Name: Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Lernen Sie eine Fluoreszenzmethode zur Quantifizierung von Neutrophil Extracellular Traps bei Hunden. Diese Technik ermöglicht die schnelle Untersuchung von Agonisten und Inhibitoren der NET-Bildung in der Veterinärmedizin.

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Die Autoren danken Dr. James Roth, William Nauseef und Kayoko Kimura sowie Herrn Tom Skadow für ihre Unterstützung bei der Entwicklung der Neutrophilenprotokolle bei Hunden. RDG wird durch ein Wellcome Trust Fellowship unterstützt Ref: WT093767MA.

Alle Versuche wurden mit ethischen Erlaubnis von der Iowa State University Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt. 1. Blutentnahme <ol><li> Zeichnen 9 ml Blut aus einer Vena, cephalica oder Halsvene direkt in Antikoagulans (zB Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml Blut) Vacutainer oder in eine Spritze mit sofortiger Transfer zu EDTA-haltige Blutröhrchen. Sanft rollen oder die Blutröhrchen invertieren eine ausreichende Durchmischung des Blutes und der Antikoagulans zu gewährleisten. </li></ol> 2. Neutrophilen-Isolation <ol><li> In einem 50 ml konischen Röhrchen, mischen Blut mit einem gleichen Volumen von sterilen Raumtemperatur 3% Dextran-500 (hergestellt in 0,9% steriler Kochsalzlösung) durch vorsichtiges Umdrehen. Lassen Sie aufrecht für 18-20 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Übertragen die strohfarbene obere Schicht in ein frisches Röhrchen, bis es nicht mehr ohne Verunreinigung durch die untere rote Schicht gesammelt werden kann. Die Erythrozyten in the kann original Rohr verworfen werden. </li><li> Zentrifuge den Überstand bei 500 xg für 10 min bei 4 ° C. Absaugen und den Überstand verwerfen. das Zellpellet in 10 ml Raumtemperatur steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) manuell erneut zu suspendieren. Beachten Sie, dass Verwirbelung sollte zu keinem Zeitpunkt dieses Protokolls zu resuspendieren Neutrophilen verwendet werden. Manuelles Abziehen, anstatt Stände Abgießen auch im gesamten Protokoll wird empfohlen Zellausbeute zu maximieren. </li><li> 10 ml einer bei Raumtemperatur Polysaccharose und Natriumdiatrizoat Zelltrennungslösung (zB Histopaque 1077) zu einem 50 ml konischen Röhrchen. Schicht sorgfältig die Zellen enthaltende Lösung über die Zelltrennlösung. Man beachte, dass unter Verwendung von Zelltrennungslösung, die auf Raumtemperatur äquilibriert nicht hat, kann Zellausbeute reduzieren. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 30 min bei Raumtemperatur mit der Bremse ab. </li><li> Als Neutrophilen in der untersten Schicht des Gradienten sind, abtrennen und verwerfen die upper 3 Schichten, bestehend aus einer oberen Schicht aus Plasma und Blutplättchen, einen schmalen weißen Band von mononukleären Zellen und eine klare Schicht der Dichtegradientenmedium. </li><li> alle verbleibenden Erythrozyten, resuspendieren die Neutrophilen-Pellet in 10 ml Wasser bei Raumtemperatur zu lysieren. </li><li> Nach 30 Sekunden wieder her Tonus von 10 ml sterilem Raumtemperatur 1,8% Natriumchlorid-Zugabe und durch vorsichtiges Umdrehen mischen. </li><li> Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Zeichnen Sie den Überstand ab und verwerfen. </li><li> Wenn das Pellet noch rot ist, wiederholen Sie den Lyseschritts. Wenn das Pellet weiß (oder, wenn die Lyse bereits zweimal durchgeführt worden ist), vorsichtig resuspendieren Zellen in 10 ml sterilem PBS. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines automatisierten Zähler oder einer Zählkammer. Typische Ausbeuten sind mindestens 10 6 Zellen pro ml Blut. </li><li> Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Zeichnen Sie den Überstand ab und verwerfen. </li><li> Resuspendieren Zellen auf die gewünschte Konzentration in steriler PBS Raumtemperatur. for die DNA - Freisetzungstest in Abschnitt 2, resuspendieren bei 5 x 10 6 Zellen pro ml beschrieben. </li><li> Falls gewünscht, Transfer direkt ein kleines Volumen von Zellen oder eine Zytozentrifuge auf einem Glasobjektträger verwendet wird. Zellen erlauben zu trocknen und zu Flecken eine rasche Fixierung und Färbung Kit gemäß den Herstellern &#39;Anweisungen. Wenn der Neutrophil Isolation erfolgreich, wenn sie unter dem Mikroskop bei mindestens 95% der kernhaltigen Zellen untersucht, sollte Granulozyten (Neutrophile, Basophile, Eosinophile) mit minimaler Erythrozytenkontamination sein. </li></ol> 3. DNA-Freisetzungstest <ol><li> Stellen Sie die DNA-Freisetzungstest unmittelbar nach Neutrophilen Isolierung auf. </li><li> Wenn die Zelle Verklumpung auf Prüfung der Stammlösung durch Lichtmikroskopie vorhanden ist, übergeben Sie die Zellsuspension durch ein steriles 70 &amp; mgr; m Sterilfilter unmittelbar vor dem Test einrichten. </li><li> Zu jedem Test gut einer sterilen 96 - Well - Platte, fügen Sie 5 x 10 4 Zellen / Vertiefung; Agonisten und Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) Medium ohne Phenolrot und mit 0,5% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum auf ein Endvolumen von 100-200 &amp; mgr; l ergänzt. Fügen Sie mindestens zwei leere Wells pro Agonist, in dem die Neutrophilen-Stammlösung mit einem gleichen Volumen von PBS ersetzt. Beachten Sie, dass die Einrichtung leere Vertiefungen für jede Agonist in Ausschluss DNA-Kontamination des Agonisten oder Störungen durch den Agonisten mit dem Fluoreszenztest wichtig ist. </li><li> für 30 min in einem Kohlendioxid (4%) Inkubator bei 39 ° C inkubieren. </li><li> In Agonisten bei gewünschten Konzentrationen und einer Zelle undurchlässige Farbstoff Nukleinsäure. Notieren Sie sich die optimale Konzentration von Zelle undurchlässige Farbstoff zwischen verschiedenen Nukleinsäure Farbstoffe variieren. Nicht-stimulierte Kontrollen, in denen Agonisten von einem gleichen Volumen an Medium ersetzt werden sollten in jedem Experiment eingeschlossen werden. HINWEIS: Es ist wünschenswert, Agonisten in ähnlichen Volumina Kulturmedium zu verdünnen, konsistente Bedingungen zwischen Vertiefungen zu halten. Schluss gut Volumen von 200 &amp;# 181; l wurden erfolgreich und wenn dies geändert wird, auch Volumina sollten identisch bleiben für alle Bedingungen. Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) (Endkonzentration ≥0.1 uM) oder Platelet Activating Factor (PAF) (Endkonzentration ≥31 uM) kann als positive Kontrollen verwendet werden. -Agonisten Sollten mindestens doppelt gemessen werden. </li><li> Inkubieren bei 39 ° C. Messen Sie Fluoreszenz eines Mikrotiterplattenmessgeräts nach 2 Stunden oder in gewünschten Intervallen verwenden. Beachten Sie, dass optimale Zeitintervalle verwendet Agonisten variieren. HINWEIS: Wellenlänge wird auf Farbstoff abhängig beschäftigt. </li><li> Subtrahiert leere Fluoreszenz vor mittlere Fluoreszenz zu berechnen. </li><li> Damit Vergleich zwischen Individuen und zwischen den Platten, berechnen eine Falte Veränderung der Fluoreszenz durch die mittlere Fluoreszenz der stimulierten Vertiefungen durch die mittlere Fluoreszenz von nicht-stimulierten Vertiefungen geteilt wird. </li></ol>

