Name: TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Öğrenin, düşük hücre sayılarından TEM analizi için hematopoietik kök hücreleri hazırlama yöntemini. Bu teknik, biyomedikal araştırmalarda hücresel yapıları fizyolojik bağlamda görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi'ndeki elektron mikroskobu analiz çalışmalarına yardımcı oldukları için Patoloji Araştırma Çekirdeği'ne teşekkür ederiz. Çalışma, NIH (Amerikan Hematoloji Derneği Köprü Ödülü-MDF; R01 DK102890 MDF'ye).

Tüm deney prosedürleri Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı kurumsal hayvan komitesi tarafından onaylandı. 4 ay - Bu çalışma için, hematopoetik kök hücreler 2 yaşlı C57BL / 6 kendilenmiş farelerin kemik iliğinden izole edilmiştir. CD34 - - Ayırıcı stratejisi soy c-Kit, Sca-1 de dahil olmak üzere farklı yüzey makinesi BM&#39;nin lekelemeden sonra FACS ile tasnif Celi, Flt3 ve CD34 Lin- Sca-1 + c-Kit + Flt3 göre HSC saflaştırılması için kullanılmıştır standart protokol önce 8 nitelendirdi. DİKKAT: Çeşitli son derece zehirli kimyasallar bu işlem sırasında kullanılır. Bunlar Solunduğunda ve cilt ile temasında toksiktir. eldiven ve koruyucu giysiler giymek edin. Bu kimyasallar ile çalışırken davlumbaz çalışın. 1. Hücreler, Fiksasyon, Boyama ve Pre-gömme <ol><li> Sca-1 - Lin kullanarak sırala 10.000 hematopoetik kök hücreler ( <sup&gt; + c-Kit + Flt3 - CD34 - stratejisini yolluk; ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde LT-HSC popülasyonu) 600 ul FACS kullanılarak,% 10 fetal bovin serumu içeren Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı (IMDM). </li><li> swing-out kova ile bir santrifüj kullanılarak 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 10 dakika süreyle 1000 xg&#39;de sıralı HKH&#39;lerin aşağı doğru döndürün. yavaşça çekilerek Ortamı çıkarın ve her adımda tüplerinde 200 ul ortam bırakın. Bu aşamada, hücre peleti boru içinde görünmez kalır. </li><li> 1 saat 1,9 oda sıcaklığında (RT) 2x sabitleyici çözeltisi, 0.2 ml hücreleri saptamak. <ol><li> Kullanmadan önce fiksatif çözüm taze olun. 1X çözelti, 0.1 M kakodilat tampon içinde% 3 paraformaldehit ve% 2.5 glutaraldehid oluşur. </li></ol></li><li> Santrifüj swing-out kova ile bir santrifüj kullanılarak 30 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 1000 xg&#39;de hücreleri. </li><li> 0.1 M kakodilat tampon 600 ul hücreleri yıkayınsantrifüj kullanılarak ve santrifüjlemeden sonra tüp içinde 200 ul tampon bırakın. </li><li> kakodilat tampon maddesi içinde Evans Mavisi 2 mg / ml solüsyon 200 ul ilave edilmesi suretiyle tespit hücreleri leke ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Hücreler mavi renkli olacak. </li><li> 0.1 M kakodilat tampon kullanarak santrifüj 600 ul hücreleri 3 kere yıkayın ve tüp içinde her zaman 200 ul tampon bırakın. </li><li> 200 ul tampon hücreleri yeniden askıya ve 0.5 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın. bir masa üstü santrifüj kullanılarak 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. yavaşça şimdi görünür küçük hücre pelet bozmadan tamponu çıkarın ve tüp içinde 50 ul tampon bırakın. </li><li> % 4 agaroz çözeltisi 15 ml tüp içinde 0.1 M kakodilat tampon maddesi, 5 ml agaroz 200 mg düşük erime ekleyin. 