Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die isolierte Nierenfunktion in einer ex vivo perfundierten Mausniere zu analysieren. Ausgeschlossen ist der Einfluss von Blutdruck, Hormonen oder dem vegetativen Nervensystem. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Nefrologie zu beantworten.

Es gibt Einblicke in die isolierte Organfunktion und dient als elegantes Werkzeug zur Untersuchung akuter Nierenschäden. Der Hauptvorteil des IPK besteht darin, dass die Organfunktion ohne systemische Einflüsse untersucht wird. Nachdem Sie die Maus für die Operation vorbereitet haben, führen Sie mit einer Schere eine mittlere Laparotomie vom Schamkamm bis zum Brustbein durch.

Öffnen Sie zuerst die Haut und dann die Bauchmuskeln. Entfernen Sie anschließend den Darm und legen Sie ihn seitlich vom Bauch auf die linke Seite der Maus. Befreien Sie nun die Blase vom Bindegewebe und legen Sie sowohl die Harnleiter als auch die Harnröhre frei.

Platzieren Sie bei diesen Eingriffen alle Ligaturen mit 5-0-Nähten. Die erste Ligatur, die platziert wird, befindet sich um den linken Harnleiter. Verschließen Sie diesen fest mit einem doppelten chirurgischen Knoten.

Platzieren Sie als Nächstes eine Ligatur um die Harnröhre mit der gleichen Technik. Legen Sie dann eine Lasso-Ligatur um die gesamte Blase, aber lassen Sie sie losgebunden. Wenn die ersten drei Nähte an Ort und Stelle sind, machen Sie mit einer Augenschere einen einen Millimeter langen Schnitt in die Blase.

In diesen Schnitt setzen Sie eine Kanüle aus zwei Zentimetern PE-50-Schlauch ein. Schließen Sie nun die Ligatur, die die Blase mit dem Lasso versorgt und die Kanüle sichert. Schneiden Sie nun mit der Kanüle der Blase den linken Harnleiter und die Harnröhre distal von den Ligaturen ab.

Die Blase sollte nun nur noch am rechten Harnleiter befestigt sein und sich frei bewegen. Entfernen Sie anschließend das Bindegewebe und das Fett, das die Bauchaorta umgibt. Platzieren Sie dann Ligaturen um den Mittelpunkt der freiliegenden Aorta und direkt unter dem Zwerchfell zwischen der Arteria mesenterica superior und dem Truncus coeliacus.

Halten Sie auch diese locker. Legen Sie anschließend eine Ligatur um die Arteria mesenterica superior. Platzieren Sie nun eine dritte Ligatur um die Aorta direkt unterhalb der rechten Nierenarterie und oberhalb der linken Nierenarterie.

Dies ist die Ligatur Nummer sieben. Zum Schluss legen Sie eine Ligatur um das kaudale Venenpaket. Platzieren Sie nun eine Klemme zwischen der Ligatur Nummer sieben und der Verzweigung der linken Nierenarterie.

Machen Sie dann einen kleinen Schnitt in der Aorta, kaudal bis Ligatur sieben, achten Sie darauf, die Rückenwand nicht zu durchtrennen und die Öffnung mit einem Gefäßdilatator zu dehnen. Führen Sie eine zwei Zentimeter lange PE-50-Kanüle in die Öffnung ein und schieben Sie die Spitze gerade in die Klemme. Öffnen Sie dann die Klemme.

Schieben Sie dann die Spitze der Nadel nach vorne, bis sie den Übergang zwischen der rechten Nierenarterie und der Aorta erreicht. Schließen Sie nun die Ligatur sieben und dann die Ligatur in der Mitte der Bauchaorta. Öffnen Sie die Brust mit einer Schere, indem Sie das Zwerchfell präparieren.

Trennen Sie dann mit einem einzigen Schnitt die Aorta, die Hohlvene, das Herz und die vegetativen Nerven. Starten Sie nun die Druckregelung der Perfusionspumpe und halten Sie den mittleren Druck zwischen 80 und 100 Millimeter Quecksilbersäule. Schließen Sie nun die drei verbleibenden ungebundenen Ligaturen um die Aorta und das Schwanzvenenpaket.

Befreien Sie mit einer Schere die rechte Niere vom umgebenden Bindegewebe und lösen Sie sie aus der Fettkapsel. Schneiden Sie die Aorta proximal zur Ligatur zwischen der Arteria mesenterica superior und dem Truncus coeliacus ab. Schneiden Sie anschließend die Arteria mesenterica superior distal zur Ligatur um die Arteria mesenterica superior.

Entfernen Sie nun das Bündel der Nierenstützgefäße und achten Sie darauf, dass Sie nicht in die Gefäße selbst schneiden. Schneiden Sie dann die Leber an der Verbindung zur Niere durch, lassen Sie aber einen kleinen Teil der Leber daran befestigt, so dass die Hohlvene von ihr offen gehalten wird. Der nächste Schritt besteht darin, das Nierenbündel aus der Maus zu entfernen.

Lassen Sie nun die Niere in der Kammer und entfernen Sie die Maus. An der Verbindung zwischen Leber und Niere wird eine Lasso-Ligatur platziert. Dann kanülieren Sie die Hohlvene mit einem venösen Zugang und schließen die Lasso-Ligatur.

Die Niere sollte nun stabil in der Box sitzen. Der venöse Abfluss durch die Venenlinie sollte sofort beginnen. Der Urinabfluss beginnt nach etwa drei Minuten.

Die Peristaltik des Harnleiters sollte sofort beginnen und mindestens eine Stunde lang stabil bleiben. Schließen Sie die Box. Die Zubereitung ist nun abgeschlossen und sollte mindestens eine Stunde lang lebensfähig bleiben.

Nach Anwendung der beschriebenen Methode an C57 black 6 Mäusen wurde die Gewebeviabilität von vier Nieren nach einer Stunde kontinuierlicher Perfusion getestet. Der Druck wurde kontinuierlich bei 100 Millimetern Quecksilbersäule gehalten. Der Perfusatfluss und der Gefäßwiderstand blieben in allen vier Nieren konstant.

Die glomeruläre Filtrationsrate wurde mit Hilfe der FITC-Inulin-Clearance bestimmt, die im Laufe der Zeit zunehmen sollte, aber nicht signifikant anstieg. Die fraktionierte Ausscheidung von Natrium und Kalium wurde nach 55-minütiger Perfusion beurteilt. Diese Parameter nahmen im Vergleich zur in vivo-Situation zu.

Nach 55 Minuten stieg die Molalität der Urinale nicht über die Osmolalität des venösen Abflusses an. Anschließend wurden die Nieren fixiert und ihre Ultrastruktur mit TEM beurteilt. Die Glomeruli in den S1-Segmenten der proximalen Tubuli erschienen weitgehend unverändert.

Einige, aber nicht alle S2-, S3-Segmente der proximalen Tubuli in den dicken aufsteigenden Gliedmaßen, die sich nicht in der Nähe der Gefäßbündel befanden, zeigten Anzeichen einer Organschädigung. Bei näherer Betrachtung zeigten die distalen gewundenen Tubuli und Sammelkanäle keine Anzeichen von Nekrose. Insgesamt spiegelten die Nieren das wider, was für von Ratten isolierte perfundierte Nieren berichtet wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können Analysemethoden wie Bildgebung oder Fakten mit anschließender Protein- oder RNA-Analyse am Gewebe durchgeführt werden, um weitere Erkenntnisse zu gewinnen.