Methode der direkten segmentale Intra-Leber-Lieferung Mit einer Rattenleber Hilar Clamp Modell

Das übergeordnete Ziel dieses einzigartigen Rattenleber-Hilar-Clamp-Modells ist es, die Untersuchung des Einflusses pharmakologischer Moleküle von Interesse auf die Linderung von Ischämie-Reperfusionsschäden zu ermöglichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Lebertransplantation zu beantworten, welche Moleküle direkt in die Leber infundiert werden können, um bei der Vermittlung von Ischämie-Reperfusionsschäden zu helfen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das interessierende Molekül direkt in die Pfortader injiziert wird, wodurch das Verteilungsvolumen reduziert wird.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Transplantation aller Organe, da sie die Untersuchung von Molekülen ermöglicht, die Organperfusaten zur Verringerung von Ischämie-Reperfusionsschäden zugesetzt werden können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist aufgrund der geringen Größe des Pfortaderastes, der für die Kanülierung verwendet wird, von entscheidender Bedeutung. Beginnen Sie damit, den geeigneten Sedierungsgrad durch Zusammenkneifen der Zehen zu bestätigen, legen Sie die Ratte dann auf ein Wärmekissen unter ein Präpariermikroskop und halten Sie die Gliedmaßen fest.

Als nächstes machen Sie einen Schnitt in der Bauchhaut in der Mittellinie vom Schambein bis zum Xiphoid, gefolgt von einem ähnlichen Schnitt im Bauchfell entlang der Linea alba. Betreten Sie den Bauchraum, achten Sie darauf, die Blase oder den Darm nicht zu beschädigen, und lösen Sie die Leber aus dem Peritoneum anterior in der Nähe des Xiphoid-Processus. Machen Sie einen Querschnitt durch die Haut und das Bauchfell am unteren Rand des rechten Leberlappens und verwenden Sie eine gebogene Mückenklemme, um den Xiphoid-Prozess zurückzuziehen.

Verwenden Sie Rippenretraktoren, um die Rippen so weit wie möglich von der Mittellinie entfernt zu öffnen, und durchtrennen Sie die falciformen, phrenischen und Magenbänder. Verwende dann angefeuchtete, sterile Wattestäbchen, um die Leber nach oben zu klappen und bei Bedarf zusätzliche Bänder zu durchtrennen, um Zugang zur Porta zu erhalten. Drehen Sie mit salzbefeuchteter Gaze die Leber viszeral und entfernen Sie dann das lose Bindegewebe, das über dem Pfortader, und das lose Bindegewebe, das über der Länge der Pfortader, liegt.

Schieben Sie mit einer Pinzette das lockere Bindegewebe hinter der linken Pfortader, Arterie und Gallengang durch, um ein Fenster zu bilden, und umschließen Sie die Gefäße locker mit einer 4-0 Potts-Naht. Dann wird das lose Bindegewebe über dem hinteren Ast zur Pfortader an der rechten Niere freigelegt. Als nächstes entnehmen Sie mit einer Insulinspritze 0,5 Milliliter Blut aus der unteren Hohlvene und geben das Blut in ein kleines Fläschchen.

Zentrifugieren Sie die Probe und sammeln Sie das Serum in einem neuen Fläschchen, um es in flüssigem Stickstoff einzufrieren. Schneiden Sie zwei Stücke 7-0 Naht. Platzieren Sie die erste 7-0-Schlaufe so weit wie möglich medial um die linke Pfortader, und verwenden Sie eine gebogene Moskitoklemme, um die Vene zurückzuziehen.

Platzieren Sie eine lose gebundene zweite 7-0-Schlaufe auf dem hinteren Ast der Pfortader in der Nähe des Schnittpunkts mit der Pfortader. Befüllen Sie nun die Infusionspumpe mit einer Fünf-Milliliter-Spritze mit drei Millilitern Reagenz in 0,9 % Kochsalzlösung und entlüften Sie den Schlauch. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Klemme, um die distale Pfortadervene zu greifen, um Blutungen während der Kanülierung zu reduzieren, und schneiden Sie mit einer kleinen mikrochirurgischen Schere ein 0,5 Millimeter großes Loch in die Vene zwischen der 7-0-Stay-Naht und ihrem Schnittpunkt mit der Pfortader.