100 ml&#39;lik bir cam şişeye kaynar su tüpü aktararak agaroz eritin ve kullanılıncaya kadar ılık tutun. </li><li> % 4, erime noktası düşük, 200 ul 0.1 M agaroz cacodyla içinde çözüldü ekleHemen hücre 0.5 ml tüp içinde süspansiyon ve TE tamponu bir masa üstü santrifüj kullanılarak, 30 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Hücreler santrifüj işleminden sonra, yarı-katı bir agaroz 0.5 mi tüpün altındaki topak olduğu doğrulandıktan sonra, hemen agaroz katılaşmaya 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tüp ya da buz aktarın. Bu adım elektron mikroskobu altında hücrelerin iyi bir kümede bu adımı sonuçlarına küçük görünür hücre pelet olarak, bir çok önemlidir. </li><li> Dikkatlice 27 G iğne 3,10 kullanarak tampon içeren bir 35 mm plastik Petri kabı tüpten Hücre topaklarını içeren katılaşmış agaroz aktarın. </li><li> bir neşter ile 2 mm - yaklaşık 1 tek parça içine hücre pelet içeren katılaşmış agaroz Trim. yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe Hücre topaklarını içeren agaroz parça aktarın. </li><li> ekleme ve santrifüj olmadan pipet kullanarak tampon kaldırarak 0.1 M kakodilat tampon 600 ul kullanarak 3 kez - 2 yıkayın. Bir sonraki adım için hücre pelet içeren bu agaroz parça kullanın. Bu adımda, numune bir gece boyunca bir sonraki adıma geçmeden önce 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 2. Osmification, Dehidrasyon, Gömme <ol><li> Hücre topağı bir pipet kullanılarak agaroz ihtiva eden 1.5 mi tüp kakodilat tamponu çıkarın. Bir çeker ocak içinde% 1 ozmiyum tetraoksit 1,0 ml (OsO 4) çözeltisi ekleyin ve 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 0.1 M kakodilat tamponu, 600 | il ile üç kere yıkanır ve bir kap ile 20 mL&#39;lik bir cam sintilasyon şişesine örnek aktarmak. </li><li> Dehidrasyon, infiltrasyon örnek işlenir ve reçine içine gömülü (örneğin, LX-112), bir 6 yuvalı plaka aşağıdaki çözümleri seri değişiklikleri. forseps kullanarak hücre pelet agaroz taşı. <ol><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 25 etanol içinde örnek bırakın. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 50 etanol içinde örnek bırakın. </li><li> % 75 örnek daldırın15 dakika boyunca oda sıcaklığında etanol. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 95 etanol içinde örnek bırakın. </li><li> iki kez, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 100 etanol içinde örnek bırakın. </li><li> etanol örnek daldırın: reçine (3: 1), oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı. </li><li> etanol örnek daldırın: Reçine (1: 1), oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı. </li><li> etanol örnek daldırın: Reçine (1: 3), oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı. </li><li> iki kez, 60 dakika boyunca oda sıcaklığında saf reçine numune bırakın. </li></ol></li><li> dikkatle forseps kullanılarak piramit şekilli uç lastik kalıp tabanına örnek aktarın ve kalıp doldurmaya numunesinin tepesine daha fazla saf reçine ilave edin. Reçine polimerizasyonu için 72 saat boyunca 60 ° C &#39;de örnek inkübe edin. </li><li> lastik kalıp bükerek kalıplardan polimerize reçine piramit çıkarın. Daha