Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, ruhende Neutrophile zu isolieren und ihre DNA-Freisetzung als Reaktion auf Agonisten zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Immunologie und Veterinärmedizin zu beantworten, wie z.B. wie ist die Reaktion der Neutrophilen auf verschiedene Agonisten der extrazelluären Falle oder des Zelltods? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein schnelles Screening verschiedener Agonisten und Inhibitoren der extrazellulären Fallenbildung von Neutrophilen ermöglicht.

Beginnen Sie damit, eine 21-Gauge-Schmetterlingsnadel in die Kopfvene eines gesunden Hundespenders einzuführen, setzen Sie dann eine Drei-Milliliter-Spritze auf, entnehmen Sie drei Drei-Milliliter-Blutproben, die Sie sofort in unverschlossene EDTA-haltige Blutröhrchen überführen. Achten Sie darauf, dass die Venenpunktion atraumatisch ist und die Durchblutung gut ist, da eine schlechte Blutabnahme zu einer schlechten Neutrophilenausbeute führt. Nachdem Sie jedes Röhrchen gefüllt haben, drehen Sie die Röhrchen um, um eine ausreichende Vermischung von Blut und Antikoagulans zu gewährleisten.

Sammeln Sie das Blut in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Mischen Sie die Proben mit einem gleichen Volumen sterilen 3%Dextran 500 bei Raumtemperatur durch sanfte Inversion und lassen Sie das Röhrchen 18 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur aufrecht. Übertragen Sie dann die strohfarbene obere Schicht in ein frisches Rohr, bis sie nicht mehr ohne Verunreinigung durch die untere rote Schicht aufgefangen werden kann.

Zentrifugieren Sie die obere Schicht. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet manuell in 10 Millilitern sterilem PBS bei Raumtemperatur. Geben Sie als nächstes 10 Milliliter einer bei Raumtemperatur erhitzten Polysaccharose in Natriumdiatrizoat-Zelltrennlösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Schichten Sie die Zellen vorsichtig über die Trennlösung. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie die oberen drei mononukleären Plasma- und Thrombozytenzellen- und Dichtegradientenschichten.

Lysieren Sie die restlichen Erythrozyten mit 10 Millilitern Wasser bei Raumtemperatur. Fügen Sie nach 30 Sekunden 10 Milliliter steriles Natriumchlorid mit 1,8 % bei Raumtemperatur hinzu, um die Tonizität wiederherzustellen. Mischen Sie die Zellen durch sanfte Inversion.

Sammeln Sie nun die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das weiße Pellet vorsichtig in 10 Millilitern sterilem PBS. Nach der Zählung zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie das Pellet in einer fünfmal 10 bis sechsten Zellen pro Milliliter Konzentration in sterilem PBS bei Raumtemperatur.

Trocknen Sie gegebenenfalls ein kleines Volumen der Zellen auf einem Objektträger an der Luft und färben Sie anschließend mit einem Schnellfixierungs- und Färbeset gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wenn die Isolierung der Neutrophilen erfolgreich war, sollten mindestens 95 % der kernhaltigen Zellen Granulozyten mit minimaler Erythrozytenkontamination sein, wie sie unter der Lichtmikroskopie beobachtet wurde. Unmittelbar nach der Neutrophilenisolierung wird die Zellsuspension durch einen sterilen 70-Mikron-Sterilfilter geleitet und fünfmal 10 bis vierte Zellen in die Testvertiefungen einer 96-Well-Platte mit Kulturmedien für eine 30-minütige Inkubation bei 39 Grad Celsius und 4 % Kohlendioxid gegeben.

Wenn die Zellen sich anheftet haben, wird ein Endvolumen von 100-200 Mikrolitern des Agonisten von Interesse in RPMI ohne Phenolrot addiert und mit hitzeinaktiviertem FCS in die Testvertiefungen sowie in zwei Blindvertiefungen, die nur PBS enthalten, ergänzt. Geben Sie dann einen geeigneten zellundurchlässigen Nukleinsäurefarbstoff in die Zellen und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Messen Sie nach der entsprechenden Inkubationszeit die Fluoreszenz auf einem Mikroplatten-Reader.

Eine einstündige Stimulation von caninen Neutrophilen mit Thrombozyten-aktivierendem Faktor führt zu einer mittleren vierfachen Erhöhung der Fluoreszenz im Vergleich zu nicht stimulierten Kontrollzellen. PMA ist jedoch ein langsamerer Agonist, der vor zwei Stunden Aktivierung keine erhöhte Neutrophilenfluoreszenz zeigt, aber letztendlich eine ähnliche Faltenzunahme im Laufe der Zeit erzeugt. Die Fluoreszenz von Nukleinsäurefarbstoffen ist nicht spezifisch für die Bildung extrazellulärer Fallen von Neutrophilen, da sie auch auftritt, wenn es durch andere Mechanismen zum Zelltod kommt oder wenn die Reagenzien mit DNA kontaminiert sind.

In diesem repräsentativen Experiment erzeugte beispielsweise ein kommerzielles LPS-Präparat in Abwesenheit von Neutrophilen eine sehr hohe Fluoreszenz, vermutlich aufgrund einer Kontamination mit bakterieller DNA. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Neutrophilen schonend zu behandeln.

Verwirbeln Sie die Zellen nicht und pipettieren Sie die Überstände ab, anstatt sie abzugießen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Immunfluoreszenzmikroskopie, durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die freigesetzte DNA mit NETose korreliert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Hämatologie, um die Interaktion zwischen freigesetzter DNA bei der Gerinnung und der Wirkung neuartiger NET-Agonisten, einschließlich Patientenplasma, zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Neutrophile bei Hunden isoliert und ihre Reaktion auf Agonisten misst.