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<li>McCracken, J. M., Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neutrophil+apoptosis+and+lifespan+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease.</a> J Cell Death. 7, 15-23 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die DNA-Freisetzungstest vorgestellt, ist ein leicht quantifizierbare Assay für die extrazelluläre DNA. Die Methode wurde von ähnlichen Techniken angepasst verwendeten NET Bildung in anderen Spezies zu bewerten, aber Zentrifugation Geschwindigkeiten Agonist - Konzentrationen und Inkubationszeiten verändert wurden 8,17,18 das Verfahren zur Verwendung mit canine Neutrophilen zu optimieren. Ähnliche Anpassungen könnten die Verfahren für andere Arten angepasst werden. Der Test ist einfach und kostengünstig im Ver...

Es gibt mehr als 70 Millionen Hunde allein in den USA 1. Wie bewertet Familienmitglieder, oft sind diese Tiere erhalten Schneiden medizinische Versorgung Rand. Ebenso , weil sie unsere Umwelt teilen, können Hunde geben Einblicke in die Pathogenese und Behandlung menschlicher Krankheiten 1. Doch ob Entdeckungen in der Humanmedizin in tierärztliche Behandlungen oder umgekehrt zu übersetzen, ist es wichtig, gründlich Spezies Variationen charakterisieren auch in hochkonservierten Systeme wie die angeborene Immunantwort. Beispiele für Unterschiede zwischen dem Eckzahn und menschlichen angeborenen Immunsystems sind die hohe Expression CD4 auf Hund Neutrophilen 2; das Fehlen eines funktionellen Homolog des zytoplasmatischen Flagellin Sensor IPAF in dogs 3 und die Expression eines Caspase 1/4 Hybrid in Fleischfressern 4. Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind eine relativ kürzlich entdeckte Komponente der angeborenen Immunität 5. NETs sind Netzwerks von DNA, nukleare und granular Proteine in Reaktion auf eine Vielzahl von entzündlichen oder infektiösen Reizen 6 freigegeben. Netzartige Strukturen wurden in vielen Spezies , einschließlich Hühner 7 gezeigt Fisch 8, 9 und Mollusken acoelomates 10, aber es gibt Speziesvariationen. Zum Beispiel reagieren Maus - Neutrophilen langsamer NETosis Stimuli als menschliche Neutrophilen und bilden weniger diffuse NETs 11. Es gibt einen großen Körper von Beweismitteln aus mehreren Arten , die NETs entrap Mikroben und umstrittener direkt bei der Abtötung von Krankheitserregern 12,13 beteiligt sein können. NET - Komponenten auch Gewebeschäden jedoch verbessern, Thrombose und Tat fördern als 14,15 Autoantigene. Die Balance zwischen den nützlichen und schädlichen Wirkungen von NETs können zwischen verschiedenen Krankheiten und verschiedenen Arten variieren, was darauf hindeutet, ist es wichtig, NETs zu untersuchen, sowohl in der Art und Zustand von Interesse. Hier sind wirbeschreiben ein einfaches Protokoll für die Induktion und die Freisetzung von NETs durch Hunde- Neutrophilen zu messen. Dieses Verfahren ist ähnlich zu denjenigen verwendet , um Neutrophile 16 und induzieren NETosis in anderen Arten, aber die Bedingungen , wie beispielsweise Agonist - Konzentration und Inkubationszeit isolieren haben canine Neutrophilen optimiert. Eine ähnliche NET Quantifizierung DNA - Freisetzungstest wurde auch bei anderen Spezies beschrieben worden , aber das hier vorgestellte Verfahren ist auch für Hunde 8,17,18 optimiert.

<table><tbody><tr><td>Vollblutröhrchen aus Kunststoff mit Sprühbeschichtung K2EDTA</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-500</td><td>Genaue chemische und wissenschaftliche Corp.</td><td></td><td></td>AN228410</tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>20012043</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Serum für Rinderkälber, hitzeinaktiviert</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10100139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media 1640, ohne Phenolrot oder L-Glutamin</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>32404-014</td><td>Sollte frei von Phenolrot</td></tr><tr><td>sein 96 gut mit flachem Boden sterile Polystyrolplatte</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Thrombozytenaktivierender Faktor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4904</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Grüner Nukleinsäure-Farbstoff</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache fluoreszenztest zur quantifizierung von canine neutrophil extracellular einklemmschutz

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Extrazelluläre Neutrophilenfallen sind Netzwerke aus DNA, Histonen und neutrophilen Proteinen, die als Reaktion auf infektiöse und entzündliche Reize freigesetzt werden. Obwohl NETs ein Bestandteil der angeborenen Immunantwort sind, sind sie an einer Reihe von Krankheitsprozessen beteiligt, einschließlich Autoimmunität und Thrombose. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung und Quantifizierung von neutrophilen Netzen bei Hunden unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Fluoreszenzassays. Die Blutentnahme erfolgt mit herkömmlichen Venenpunktionstechniken. Neutrophile werden mittels Dextransedimentation und einem Dichtegradienten unter Verwendung von für Hundeblut optimierten Bedingungen isoliert. Nach einer gewissen Zeit für die Bindung an die Vertiefungen einer 96-Well-Platte werden Neutrophile mit NET-induzierenden Agonisten wie Phorbol-12-Myristat-13-acetat oder Thrombozytenaktivierungsfaktor behandelt. Die DNA-Freisetzung wird durch die Fluoreszenz eines zellundurchlässigen Nukleinsäurefarbstoffs gemessen. Dieser Assay ist eine einfache, kostengünstige Methode zur Quantifizierung der NET-Freisetzung, aber die NET-Bildung und nicht andere Ursachen für den Zelltod müssen mit alternativen Methoden bestätigt werden.