önce 7 açıklandığı gibi hücrelerin küçük siyah küme, polimerize reçine piramit görünür olmalıdır. siyanoakrilat kullanarak montaj silindir üzerinde polimerize reçine piramit takın. </li></ol><ol><li> Bir jilet ve ultra-mikrotom bloğu monte edildikten sonra bir elmas bıçak ile piramit bloğu Trim. üst ve birbirine bloğu paralel alt kısa bir geniş trapezoid şekli olun ve eşit açılı kenarları. Piramidin Bu şekil seri kesit için yardımcı olur. </li><li> Ayrıca, elmas bıçak ile hücre pelet etrafında blok kırpın ve hücre pelet agaroz parçası etrafında plastik bölümleri kaldırın. </li><li> ultra-mikrotom kullanılarak 1 um kesitler halinde kesilmiştir. Bir kirpik aracı ve daha önce 7 rapor gibi bir metal döngü aracını kullanarak bir bardak slayt su tekne 1 mikron bölümleri taşıyın. Kurutma için sıcak plaka (37 ° C) slaytlar ve transfer kızaklar üzerinde aktarma bölümleri. </li><li> 0.22 um bir filtre ile donatılmış ve 3 dakika boyunca inkübe bir şırınga kullanılarak bölümlere toluidin mavi bir çözelti damla ekleyin. distile su ve l ile slaytlar durulayınet bölümler kurulayın. Hücrelerin konumunu tanımlamak için bir ışık mikroskobu ile kontrol edin. </li><li> Bir elmas bıçak kullanarak - (100 nm 70) ultra-ince kesitler halinde kesilmiştir. Bir kirpik aracını kullanarak bir cam Petri kabı su tekne 200 mesh ızgaraları 3 bölümden - 2 taşıyın. </li><li> 30 dakika boyunca bölümler kuru, 30 ° C&#39;de bir sıcak plaka bölümleri olan ızgaraları ihtiva eden cam bir Petri tabağına aktarın. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 1 uranil asetat ile damla ızgaraları Leke ve damıtılmış su içinde 6 yıkayın - 8 defa. 8 kat - Reynolds ile Leke 6 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, sitrat, kurşun ve damıtılmış su içinde durulayın. bölümler kuru, 37 ° C&#39;de bir sıcak plaka ızgaraları ihtiva eden cam bir Petri tabağına aktarın. </li><li> 80 kV 7 de, bir elektron mikroskobu ile bölümleri analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
<li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ulstract+Res%22%5BJournal%5D)">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li>
<li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li>
<li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li>
<li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+%28TEM%29+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactions+between+formaldehyde%2C+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide%2C+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li>
<li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils%3A+immunocytochemical%2C+molecular%2C+and+biochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yöntem, Evans mavisi boyama kullanarak ve agaroz dehidratasyon, reçine gömme sırasında küçük bir hücre pelletini lokalize gömme ve süreçleri kesit ile, düşük hücre sayıları TEM analizi sağlar. Daha da önemlisi, bu arada, hücre kümeleri korur ve verilerin ölçümü için çok sayıda hücreleri incelemek için arzu edilir, hücre ultra yapısını korur. TEM çalışmalarda, milyonlarca hücreleri ihtiva eden bir hücre pelleti genellikle çok sayıda hücre veri elde etmek için bir agaroz / jelatin matrisine...

