturen ermöglicht.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Diese Arbeit enthält detaillierte Anweisungen, die es den Forschern ermöglichen, eine reversible einseitige Harnleiterobstruktion bei Mäusen unter Verwendung eines standardisierten Modells durchzuführen, das eine Analyse der langfristigen strukturellen und funktionellen Ergebnisse nach der Umkehrung einer anhaltenden Harnleiterobstruktion ermöglicht.

Ein Mausmodell zur Bewertung der langfristigen strukturellen und funktionellen Ergebnisse nach der Umkehrung einer anhaltenden einseitigen Harnleiterobstruktion

Dieser Artikel präsentiert ein ischämisches CKD-Modell unter Verwendung einer einseitigen nierenen IRI mit kontralateraler Nephrektomie, die einen Tag vor der Probenentnahme durchgeführt wird; dieses Protokoll ermöglicht eine serumbasierte funktionelle Beurteilung, ein hohes Überleben und reproduzierbare CKD-Pathologie nach 28 und 42 Tagen und bietet eine vielseitige Plattform für mechanistische und interventionelle Studien.

Mausmodell des Übergangs von akuter zu chronischer Nierenerkrankung, induziert durch Nierenischämie/Reperfusionsverletzung

Ein Laser-Speckle-Kontrastbildgebungssystem wurde verwendet, um die Veränderungen im renalen mikrovaskulären Blutfluss während einer einseitigen Nierischämie-Reperfusion nach der Resektion der rechten Niere bei Mäusen zu überwachen.

Mikrovaskuläre Perfusion überwacht durch Laser-Speckle-Kontrastbildgebung während der Nierenischämie-Reperfusionsverletzung bei Mäusen

Erfahren Sie die isoliert perfundierte Nieren-Technik bei der Maus für Nephrologie-Forschung. Diese Methode ermöglicht die Analyse der Nierenfunktion ex vivo ohne systemische Einflüsse und liefert wertvolle Erkenntnisse zur akuten Nierenverletzung.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

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