Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein magnetisches Nanopartikel in einem Proteinkäfig zu synthetisieren und dann das Protein so zu funktionalisieren, dass es eine schnelle Anheftung des magnetischen Nanopartikels an Zellen ermöglicht. Mit dieser Methode lassen sich magnetische Nanopartikel erzeugen, die eine schnelle und effiziente magnetische Markierung von Zellen ermöglichen, was für Anwendungen wie MRT oder magnetische Zelltrennung wichtig ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zellmagnetisierung durch niedrige Nanopartikelkonzentrationen und kurze Inkubationszeiten erreicht werden kann, wodurch mögliche nachteilige Auswirkungen durch die Exposition gegenüber Nanopartikeln vermieden werden.

Zu Beginn entsauerstofffrei 500 Milliliter entionisiertes Wasser, indem Sie einen Schlauch, der mit einer Stickstoffgasflasche verbunden ist, in das Wasser stecken und das Gefäß mit Frischhaltefolie verschließen. Lassen Sie dann das Stickstoffgas etwa 60 Minuten lang durchblasen. Ein Wasserbad, das mit dem doppelwandigen Reaktionsgefäß verbunden ist, wird auf 65 Grad Celsius erhitzt.

Geben Sie dann 75 Milliliter 50 Millimolar HEPES-Puffer mit einem pH-Wert von 8,6 in das Reaktionsgefäß. Verschließen Sie das Gefäß und entsauern Sie, indem Sie Stickstoffgas etwa 20 Minuten lang durch die Pufferlösung blasen. Gleichzeitig die Pufferlösung mit einem Magnetrührer umrühren.

Entfernen Sie nach dem Desoxygenieren der HEPES-Pufferlösung das Stickstoffrohr aus dem Puffer und halten Sie es über der Lösung, um eine Stickstoffatmosphäre aufrechtzuerhalten. Fügen Sie Apoferritin hinzu, um eine Endkonzentration von 3 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Setzen Sie das magnetische Rühren fort, reduzieren Sie jedoch die Rührgeschwindigkeit, wenn es zu Schaumbildung kommt.

Für die Magnetoferritinsynthese injizieren zwei Spritzenpumpen gleichzeitig 10,1 Milliliter des Eisen-Kobalt-Vorläufers und 10,1 Milliliter des Wasserstoffperoxids in die Apoferritinlösung mit einer Durchflussrate von 0,15 Millilitern pro Minute. Fahren Sie mit den Syntheseschritten fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Laden Sie dann die Probe mit einer Schlauchpumpe mit einer Durchflussrate von 10 Millilitern pro Minute auf eine Säule mit einer kationischen Matrix.

Waschen Sie die Säule mit ca. 100 Millilitern Laufpuffer unter Verwendung einer Gradientenpumpe bei einer Durchflussmenge von 10 Millilitern pro Minute. Um das Protein zu eluieren, waschen Sie die Säule mit 150 Millilitern steigender Konzentrationen von Natriumchlorid und Trispuffer bei 10 Millilitern pro Minute. Da das Protein bei einer Natriumchloridkonzentration von 500 Millimolar eluiert, sammeln Sie es in 50-Milliliter-Fraktionen mit einem automatisierten Fraktionssammler

Konzentrieren Sie die 150 Milliliter Magnetoferritin auf ein Volumen von etwa zwei Millilitern unter Verwendung einer 15-Milliliter-Zentrifugalfiltereinheit, gefolgt von einer Vier-Milliliter-Volumeneinheit. Ein detailliertes Protokoll dieses Verfahrens finden Sie in den Herstellerangaben der Zentrifugalfiltereinheiten. Laden Sie anschließend die konzentrierte Probe mit einer Injektionsschlaufe auf eine Gelfiltrationssäule.

Waschen Sie die Säule mit laufendem Puffer bei einer Durchflussmenge von 1,3 Millilitern pro Minute. Sammeln Sie sechs Milliliterfraktionen mit einem automatischen Fraktionssammler. Proteinmonomere eluieren zuletzt.

Zu diesem Zeitpunkt kann gereinigtes Magnetoferritin bis zur Kationisierung bei vier Grad Celsius gelagert werden. Für 10 Milligramm Magnetoferritin 374 Milligramm DMPA abwiegen und in 2,5 Millilitern 200 Millimolar MES-Puffer auflösen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit konzentrierter Salzsäure auf etwa sieben ein.

Giftige Dämpfe werden freigesetzt, wenn Sie den pH-Wert der DMPA-Lösung mit Salzsäure einstellen. Achten Sie darauf, diese Materialien in einem Abzug zu handhaben. Fügen Sie 2,5 Milliliter Magnetoferritinlösung mit vier Milligramm pro Milliliter hinzu.