Hücrelerin Ultra yapısal ve alt organel ayrıntıları ağırlıklı transmisyon elektron mikroskobu (TEM) doku veya hücre pelet 1,2 dan çalışmalar tarafından ortaya konmuştur. dokuların katı parçaları kolayca elektron mikroskopisi çalışmaları için kullanılabilir. Ancak, TEM süspansiyon hücreleri üzerinde 1,3 zorlu kalır ve yüksek hücre yani sayıları, hücrelerin milyonlarca gerektiren analiz eder. Bu nedenle, süspansiyonun nadir hücre popülasyonlarının ultra yapısal analizi, örneğin, hematopoietik kök hücreler (HSC), kolayca değerlendirilmemektedir. sitospin veya tek katmanlı yaklaşımları kullanarak kıt örneklerden TEM analizi için birden fazla girişimleri hücrelerin sınırlı sayıda önemli nicel veriler elde etmek için başarısız. Bu nedenle, yüksek hücre sayısı gereksinimi nadir hücre popülasyonlarının hücre içi ultrastrüktürel detaylarını anlamak için bu güçlü aracın kullanımını sınırlar. Hücrenin sınırlı sayıda TEM çalışmalar için önemli bir sınırlamasısüspansiyondaki s işleme hücre lokalizasyonu ve bu nedenle, özellikle küçük boyutları ile sınırlıdır hücrelerden TEM çalışmaları zor olmaya devam etmektedir. Birkaç alternatif yaklaşımlar bu sınırlama karşı kabul edilmiştir: BSA / bisakrilamid (BSA-BA) hücre süspansiyonu aracılı polimerizasyon, lamelleri içeren ince bir film desteğine onları görünür hale getirmek için bir boya ile hücrelerin boyanması, ve TEM sitospin hazırlıkları 4-6 analizleri. Çok az sayıda hücre ultra kesit sonra bölümlerde bulundu Ancak, çok sınırlı bir başarı elde edilmiştir. Hücre tek tabaka kesit için katılaşmış jel çoğunlukla görünmez kalır çünkü seyrek hücrelerin belirlenmesi önemli zorluk devam etmektedir. Ayrıca, hücrelerin Sitospin hazırlanması nedeniyle hücre yayılması ve hücre yapısının kırılganlık kendi hücresel organizasyonu değiştirebilir. Bu nedenle, bu doğal sakıncaları daha nadir hücre popülasyonlarının TEM çalışmaları yapmak için yeni bir yaklaşım garantitutarlılık. Bu sorunu aşmak için, nadir bir hücre popülasyonlarının 7 TEM çalışmalar için bir yeni ve alternatif örnek hazırlama yöntemi tanımlamaktadır. Burada, tutarlı nitel ve nicel sonuçları ile kıt biyolojik örneklerden TEM gerçekleştirmek için etkili bir örnek hazırlama protokolü sunduk. Evans mavisi boyama, aksi takdirde görünmez kalacaktı düşük sayı hücreleri, yani 10.000 kemik iliği hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden küçük bir hücre pelletini yerelleştirilmesine fiksasyon sonra yapıldı ve pelet dehidratasyon ve reçine gömme süreçlerine önce agaroz içine gömülü edildi. Bu yöntem bir arada hücreleri kümeleri ve ultrastrüktürü ve (Lin olarak tanımlanan - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -; HSC) hematopoetik kök hücrelerin hücre içi organizasyonun verimli analiz sağlar, nadir 0,2-0,5% hücre popülasyonu kemik iliğinde. Bu deneysel protokol ultra yapısal çalışmalar yapmak ve çok nadir ama çok önemli popülasyonları üzerindeki nicel sonuçlar elde etmek yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehit% 20 Sulu Soln Elektron</td><td>mikroskobu Sciences</td><td>15713</td><td>DİKKAT < / güçlü> Soluma, cilt teması yoluyla toksiktir. Eldiven giyin, davlumbaz kullanın.</td></tr><tr><td>Gluteraldehit% 70 Sulu Soln Elektron</td><td>mikroskobu Sciences</td><td>16350</td><td>DİKKAT < / güçlü> Soluma, cilt teması yoluyla toksiktir. Eldiven giyin, davlumbaz kullanın.</td></tr><tr><td>Kakodidat tamponu&nbsp;</td><td>Elektron mikroskobu Bilimleri</td><td>12300</td><td>Damıtılmış suda 0,1 M Kakodidat tamponu (pH 7,4) yapın, 4 ° C'de saklayın. <güçlü>DİKKAT</güçlü> Soluma veya cilt teması ile tahriş edici, eldiven giyin ve çeker ocakta çalışın.</td></tr><tr><td>Evans Mavi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum tetraoksit</td><td>Elektron mikroskobu Sciences</td><td>19130</td><td>%2 OsO4 stok yapmak için 50 ml 0.1 M kakohidrat tamponunda 1 g, <güçlü>DİKKAT</güçlü> Soluma veya cilt teması ile çok toksik, güçlü oksitleyici, koruyucu giysi giyin, göz koruması, davlumbaz kullanın.