Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in In Vitro Cancer Models

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, den Zusammenhang von aberrantem Spleißen mit Arzneimittelresistenzprofilen in in vitro-Modellen von soliden Tumoren und hämatologischen Malignomen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der molekularen Pharmakologie und der Chemotherapieresistenz zu beantworten, z. B. welche Mechanismen der Arzneimittelresistenz auf posttranskriptioneller Ebene zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein gut etabliertes Zytotoxizitäts-Screening-Protokoll mit einer leistungsstarken Transkriptomanalyse auf Basis von Next-Generation-Sequencing kombiniert.

Diese Technik könnte zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die dem Versagen von Chemotherapien zugrunde liegen, und sie wird die Früherkennung von Arzneimittelresistenzen verbessern. Diese Methode kann Einblicke in genomweite Determinanten von Arzneimittelresistenzen in Zelllinienmodellen geben. Es kann aber auch auf andere Systeme wie Primärpatientenproben und Xenotransplantate angewendet werden.

Verfahren wird von Johan Fomirno, einem Techniker aus unserem Labor am Cancer Center Amsterdam, demonstriert. Um den MTT-Assay für leukämische Zellen durchzuführen, bereiten Sie eine 96-Well-Versuchsplatte mit flachem Boden vor. Widmen Sie Vertiefungen für Arzneimittelkonzentrationen zur Kontrolle von Zellen und zur Kontrolle von Medien ohne Zellen.

Bereiten Sie einen Verdünnungsbereich für Dexamethason oder Dex vor. Geben Sie 30 Mikroliter aus jeder Dex-Verdünnung in eine geeignete Vertiefung der 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass Sie jede Konzentration in dreifacher Ausfertigung angeben.

Ernten Sie exponentiell wachsende leukämische Zellen und suspendieren Sie sie bei optimaler Aussaatkonzentration wieder. Geben Sie 120 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung, die entweder die Arzneimittellösung oder das Wachstumsmedium enthält, und inkubieren Sie 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Geben Sie nach dem Inkubationsschritt 15 Mikroliter MTT-Reagenz mit einer wiederholten Pipette in jede Vertiefung.

Schütteln Sie die Platte fünf Minuten lang mit einem Plattenschüttler bis zu einem Maximum von 900 Schütteln pro Minute. Stellen Sie die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid wieder in einen Zellkultur-Inkubator und inkubieren Sie weitere vier bis sechs Stunden. Achten Sie nach der Inkubation darauf, die Formazankristalle gründlich wieder zu suspendieren, da die Absorptionswerte von der richtigen Solubilisierung der Verbindung abhängen.

Geben Sie 150 Mikroliter des angesäuerten Isopropanols in jede Vertiefung und mischen Sie die Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, um alle Formazankristalle gründlich wieder zu suspendieren. Bestimmen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die optische Dichte oder den Außendurchmesser bei 540 und 720 Nanometern, um eine genaue Messung durch Korrektur des Hintergrunds zu gewährleisten, OD.To führen Sie einen SRB-Assay für Pankreaskarzinomzellen durch und bereiten Sie eine 96-Well-Versuchsplatte mit flachem Boden vor. Pankreaskarzinomzellen säen, die in exponentieller Phase in dreifacher Ausführung in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden bei der entsprechenden Dichte in 100 Mikrolitern Medium wachsen, indem sie eine Mehrkanalpipette verwenden.

Fügen Sie 100 Mikroliter mittlerer bis mittlerer Vertiefungen hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, um eine ordnungsgemäße Haftung der Zellen auf der Platte zu gewährleisten. Geben Sie 100 Mikroliter aus jeder Verdünnung mit einer Mehrkanalpipette in eine geeignete Vertiefung der 96-Well-Platte. Achten Sie darauf, dass jede Konzentration in dreifacher Ausfertigung ist.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 72 Stunden. Geben Sie anschließend 25 Mikroliter kalte TCA-Lösung mit einer Mehrkanalpipette in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platten mindestens 60 Minuten lang bei vier Grad Celsius, um die Proteine auszufällen und am Boden der Vertiefungen zu fixieren.

Leeren Sie die Platte, indem Sie das Medium entfernen und trocknen Sie sie kurz auf einem Taschentuch ab. Waschen Sie fünfmal mit Leitungswasser, bevor Sie den Teller leeren und bei Raumtemperatur trocknen. Fügen Sie 50 Mikroliter SRB-Lösung pro Vertiefung mit einer wiederholten Pipette hinzu und färben Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Leeren Sie dann die Platte, indem Sie den SRB-Fleck entfernen. Nachdem Sie den Teller viermal mit 1% Essigsäure gewaschen haben, leeren Sie den Teller und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur trocknen. Fügen Sie 150 Mikroliter Tris-Lösung pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette hinzu und mischen Sie sie drei Minuten lang auf einem Plattenschüttler bis zu einem Maximum von 900 Shakes pro Minute.

