Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proben mit geringer Zellzahl vorzubereiten, um eine TEM-Analyse auf effiziente und reproduzierbare Weise durchzuführen. Diese Methode kann dazu beitragen, alle Strukturen echter Zellen aufzudecken und physiologische Einstellungen im biomedizinischen Bereich zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl qualitative als auch quantitative Ergebnisse aus niedrigen Zellzahlen auf reproduzierbare Weise erzielt werden können.

Verwenden Sie zunächst Fakten, um 10.000 hämatopoetische Stammzellen oder HSCs in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu sortieren. Enthält 600 Mikroliter isocoves modifiziertes Dulbecco-Medium mit 10% FBS. Mit einer Zentrifuge mit ausschwenkbaren Eimern werden die sortierten HSCs 10 Minuten lang bei 1.000 mal G heruntergeschleudert.

Verwenden Sie eine nichttile Aspiration, um alle bis auf 200 Mikroliter des Mediums zu entfernen. Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie 0,2 ml frisch zubereitete zwei X Fixierlösung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie als nächstes 600 Mikroliter 0,1 molaren Cacodylatpuffer hinzu, um die Zellen zu waschen.

Zentrifugieren Sie die Zellen erneut, diesmal bei 30 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren und Entfernen aller bis auf 200 Mikroliter Puffer fügen Sie 200 Mikroliter von zwei Milligramm Evansblau pro Milliliter in Cacodylatpuffer hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu färben. Verwenden Sie 600 Mikroliter 0,1 molaren Cacodylatpuffer, um die Zellen dreimal zu waschen.

Suspendieren Sie dann die Zellen erneut in den restlichen 200 Mikrolitern Puffer, bevor Sie die Suspension der Zelle in ein 0,5-ml-Röhrchen überführen. Bei diesem Schritt sollte das Pellet im Rohr sichtbar sein. Mit einer Tischzentrifuge die Zellen 10 Minuten lang mit dem 1.000-fachen G drehen.

Entfernen Sie dann vorsichtig den Puffer, ohne das jetzt sichtbare winzige Zellpellet zu stören, und lassen Sie 50 Mikroliter Puffer im Röhrchen. Bereiten Sie eine 4%ige Agaroselösung vor, indem Sie 200 Milligramm niedrigschmelzende Agarose zu fünf Millilitern 0,1 molaren Cacodylatpuffer in einem 15-ml-Röhrchen hinzufügen. Schmelzen Sie die Agarose, indem Sie das Röhrchen in einer 100-ml-Glasflasche in kochendes Wasser geben.

Geben Sie 200 Mikroliter der Agaroselösung in das Röhrchen der Zellsuspension. Sofort bei 1.000 mal G und 30 Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren. Nachdem Sie bestätigt haben, dass die Zellen am Boden des Röhrchens in die halbfeste Agarose pelletiert sind, übertragen Sie das Röhrchen sofort für 20 Minuten auf vier Grad Celsius oder Eis, um die Agarose zu verfestigen.

Übertragen Sie mit einer 27-Gauge-Nadel vorsichtig die erstarrte Agarose, die das Zellpellet enthält, in eine 35-ml-Kunststoff-Petrischale mit 0,1 molaren Cacodylatpuffer. Mit einem Skalpell wird die erstarrte Agarose, die das Zellpellet enthält, in ein etwa ein bis zwei Millimeter großes Stück geschnitten. Füllen Sie es dann in ein neues 1,5-ml-Röhrchen um.

Fügen Sie 600 Mikroliter 0,1 molaren Cacodylatpuffer hinzu und waschen Sie das Agarosezellpellet, indem Sie den Puffer mit einer Pipette hinzufügen und entfernen. Entfernen Sie den Puffer aus dem Agarose-Zellpellet und fügen Sie in einem Abzug mit Schutzkleidung und Handschuhen einen Milliliter 1%ige Osmiumtetroxidlösung hinzu. Inkubieren Sie das Zellpellet eine Stunde lang bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Probe nach der Inkubation dreimal. Geben Sie es in ein 20-ml-Glasszintillationsfläschchen mit einer Kappe. Als nächstes dehydrieren Sie die Probe mit einer Ethanolreihe.