</td></tr><tr><td>LX-112 Gömme Kitleri (LADD&reg;)</güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DDSA (Dodecenylsüksinik anhidrit)</td> <td>LADD</td><td>21340</td><td>% 16 DDSA'yı karıştırın;% 30 NMA;% 54 LX-112 birlikte ve ardından% 1.4 DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadik metil anhidrit)</td> <td>ekleyinLADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi Reçineler Epon 812 (LX-112)</td> <td>LADD</td><td>21310</td> <td>< güçlü > DİKKAT < / güçlü> Solunması, cilt teması ile toksiktir. Eldiven, koruyucu kıyafet giyin, çeker ocak kullanın.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri (dimetilaminometil) fenol)</td> <td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds kurşun sitrat (EM Leke II)</td> <td>Leica</td><td></td> <td>< güçlü > DİKKAT < / güçlü> Solunması halinde toksiktir, cilt veya gözlerle temasından kaçının.</td></tr><tr><td>Uranil asetat (EM Leke I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td><güçlü>DİKKAT </güçlü> Solunması halinde toksiktir, cilt veya gözlerle temasından kaçının.</td></tr><tr><td>Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Orta (IMDM)</td> <td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>bileşimi: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glikoz, Ca, Mg, sod piruvat etc. Detaylar için https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Piramit uçlu kalıp&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>montaj silindirleri</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-mikrotom&nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 örgü ızgaraları (nikil)</td> <td>Elektron mikroskobu Bilimleri</td><td>G-200 Ni Elektron</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Hitachi modeli H-7650 &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntü yakalama motoru yazılımı</td><td>AMT-600&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastik Petri kapları</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Süper yapıştırıcı Siyanoakrilat&nbsp;</td><td>Elektron mikroskobu Bilimleri</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam parıldama şişeleri&nbsp;</td><td>Fisher bilimsel&nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Cam kaydıraklar&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kirpik aracı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal Döngü aracı&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tem analizi için düşük hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), hücresel organizasyon ve ultrastrüktürü ayrıntılı bilgi sağlar. Bununla birlikte, bu hematopoietik kök hücreler (HSC), nadir hücre popülasyonlarının, süspansiyon içinde, özellikle hücre TEM analizi, numune hazırlanması sırasında yüksek hücre sayısı şartı ile sınırlı kalmaktadır. Orada kıt örneklerden TEM analizi için birkaç sitospin veya tek katmanlı yaklaşımlar vardır, ancak bu yaklaşımların hücrelerin sınırlı sayıda önemli nicel veriler elde etmek için başarısız. Burada, TEM çalışmalarda numune hazırlanması için bir seçenek ve yeni bir yaklaşım kantitatif analiz sağlar nadir hücre popülasyonları için tarif edilmektedir. Nispeten düşük bir hücre sayısı, yani, 10,000 HSC hücreleri, başarılı bir şekilde, tipik olarak, TEM çalışmaları için kullanılan hücrelerin, milyonlarca göre TEM analizi için kullanıldı. Özellikle, Evans mavisi boyama paraformaldehit-glutaraldehit sonra minik hücre PEL görselleştirmek için (PFA-GA) tespit yapıldıAgaroz gömme kolaylaştırdı, izin verin. Çok sayıda hücre kümeleri, ultra ince bölümler tespit edilmiştir. Hücreler iyi korunmuş morfolojiye vardı ve Golgi kompleksi ve çeşitli mitokondri ultra-yapısal ayrıntıları görünür. Bu, etkin olarak kolay ve tekrarlanabilir bir protokol, düşük hücre sayısı örnek hazırlama izin verir ve sınırlı biyolojik numunelerden nadir hücre popülasyonları üzerinde nitel ve nicel TEM analizi için kullanılabilir.