Fügen Sie einen Magnetrührer hinzu und rühren Sie zwei Stunden lang, um das Gleichgewicht zu halten. Nachdem Sie die Lösung auf pH 5,0 eingestellt haben, fügen Sie der DMPA-Magnetoferritin-Lösung 141 Milligramm EDC-Pulver hinzu. Dreieinhalb Stunden lang weiterrühren.

Filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter, um alle Ausfällungen zu entfernen und das Protein zu dialysieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Kultivieren Sie hMSCs, wie im Textprotokoll beschrieben. Waschen Sie die plattierten Zellen mit zwei Millilitern PBS bei Raumtemperatur.

Geben Sie dann einen Milliliter der sterilisierten kationisierten Magnetoferritinlösung zu den plattierten Zellen, bevor Sie sie für den gewünschten Zeitraum inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit PBS und ernten Sie sie dann, indem Sie 0,5 Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügen und fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach Zugabe von einem Milliliter Kulturmedium zur Inaktivierung des Trypsin-EDTA wird die Lösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 524-fachem G zentrifugiert. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 0,5 Milliliter magnetischem Trennpuffer resuspendieren.

Befestigen Sie anschließend den Magneten an dem Multiständer und fügen Sie dem Magneten eine magnetische Trennsäule hinzu. Platzieren Sie einen Vorabscheidefilter auf der Säule. Geben Sie dann 0,5 Milliliter magnetischen Trennpuffer in den Vorabscheidefilter und lassen Sie ihn sowohl durch den Filter als auch durch die Säule laufen, um sie zu waschen.

Legen Sie anschließend ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen unter die Säule und geben Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension in das Filterreservoir der magnetischen Trennsäule. Wenn der Behälter leer ist, fügen Sie 0,5 Milliliter magnetischen Trennpuffer hinzu. Wenn sich das Reservoir wieder leert, fügen Sie weitere 0,5 Milliliter magnetischen Trennpuffer hinzu.

Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal, um ein Gesamtvolumen des magnetischen Trennpuffers von 1,5 Millilitern zu erhalten. Dieser Waschschritt eluiert alle nicht magnetisierten Zellen aus der Säule. Nehmen Sie die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein frisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Entfernen Sie dann den Filter aus dem Säulenbehälter. Geben Sie 1 Milliliter des magnetischen Trennpuffers in das Reservoir und drücken Sie die Säule sofort mit dem vom Hersteller gelieferten Kolben durch. Dabei werden die magnetisierten Zellen von der Säule in das Zentrifugenröhrchen eluiert.

Fahren Sie mit der Durchführung der Eisenquantifizierung fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von negativ gefärbten Magnetoferritin-Proben zeigten, dass sich Nanopartikel im Inneren des Proteinkäfigs gebildet haben. Zetapotentialmessungen bestätigen, dass Magnetoferritin nach der Kationisierung eine positive Oberflächenladung erhalten hat.

Die einminütige Exposition menschlicher mesenchymaler Stammzellen gegenüber kationisiertem Magnetoferritin führte zur Magnetisierung von 92 % der Zellpopulation und zur Abgabe von 3,6 Pikogramm Eisen pro Zelle. Die Erhöhung der Inkubationszeit auf 15 Minuten führte zu einer Magnetisierung der gesamten Zellpopulation. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie Sie ein magnetisches Nanopartikel im Apoferritin-Hohlraum synthetisieren können, indem Sie der Proteinlösung nacheinander Metallsalzvorläufer hinzufügen.

Und dann, wie man das Protein mithilfe der TMPA-Kopplung chemisch kationisiert. Einmal gemeistert, kann die Magnetoferritin-Synthese, -Reinigung und -Kationisierung in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine Sauerstoffkontamination zu vermeiden und die richtige Temperatur und den richtigen pH-Wert während der gesamten Magnetoferritinsynthese aufrechtzuerhalten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Ladungen wie Quantenpunkte oder Therapeutika in den kationisierten Apoferritin-Käfig eingekapselt werden, um eine effizientere Abgabe dieser Materialien an die Zellen zu erreichen. Diese Technik kann Forschern auf dem Gebiet der magnetischen Zellmanipulation den Weg ebnen, um die magnetische Markierung in Zellen zu erforschen, die eine schlechte Aufnahme von Nanopartikeln aufweisen oder die sehr empfindlich auf eine längere Nanopartikelexposition oder erhöhte Nanopartikelkonzentrationen reagieren.