Lesen Sie die optische Dichte bei 540 Nanometern ab. Schleudern Sie die Proben drei Minuten lang bei 300 mal g herunter. Nach Entfernen des Überstands wird die Gesamt-mRNA mit kommerziell erhältlichen Siliziumdioxidmembran-Spin-Säulen extrahiert

Bestimmen Sie die Konzentration und Reinheit der Gesamt-RNA mit einem UV-Vis-Spektrophotometer. Verwenden Sie zur Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek zwei Mikrogramm Gesamt-mRNA pro Probe. Befolgen Sie das Protokoll zur Vorbereitung der mRNA-Bibliothek gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Nachdem Sie die Bibliotheken in einer einzigen Probe bis zu einer Endkonzentration von 10 Nanomol pro Liter mit einem Bioanalysator gepoolt haben, verwenden Sie ein Hochdurchsatz-Sequenzierungssystem mit einem einzigen Lesemodus mit 100 Basenpaaren. Gestalten Sie alle Primer wie im Textprotokoll beschrieben. Für die Erststrang-cDNA-Synthese richten Sie die reverse Transkription von einem Mikrogramm der isolierten RNA in cDNA ein, indem Sie 200 Einheiten pro Mikroliter der Reverse-Transkriptase des Moloney-Maus-Leukämievirus in ihrem Reaktionspuffer verwenden, der eins bis fünf mit sterilem Wasser verdünnt wird.

Um die RT-PCR-Reaktion durchzuführen, fügen Sie der PCR-Reaktionsmischung einen Mikroliter cDNA hinzu und legen Sie die Röhrchen in den Thermocycler. Führen Sie das Programm wie im Textprotokoll beschrieben aus. Nach der PCR werden die Proben in ein 1%Agarose-Gel geladen und das Gel in FSME-Puffer bei 100 Volt für ca. 30 Minuten in einem Elektrophoresesystem laufen lassen.

Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie während der Durchführung des qRT-PCR-Assays Filterspitzen. Um die qRT-PCR durchzuführen, bereiten Sie eine cyaningrüne PCR-Reaktionsmischung für jede spezifische Spleißvariante vor, die nachgewiesen werden soll, sowie für das Housekeeping-Gen. Laden Sie den Mastermix auf eine weiße 96-Well-Platte und bereiten Sie Duplikate für jede Probe vor.

Fügen Sie jeder Mischung fünf Mikroliter cDNA hinzu, die 10-mal in Wasser verdünnt sind, bevor Sie die Platte in den Thermocycler stellen. Hier sind Wachstumshemmungskurven dargestellt, wie sie mit dem MTT-Assay für leukämische Zellen und dem SRB-Assay für Pankreaskarzinomzellen bestimmt wurden. Die Kurven für Dexamethason-resistente und Gemcitabin-resistente Zellen sind nach rechts verschoben, was auf eine Wachstumshemmung im Vergleich zu den elterlichen sensitiven Zellen hinweist.

Die Konzentration und Qualität von cDNA-Bibliotheken für alle Zelllinien wird mit einem Bioanalysator-DNA-Chip bestimmt. Elektropherogramme zeigen Fluoreszenzpeaks bei etwa 300 Basenpaaren, was auf eine gute Qualität für die anschließende RNA-Sequenzierung hinweist. Kurze Lesevorgänge des Genkandidaten DDX5 können als Sashimi-Diagramme visualisiert werden, wobei Verbindungslinien Spleißverbindungen darstellen.

Das DDX5-Transkript zeigt eine unterschiedliche Verwendung von Exon-12- und CEM-Wildtyp- und CEM/R30dm-Zellen im Vergleich zu den Glukokortikoid-resistenten Zelllinien CEM-C3 und CEM-R5. Die Ergebnisse der RNA-Sequenzierung werden durch RT-PCR an ausgewählten Genen validiert, für die Primerpaare und Yield an Exons vorhanden sind, die sich stromaufwärts und stromabwärts des alternativ gespleißten Exons befinden. Hier ist das differentielle Spleißen des DDX5-Gens dargestellt.

Die Quantifizierung von differentiell gespleißten Transkripten mittels qRT-PCR-Assay unter Verwendung isoformspezifischer reverser Primer bestätigt die spezifische Herunterregulierung der DDX5 delta Exon 12 Spleißvariante und einer spezifischen Glukokortikoid-resistenten Unterlinie. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Wochen durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, RNA-Proben auf Eis zu legen, um einen Abbau zu vermeiden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die ektopische Überexpression einer neuen Spleißvariante, durchgeführt werden. Dies wird zusätzliche Fragen beantworten, wie z.B. den funktionellen Einfluss des alternativen Spleißprofils auf die Arzneimittelresistenz. Diese Technik kann den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der molekularen Pharmakologie ebnen, um genomweite Determinanten von Arzneimittelresistenzen zu erforschen.