Numune hazırlama için verimli ve tutarlı protokol hücrelerin sayısının düşük açıklanan TEM analizi gerçekleştirmek için. Evans mavisi ve 0.5 ml mikrosantrifüj tüp hücreleri transferi ile post-fiksasyon boyama minik hücre pelletini 7 görselleştirmek yardımcı oldu. Agaroz osmiyum tetraoksit ile Osmification dehidrasyon ve gömme sırasında koyu renkli hücre peleti kolay bir algılama yol açtı. Küçücük bir hücre pelletini...

Burada, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) analizi için düşük hücre sayılı numunelerin hazırlanmasına yönelik bir protokol sunuyoruz.

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Bu prosedürün genel amacı, TEM analizini verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştirmek için düşük hücre sayılı örnekler hazırlamaktır. Bu yöntem, biyomedikal alanda gerçek hücrelerin tüm yapılarının ve daha iyi fizyolojik ayarların ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, düşük hücre sayılarından hem kalitatif hem de kantitatif sonuçların tekrarlanabilir bir şekilde elde edilebilmesidir.Başlamak için, FACS kullanarak 10.000 hematopoetik kök hücreyi (HSC) %10 FBS içeren 600 µL isocoves modifiye dulbecco ortamının bulunduğu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ayırın. Sallanan kova sistemine sahip bir santrifüj kullanarak, ayrıştırılan HSC'leri 1.000 ×g'de 10 dakika boyunca çöktürün.Besiyerinin 200 µL'si hariç geri kalanını nazikçe aspire ederek uzaklaştırın. Hücreleri tespit etmek için yeni hazırlanmış 2X tespit çözeltisinden 0.2 mL ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, hücreleri yıkamak için 600 µL 0.1 M kakodilat tamponu ekleyin.Hücreleri bu kez 30 °C'de tekrar santrifüjleyin. Ardından santrifüj işleminden sonra, 200 µL dışındaki tüm tamponu uzaklaştırın, cacodylate tamponu içerisinde 2 mg/mL evans blue'dan 200 µL ekleyin ve hücreleri boyamak için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Hücreleri üç kez yıkamak için 600 µL 0.1 M cacodylate tamponu kullanın.Ardından, hücre süspansiyonunu 0,5 mL'lik bir tüpe aktarmadan önce hücreleri geri kalan 200 µL tampon çözeltide yeniden süspande edin. Bu aşamada, tüpteki pelet görünür olmalıdır. Masaüstü bir santrifüj kullanarak hücreleri 1.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, artık görünür hale gelen küçük hücre peletini rahatsız etmeden tamponu nazikçe uzaklaştırın ve tüpte 50 µL tampon bırakın. 15 mL'lik bir tüp içerisinde beş mL 0.1 M kakodilat tamponuna 200 mg düşük erime noktalı agaroz ekleyerek %4'lük bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Tüpü 100 mL'lik cam bir şişe içindeki kaynayan suya aktararak agarozu eritin.Hücre süspansiyonu tüpüne 200 µL agaroz çözeltisi ekleyin. Hemen 1,000 ×g'de ve 30 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Hücrelerin tüpün dibindeki yarı katı agaroz içinde çöktüğünü doğruladıktan sonra, agarozun katılaşması için tüpü hemen 20 dakika boyunca 4 °C'ye veya buza aktarın.27 gauge bir iğne kullanarak, hücre peletini içeren katılaşmış agarozu, 0.1 molar kakodilat tamponu içeren 35 mL'lik plastik bir petri kabına dikkatlice aktarın. Hücre peletini içeren katılaşmış agarozu bir skalpel yardımıyla yaklaşık bir ila iki milimetrelik tek bir parça halinde kesin. Ardından bu parçayı yeni bir 1.5 mL'lik tüpe aktarın.600 µL 0.1 M kakodilat tamponu ekleyin ve bir pipet yardımıyla tamponu ekleyip çekerek agaroz hücre peletini yıkayın. Tamponu agaroz hücre peletinden uzaklaştırın ve çeker ocak içerisinde, koruyucu kıyafet ve eldiven giyilmiş haldeyken, bir mililitre %1 osmiyum tetroksit çözeltisi ekleyin. Hücre peletini 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, örneği üç kez yıkayın. Örneği kapaklı 20 mL'lik cam bir sintilasyon