Extraktion von Pflanzenbasis Kapseln für Mikroverkapselung Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein optimiertes Verfahren zur Extraktion von Sporopollenin-Exine-Kapseln (SECs) für Mikroverkapselungsanwendungen zu etablieren. Diese Methode kann schnell eine saubere Mikroerfassung für Lebensmittel- und Gesundheitsanwendungen liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zeit des SEC-Extraktionsprozesses erheblich verkürzt werden kann, um saubere, intakte SECs herzustellen.

Obwohl diese Methode einen Einblick in den extrahierten Extraktionsprozess des SEC und eine umfassende schrittweise Charakterisierung bieten kann, kann sie auch verwendet werden, um grundlegende mikrostrukturelle und morphologische Bewertungen verschiedener pflanzlicher Biomaterialien zu untersuchen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund des herkömmlichen 8- bis 10-tägigen Extraktionsprozesses Schwierigkeiten haben, bei dem hochkorrosive Säuren bei erhöhten Temperaturen zum Einsatz kommen. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Rückflusseinrichtung in einem Abzug mit einem Glaskondensator, einem Wasserzirkulationssystem und einem Wasserbad vor.

Da beim SEC-Extraktionsprozess hochkorrosive Säuren und organische Lösungsmittel verwendet werden, sollte der Prozess mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Schutzbrille, Laborkittel, Gesichtsmaske und Handschuhen mit Gefahrenhinweis durchgeführt werden. Wiegen Sie vorsichtig 100 Gramm L-Clvatum-Sporen, ohne Staub zu erzeugen und von Zündquellen fernzuhalten. Übertragen Sie dann die Sporen langsam mit einem magnetischen Rührstab in einen Ein-Liter-PTFE-Rundkolben

Den Sporen werden 500 ml Aceton zugesetzt und der Kolben leicht geschüttelt, bis eine homogene Suspension entsteht. Stellen Sie nun den Kolben in ein auf 50 Grad Celsius eingestelltes Wasserbad und schließen Sie ihn an den Rückflusskondensator an. Die Suspension wird sechs Stunden lang unter Rühren bei 200 U/min auf Rückfluss erhitzt.

Nachdem Sie die Suspension bei Raumtemperatur abkühlen ließen, filtrieren Sie sie mit Filterpapier unter Vakuum und sammeln Sie die entfetteten Sporen in großen Petrischalen aus Glas. Trocknen Sie die Sporen bei Raumtemperatur, indem Sie die Petrischalen mit Alufolie mit Löchern für die Verdampfung des Lösungsmittels abdecken. Nach dem Überführen der getrockneten, entfetteten trockenen Sporen in einen Ein-Liter-PTFE-Kolben werden 500 Milliliter 85%ige Phosphorsäurelösung zugegeben.

Stellen Sie den Kolben in ein auf 70 Grad Celsius eingestelltes Wasserbad und schließen Sie ihn an den Rückflusskondensator an. Erhitzen Sie die Suspension 30 Stunden lang unter Rühren auf Rückfluss. Sobald die Suspension auf Raumtemperatur abgekühlt ist, verdünnen Sie sie mit 500 Millilitern warmem, entionisiertem Wasser und sammeln Sie die SECs durch Vakuumfiltration mit Filterpapier.

Übertragen Sie anschließend die SECs in ein Drei-Liter-Glasbecherglas, um eine Reihe von Waschgängen durchzuführen. Geben Sie in den Abzug 800 Millimeter heißes deionisiertes Wasser zu den SECs und rühren Sie 10 Minuten lang vorsichtig um. Filtern Sie dann die Suspension mit Filterpapier unter Vakuum.

Übertragen Sie die SECs in ein sauberes Drei-Liter-Glasbecherglas. Nachdem Sie die vorherigen Schritte fünfmal wiederholt haben, geben Sie 600 Milliliter heißes Aceton zu den SECs und rühren Sie 10 Minuten lang vorsichtig um. Sammeln Sie die SECs durch Filtration unter Vakuum und geben Sie sie in ein sauberes Drei-Liter-Glasbecherglas.

Nachdem Sie die vorherigen Schritte mit den entsprechenden Lösungsmitteln wiederholt haben, geben Sie die sauberen SECs in sechs große Petrischalen aus Glas und trocknen Sie sie 24 Stunden lang in einem Abzug bei Raumtemperatur, um das gesamte Wasser zu entfernen. Trocknen Sie anschließend die SECs in einem Vakuumschrank bei 60 Grad Celsius und einem Millibar Vakuum für 10 Stunden oder bis zu einem konstanten Gewicht. Füllen Sie dann die getrockneten SECs in eine Polypropylenflasche um, um sie in einem Trockenschrank aufzubewahren.