Dann infiltrieren Sie die Probe in steigenden Konzentrationen von LX 112-Harz in Ethanol, bevor Sie sie zweimal für jeweils 60 Minuten in 100 %-Harz inkubieren. Übertragen Sie die Probe mit einer Pinzette vorsichtig auf den Boden einer pyramidenförmigen Gummiform und fügen Sie reines Harz auf die Probe hinzu, um die Form zu füllen. Inkubieren Sie die Probe 72 Stunden lang bei 60 Grad Celsius, um das Harz zu polymerisieren.

Wenn das Harz polymerisiert ist, entfernen Sie es aus den Formen, indem Sie die Gummiform drehen. Ein kleiner schwarzer Zellhaufen sollte in der polymerisierten Harzpyramide sichtbar sein. Verwenden Sie Cyanacrylat, um die polymerisierte Harzpyramide zum Trennen auf einem Montagezylinder zu befestigen.

Nachdem Sie den Block auf ein Ultramikrotom montiert haben, schneiden Sie den Pyramidenblock mit einer Rasierklinge und einem Diamantmesser zu einer kurzen, breiten trapezförmigen Form, bei der die Ober- und Unterseite des Blocks parallel zueinander und mit gleichmäßig abgewinkelten Seiten entstehen. Schneiden Sie dann mit dem Diamantmesser den Block um das Zellpellet herum ab und entfernen Sie die Kunststoffabschnitte um das Agarosestück des Zellpellets. Schneiden Sie mit dem Ultramikrotom einen Mikrometer große Abschnitte aus und bewegen Sie die Abschnitte mit einem Wimpernwerkzeug und einer Metallschlaufe vom Wasserboot auf einen Glasschieber.

Legen Sie die Dias dann zum Trocknen auf eine heiße Platte bei 37 Grad Celsius. Mit einer Spritze mit einem 0,22-Mikrometer-Filter einen Tropfen Teluatinblau-Lösung in die Schnitte geben und drei Minuten lang inkubieren. Dann die Rutschen mit destilliertem Wasser anheben und die Abschnitte trocknen lassen.

Nach dem Trocknen werden die Schnitte unter einem Lichtmikroskop kontrolliert, um die Position der Zellen zu bestimmen. Verwenden Sie anschließend ein Diamantmesser, um ultradünne Abschnitte zu schneiden. Bewegen Sie dann mit einem Wimpernwerkzeug zwei bis drei Abschnitte auf 200 Maschengitter vom Wasserboot und legen Sie sie in eine gläserne Petrischale.

Das Gericht mit den Gittern für 30 Minuten auf eine heiße Platte bei 30 Grad Celsius geben, um die Teile zu trocknen. Geben Sie Tropfen 1%Uranylacetat hinzu und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Gitter zu färben. Spülen Sie dann mit destilliertem Wasser sechs- bis achtmal aus.

Mit Reynolds-Bleicitrat bei Raumtemperatur fünf Minuten lang färben, bevor es sechs- bis achtmal gespült wird. Übertragen Sie die Petrischale aus Glas mit den Gittern auf eine heiße Platte bei 37 Grad Celsius, um die Schnitte zu trocknen. Analysieren Sie abschließend die Schnitte mit einem Elektronenmikroskop bei 87 Kilovolt.

Hier sind bei geringer Vergrößerung halbdünne Toluidinblau gefärbte Schnitte von Blöcken zu sehen, die ein winziges Zellpellet enthalten und einen Zellcluster bestätigen. Dieses Bild mit höherer Vergrößerung zeigt die intakte Morphologie der Zellen. Diese Abbildung stellt ein Sichtfeld des Zellclusters aus ultradünnen Schnitten dar, die mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und mittels Elektronenmikroskopie analysiert wurden.

Hier ist ein einzelnes HSC zu sehen, das zeigt, dass die Morphologie und Ultrastruktur der Zellen gut erhalten geblieben sind. Eine hochdetaillierte elektronenmikroskopische Aufnahme eines einzelnen HSC mit höherer Vergrößerung zeigt die intrazellulären Ultrastrukturen. Darüber hinaus erfassten Bilder mit hoher Vergrößerung eine gut erhaltene Struktur und Integrität subzellulärer Organellen wie Mitochondrien.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden, und für fortgeschrittene Blaufärbung und Agarose-Einbettung dauert die normale TEM-Verarbeitung fünf bis sechs Tage, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie ein gutes Verständnis dafür, wie man Proben aus der Vorbereitung echter Zellen für die TEM-Analyse vorbereitet.