şişesine aktarın. Ardından, etanol serisi kullanarak örneğiye dehidre edin.Ardından, örneği artan konsantrasyonlardaki etanol içindeki LX 112 reçinesi ile sızdırın ve ardından %100 reçine içerisinde her biri 60 dakika sürecek şekilde iki kez inkübe edin. Pens kullanarak örneği dikkatlice piramit uç şeklindeki bir kauçuk kalıbın tabanına yerleştirin ve kalıbı doldurmak için örneğin üzerine saf reçine ekleyin. Reçineyi polimerize etmek için örneği 60 °C'de 72 saat boyunca inkübe edin.Reçine polimerize olduğunda, kauçuk kalıbı çevirerek reçineyi kalıplardan çıkarın. Polimerize olmuş reçine piramidinin içinde küçük siyah bir hücre kümesi görülmelidir. Kesit alma işlemi için polimerize olmuş reçine piramidini bir montaj silindirine sabitlemek üzere siyanoakrilat kullanın.Blok ultramikrotoma monte edildikten sonra, piramit bloğu düzeltmek için bir jilet ve elmas bıçak kullanarak; bloğun üst ve alt kısımları birbirine paralel ve yanları eşit açılı olacak şekilde kısa, geniş bir yamuk şekli oluşturun. Ardından, hücre peleti çevresindeki bloğu düzeltmek için elmas bıçağı kullanın ve hücre peleti agaroz parçası etrafındaki plastik kesitleri temizleyin. Ultramikrotom ile 1 µm kalınlığında kesitler alın ve kesitleri su havuzundan bir lam üzerine taşımak için kirpik aparatı ve metal loop kullanın.Ardından, lamları kurumaları için 37 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin. 0.22 µm filtreli bir şırınga kullanarak kesitlerin üzerine bir damla teluatine blue çözeltisi ekleyin ve üç dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra lamları distile su ile durulayın ve kesitlerin kurumasını bekleyin.Kurutma işleminden sonra, hücrelerin konumunu belirlemek için kesitleri ışık mikroskobunda kontrol edin. Ardından, ultra ince kesitler almak için elmas bıçak kullanın. Daha sonra bir kirpik aparatı ile su teknesinden iki ila üç kesiti 200 mesh ızgaralara aktarın ve cam bir petri kabına yerleştirin.Kesitlerin kuruması için ızgaralı kapla birlikte örneği 30 °C'deki bir ısıtıcı tabla üzerine 30 dakika boyunca yerleştirin. Izgaraları boyamak için %1 uranil asetat damlatın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, distile su kullanarak altı ila sekiz kez durulayın.Altı ila sekiz kez durulamadan önce oda sıcaklığında beş dakika boyunca Reynolds kurşun sitrat ile boyayın. Kesitleri kurutmak için ızgaraları içeren cam petri kabını 37 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı plakaya aktarın. Son olarak, kesitleri 87 kV'luk bir elektron mikroskobu ile analiz edin.Burada düşük büyütmede gösterilen, küçük bir hücre peletini içeren bloklardan alınan yarı ince toluidin mavisi boyalı kesitler, bir hücre kümesini doğrulamaktadır. Bu daha yüksek büyütmeli görüntü, hücrelerin bozulmamış morfolojisini göstermektedir. Bu şekil, uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyanan ve elektron mikroskobu kullanılarak analiz edilen ultra ince kesitlerden alınan hücre kümesinin genel bakış alanını temsil etmektedir.Burada, hücrelerin morfolojisinin ve ultra yapısının iyi korunduğunu gösteren tek bir HSC gösterilmiştir. Tek bir HSC'nin daha yüksek büyütmeli ve oldukça ayrıntılı elektron mikrografı, hücre içi ultra yapıları göstermektedir. Ayrıca, yüksek büyütmeli görüntüler, mitokondri gibi hücre altı organellerin iyi korunmuş yapısını ve bütünlüğünü yakalamıştır.Bu teknik uzmanlaşıldığında beş ila altı saat içinde gerçekleştirilebilir; gelişmiş mavi boyama, agaroz gömme ve ardından gelen normal TEM işlemleri ise düzgün şekilde uygulandığında beş ila altı gün sürer. Bu videoyu izledikten sonra, TEM analizi için gerçek hücre hazırlığından örneklerin nasıl hazırlanacağı konusunda genel bir anlayış kazanmış olacaksınız.