Kanülieren Sie mit einem Katheter 27-0 das linke portalvenöse System und führen Sie den Katheter nach der Bifurkation der linken und rechten Pfortadern ein. Gießen Sie einen Milliliter normale Kochsalzlösung, um die Platzierung der Kanüle zu bestätigen, und achten Sie darauf, dass der linke laterale und mediane Lappen der Leber blanchieren. Beurteilen Sie manuell, ob sich der Katheter hinter dem Abzug der rechten Pfortader, aber nicht hinter dem Abzug der Pfortader befindet, die den Medianlappen speist, ziehen Sie dann die Potts-Naht fest, sichern Sie den Katheter mit der 7-0-Naht und entfernen Sie die Klemme aus der distalen Pfortader.

Beginnen Sie sofort mit der Infusion von zwei Millilitern des Reagenzes von Interesse über einen Zeitraum von 15 Minuten, wobei die Vitalfunktionen des Tieres während der gesamten Infusion kontinuierlich überwacht werden. Eine Stunde nach Beginn der ischämischen Zeit entfernen Sie die Potts-Naht und den Katheter und ziehen dann die 7-0-Naht am hinteren Ast an die Pfortader. Zwei Stunden nach Beginn der Reperfusion langsam 0,5 Milliliter Blut aus der unteren Hohlvene entnehmen, gefolgt von einem langsamen Tropftransfer des Blutes in ein neues Fläschchen.

Üben Sie bei Bedarf sanften Druck aus, um die Blutung aus der Vene zu stoppen. Zentrifugieren Sie dann das Blut und frieren Sie die Hälfte des Serums für die Weiterverarbeitung ein, wie gerade gezeigt. Am experimentellen Endpunkt schneidet man das Zwerchfell kreisförmig ein und durchtrennt das zusätzliche Bindegewebe, das die Leber mit der Bauchhöhle verbindet.

Entnehmen Sie die Leber und entnehmen Sie vier große Proben aus dem linken und mittleren Lappen und vier große Proben aus dem rechten Lappen. Geben Sie dann die Proben in einzelne beschriftete Fläschchen und frieren Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff für die Weiterverarbeitung ein. Die Serum-Alanin-Aminotransferase-Messung bei normal salzhaltigen und mit PEG-SOD infundierten hilären Tieren zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen der Serumkontrolle und den experimentellen Expressionswerten der Leberenzyme bei Tieren 120 Minuten nach der Reperfusion.

Die Malondialdehyd-Expression im rechten nicht-hilären Klemmlappen zeigt keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontroll- und der Versuchsgruppe. Der linke posthiläre Clamp- und Reperfusionslappen zeigt jedoch eine signifikant höhere Gewebe-Malondialdehyd-Expression im Vergleich zum nicht reperfundierten, nicht infundierten Kontrolllappen sowie zum rechten PEG-SOD-infundierten Lappen. Das gleiche Muster wird auch für die Glutathion-Expression im Gewebe beobachtet.

Die Western-Blot-Analyse zeigt eine erhöhte Expression von gespaltener Caspase-3-Expression im linken Lappen nach hilärer Clamp und Reperfusion, die bei Tieren, die mit PEG-SOD-Infusion behandelt wurden, verringert ist, Unterschiede, die durch Densitometrie als signifikant bestätigt wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden und 30 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass beim Platzieren der distalen Pfortaderklemme eine erhebliche Traktion am Pfortaderast für die Kanülierung erzielt wird.

Sobald dieses Verfahren beherrscht wird, kann es verwendet werden, um die Wirkung einer Vielzahl von pharmakologischen Substanzen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das linke portalvenöse System kanüliert wird.