Bereiten Sie 1,2 Milliliter Rinderserumalbumin oder BSA-Lösung in entionisiertem Wasser vor und geben Sie es in ein 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen. Geben Sie 150 Milligramm SECs in die BSA-Lösung. Wirbeln Sie die Mischung 10 Minuten lang, um eine homogene Lösung zu bilden.

Nachdem das Röhrchen mit Filterpapier bedeckt ist, wird es in einen Gefriertrocknerkolben umgefüllt und vier Stunden lang bei einem Vakuum von einem Millibar getrocknet. Sobald die BSA-beladenen SECs trocken sind, entfernen Sie die Agglomerate mit einem Mörser und Stößel. Füllen Sie nun die mit BSA beladenen SECs in ein 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie zwei Milliliter deionisiertes Wasser hinzu, um das restliche BSA zu entfernen.

Sammeln Sie die SECs durch Zentrifugation bei 4.704 für fünf Minuten. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie das Waschen mit entionisiertem Wasser.

Decken Sie anschließend das Röhrchen mit den BSA-geladenen SECs mit Filterpapier ab. Füllen Sie die SECs dann für eine Stunde in einen Gefrierschrank. Trocknen Sie die SECs 24 Stunden lang.

Lagern Sie die SECs bis zur weiteren Charakterisierung im Gefrierschrank. Verwenden Sie fünf Milligramm der mit BSA beladenen SECs in einem Zwei-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen. Fügen Sie 1,4 Milliliter PBS hinzu und wirbeln Sie fünf Minuten lang.

Anschließend beschallt die Sonde die Suspension bei 40 % Amplitude für drei Zyklen von zehn Sekunden. Wenn Sie fertig sind, filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,45-Mikron-Polyethersulfonfilter. Nachdem Sie die vorherigen Schritte mit den Placebo-SECs durchgeführt haben, messen Sie die Absorptionsmittel der BSA-beladenen SECs bei 280 Nanometern unter Verwendung von Placebo als Blindwert.

Quantifizieren Sie schließlich die Menge an eingekapseltem BSA unter Verwendung einer BSA-Standardkurve in PBS. REM-Bilder zeigen intakte Sporen mit einer einzigartigen Mikrostruktur und vor der Verarbeitung wurden im Schnittbild sporoplasmatische Organellen im Mikrometerbereich beobachtet. Bei der Sporenentfettung und der alkalischen Behandlung wurden keine morphologischen und strukturellen Veränderungen beobachtet.

REM-Bilder nach Acidolyse zeigen intakte SECs ohne sporoplasmatisches Material. In entfetteten und alkalisch behandelten SECs durch CHN-Analyse wurde keine wesentliche Entfernung von proteinhaltigem Material beobachtet. Der Großteil der proteinhaltigen Materialien wird durch Azidolyse entfernt.

Die DIPA-Analyse zeigt die gleichmäßige Größenverteilung der SECs nach einer Acidolyse von bis zu 30 Stunden. Die strukturelle Integrität von SEC nimmt mit längerer Acidolyse ab. REM- und DIPA-Daten zeigen, dass die Acidolyse nach dem Entfettungsschritt intakte SECs mit einer gleichmäßigen Größenverteilung erzeugte.

CLSM-Daten deuten darauf hin, dass unbehandelte SECs aufgrund von Sporoplasma-Bestandteilen in der Sporenhöhle eine Autofluoreszenz aufweisen. Nach der Acidolyse werden nur alle sporoplasmatischen Inhalte entfernt. Nach der Verkapselung von FITC-BSA wird eine grüne Fluoreszenz in den SECs beobachtet.

Die REM-Bilder zeigen intakte Mikrorippen nach BSA-Belastung. Es wurden keine wesentlichen Veränderungen des Durchmessers, der Zirkularität und des Aspektverhältnisses nach BSA-Beladung in SECs beobachtet. Die BSA-Quantifizierung aus verkapselten SECs bestätigt die Konsistenz des Mikroverkapselungsprozesses mit 0,170 plus oder minus 0,01 Gramm BSA-Beladung pro Gramm SECs.

Sobald dieser optimierte SEC-Extraktionsprozess gemeistert wird, kann er in 48 Stunden durchgeführt werden, wenn er ordnungsgemäß durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens für verschiedene Pflanzensporen und Pollen ist es wichtig, sich an die schrittweise Auswertung der strukturellen morphologischen und elementaren Analyse zu erinnern, um intakte und saubere Kapseln zu erhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Extraktionsprozesse mit Alkalienzymen durchgeführt werden, um die Machbarkeit des optimierten Prozesses für verschiedene pflanzliche Kapseln zu überprüfen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Mikroverkapselung, der Wirkstoffverabreichung und des Tissue Engineering, um verschiedene pflanzliche SECs als Biomaterialien der nächsten Generation zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man SECs aus Pflanzensporen und Pollenkörnern extrahiert und charakterisiert sowie wie man die Verkapselung von Arzneimitteln und Biomakromolekülen in SECs durchführt.