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Yeniden elde etmek ve moleküler genetik karakterizasyon tek hücre düzeyinde bir karışımı nadir Hedef hücrelerden olmayan hedef arka plan hücrelerle hazırlamak protokolüdür. DNA kalitesi olmayan tedavi tek hücrelere eşittir ve (her iki tarama tabanlı ve analiz hedefli) tek hücreli uygulama için sağlar.

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Bu iletişim kuralı genel işlemlerini açıklar ve kalite kontrol sağlıklı yetişkin memeli tek hücreleri damlacık-esaslı, yüksek üretilen iş tek hücre RNA-Seq hazırlıkları hazırlanması için gerekli denetler. Sıralama parametreleri, okuma hizalama ve aşağı akım tek hücreli bioinformatic analiz da sağlanır.

Damlacık tek hücre barkodlama tabanlı Transcriptomics yetişkin memeli dokuların

Mevcut protokol, yeniden kullanılabilir tek bir hücre kullanarak yinelemeli epigenomik analizler için tek hücreli bir yöntemi açıklamaktadır. Yeniden kullanılabilir tek hücre, aynı tek hücrede birden fazla epigenetik işaretin analizine ve sonuçların istatistiksel olarak doğrulanmasına izin verir.

Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre

Yüksek verimli scRNA-seq yöntemlerinin fizibilitesi ve etkinliği, bitki araştırmalarında tek hücreli bir çağın habercisidir. Burada, spesifik Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerinin izole edilmesi ve ardından transkriptom kütüphanesi yapımı ve analizi için sağlam ve eksiksiz bir prosedür sunulmaktadır.

Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi

Bu protokol, transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid numuneler için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir hazırlık prosedürü sağlar. Olgun retinal organoidlerde sinapsların analizini içeren uygulamalar için uygundur.

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

Bu protokol, tek hücreli RNA dizilimi için insan ve fare tümör örneklerini hızlı bir şekilde ayırma prosedürünü ana hatlarıyla belirtir.

Tek Hücreli RNA Dizilimi için İnsan ve Fare Tümör Dokusu Örneklerinin Ayrışması

Bu protokol, numune hazırlama optimizasyonu yoluyla eşit olmayan parçacık dağılımını ele almak için bir örnek olarak Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) kullanan pratik bir yöntem sunar ve araştırmacılara kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanarak makromoleküler yapıları verimli bir şekilde aydınlatmaları için bir referans sağlar.

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

Burada, izotopik iki plex etiketleme stratejisi ve ArgC sindirimi kullanarak tek hücreli histon post-translasyonel modifikasyon analizini otomatikleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, tek hücre çözünürlükte kromatin heterojenliği ve epigenetik yanıtların nicel, tekrarlanabilir ve yüksek hassasiyetli profillenmesini mümkün kılar.

Tek Hücreli Histon Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Çoklayıcı Analizi için Otomatik Örnek Hazırlığı (sc-hPTM2)

Öğrenin, düşük hücre sayılarından TEM analizi için hematopoietik kök hücreleri hazırlama yöntemini. Bu teknik, biyomedikal araştırmalarda hücresel yapıları fizyolojik bağlamda görselleştirmeyi sağlar.

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Daha fazla video keşfet