Unter Verwendung dieses Protokolls, sollte es eine starke fache Veränderung der Fluoreszenz sein, nachdem Neutrophilen mit den positiven Kontrollen, PMA und PAF stimulieren. Wie dargestellt in 1B, die Stimulation der canine Neutrophilen mit 31 uM PAF für 1 Stunde ergibt sich eine mittlere 4,0-fache Erhöhung der Fluoreszenz im Vergleich zu nicht-stimulierten Zellen (Bereich 2,0 bis 5,8, n = 5 Hunde) 18. PMA bei 0,1 uM (Figur 1A) ist ein langsam...

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind Netzwerke von DNA, Histone und Neutrophilen-Proteine. Obwohl eine Komponente der angeborenen Immunantwort sind NETs in Autoimmun- und Thrombose beteiligt. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Hunde- Neutrophilen Isolierung und Quantifizierung von NETs Mikrotiterplatten-Fluoreszenztest verwendet wird.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, ruhende Neutrophile zu isolieren und die Freisetzung ihrer DNA als Reaktion auf Agonisten zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Immunologie und Veterinärmedizin zu beantworten, beispielsweise: Wie reagieren Neutrophile auf verschiedene Agonisten der Neutrophilen-Extrazellulären-Netz-Induktion oder der Zelltod-Induktion? Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine schnelle Untersuchung verschiedener Agonisten und Inhibitoren der Bildung Neutrophiler Extrazellulärer Netze ermöglicht.Beginnen Sie damit, eine 21-Gauge-Butterfly-Nadel in die Vena cephalica eines gesunden, caninen Spenders einzuführen, anschließend ein dreimilliliterfassendes Spritze anzusetzen und drei dreimilliliter-Blutproben zu entnehmen, die unmittelbar in nicht verschlossene EDTA-haltige Blutröhrchen überführt werden. Achten Sie darauf, dass die Venenpunktion atraumatisch erfolgt und der Blutfluss gut ist, da eine schlechte Blutentnahme zu einer geringen Neutrophilen-Ausbeute führt. Nach dem Befüllen jedes Röhrchens sollten diese invertiert werden, um eine ausreichende Vermischung von Blut und Antikoagulans sicherzustelle

a-simple-fluorescence-assay-for-quantification-canine-neutrophil

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Induktion und Visualisierung von extrazellulären Neutrophilen-Fallen oder NETs in vormarkierten Neutrophilen unter Verwendung von Patientenserum, das zytoplasmatische Antikörper gegen Neutrophile enthält. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines undurchlässigen DNA-Farbstoffs und der Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung von NETs.

Induktion und Visualisierung von extrazellulären Fallen von Neutrophilen in vormarkierten Neutrophilen

Es werden Hochdurchsatz-Assays vorgestellt, die in Kombination hervorragende Werkzeuge zur Quantifizierung der NET-Freisetzung von menschlichen Neutrophilen bieten.

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Wir beschreiben Methoden zum isolieren eckzahn Neutrophils aus Vollblut und NET Bildung in live Neutrophilen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren. Protokolle, NET Bildung und citrullinierte Histon H3 zu quantifizieren sind auch beschrieben (citH3) Ausdruck mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und zum Betrieb von NETQUANT vor, einer vollautomatischen Softwareoption zur Quantifizierung von NETs in Immunfluoreszenzbildern.

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Dieses Protokoll beschreibt einen hochempfindliche und hohen Durchsatz Neutrophilenzahl extrazelluläre Falle (NET) Assay für die halbautomatische Quantifizierung von ex-Vivo NET Bildung durch Immunfluoreszenz dreidimensionale konfokalen Mikroskopie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um NET Bildung und Abbau nach verschiedenen Reize zu bewerten und kann verwendet werden, um mögliche NET gezielte Therapien zu studieren.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Wir präsentieren ein Protokoll für eine modifizierte Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Technik zur quantitativen Messung von zwei Komponenten von neutrophilen extrazellulären Fallenresten, Myeloperoxidase-konjugierter DNA und neutrophiler Elastase-konjugierter DNA-Komplexe, die von aktivierten Neutrophilen abgeleitet sind.

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Dieses Protokoll umfasst eine Reihe von funktionellen Neutrophilen-Assays, die als Screening-Methode verwendet werden, um Funktionen aus verschiedenen Signalwegen abzudecken. Das Protokoll beinhaltet eine erste und einfache Bewertung der Zelllebensfähigkeit, Reinheit, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Echtzeitmigration, Phagozytose und einen vorläufigen Vorschlag für neutrophile extrazelluläre Fallen.

Eine Reihe von Screening-Techniken für einen schnellen Überblick über die Funktion der Neutrophilen

Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.

Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Lernen Sie eine Fluoreszenzmethode zur Quantifizierung von Neutrophil Extracellular Traps bei Hunden. Diese Technik ermöglicht die schnelle Untersuchung von Agonisten und Inhibitoren der NET-Bildung in der Veterinärmedizin.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

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