Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, ein magnetisches Nanopartikel innerhalb einer Proteinhülle zu synthetisieren und anschließend das Protein so zu funktionalisieren, dass eine schnelle Anheftung des magnetischen Nanopartikels an Zellen ermöglicht wird. Diese Methode kann verwendet werden, um magnetische Nanopartikel herzustellen, die eine schnelle und effiziente magnetische Markierung von Zellen ermöglichen, was für Anwendungen wie die MRT oder die magnetische Zellseparation wichtig ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Zellmagnetisierung mit niedrigen Nanopartikelkonzentrationen und kurzen Inkubationszeiten erreicht werden kann, wodurch mögliche nachteilige Effekte durch die Exposition gegenüber Nanopartikeln vermieden werden.

Um zu beginnen, deoxygenieren Sie 500 Milliliter deionisiertes Wasser, indem Sie einen Schlauch, der an eine Stickstoffgasflasche angeschlossen ist, ins Wasser geben und das Gefäß mit Frischhaltefolie abdichten. Anschließend wird etwa 60 Minuten lang Stickstoffgas durch das Wasser geleitet. Heizen Sie ein Wasserbad, das mit dem doppelmanteligen Reaktionsgefäß verbunden ist, auf 65 Grad Celsius auf.

Anschließend 75 Milliliter 50 Millimolar HEPES-Puffer, pH 8,6, in das Reaktionsgefäß geben. Das Gefäß verschließen und durch Einleiten von Stickstoffgas etwa 20 Minuten lang entgasen. Gleichzeitig den Puffer mit einem magnetischen Rührer umrühren.

Nachdem die HEPES-Pufferlösung deoxygeniert wurde, entfernen Sie das Stickstoffrohr aus dem Puffer, wobei es über der Lösung hängend belassen wird, um eine Stickstoffatmosphäre aufrechtzuerhalten. Geben Sie Apoferritin hinzu, um eine Endkonzentration von 3 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Setzen Sie das magnetische Rühren fort, verringern Sie jedoch die Rührgeschwindigkeit, falls Schaumbildung auftritt.

Verwenden Sie für die Synthese von Magnetoferritin zwei Spritzenpumpen, um gleichzeitig 10,1 Milliliter der Eisen-Kobalt-Vorstufe und 10,1 Milliliter Wasserstoffperoxid mit einer Flussrate von 0,15 Milliliter pro Minute in die Apoferritinlösung einzuspritzen. Fahren Sie anschließend mit den in der Textanleitung beschriebenen Syntheseschritten fort. Laden Sie dann die Probe mithilfe einer peristaltischen Pumpe mit einer Flussrate von 10 Milliliter pro Minute auf eine Säule, die eine kationische Matrix enthält.

Spülen Sie die Säule mit etwa 100 Milliliter Laufpuffer unter Verwendung einer Gradientenpumpe mit einer Flussrate von 10 Milliliter pro Minute. Zum Eluieren des Proteins spülen Sie die Säule mit 150 Milliliter zunehmenden Konzentrationen von Natriumchlorid und Tris-Puffer bei 10 Milliliter pro Minute. Da das Protein bei einer Natriumchlorid-Konzentration von 500 Millimolar eluiert, sammeln Sie es in 50-Milliliter-Fraktionen mit einem automatischen Fraktionssammler.

Konzentrieren Sie die 150 Milliliter Magnetoferritin auf ein Volumen von etwa zwei Millilitern unter Verwendung einer 15-Milliliter-Zentrifugalfiltereinheit, gefolgt von einer Vier-Milliliter-Volumeneinheit. Weitere Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in der Bedienungsanleitung des Herstellers für die Zentrifugalfiltereinheiten. Laden Sie danach die konzentrierte Probe mithilfe einer Injektionsschleife auf eine Gelfiltrationssäule auf.

Spülen Sie die Säule mit Laufpuffer bei einer Flussrate von 1,3 Milliliter pro Minute. Sammeln Sie sechs-Milliliter-Fraktionen mithilfe eines automatischen Fraktionssammlers. Proteinmonomere eluieren zuletzt.

An diesem Punkt kann gereinigtes Magnetoferritin bis zur Kationisierung bei vier Grad Celsius gelagert werden. Für 10 Milligramm Magnetoferritin 374 Milligramm DMPA abwiegen und in 2,5 Milliliter 200 Millimolar MES-Puffer lösen. Den pH-Wert der Lösung mit konzentrierter Salzsäure auf etwa sieben einstellen.

Beim Einstellen des pH-Werts der DMPA-Lösung mit Salzsäure werden giftige Dämpfe freigesetzt. Stellen Sie sicher, dass Sie diese Materialien in einem Abzug handhaben. Geben Sie 2,5 Milliliter Magnetoferritin-Lösung mit einer Konzentration von vier Milligramm pro Milliliter hinzu.

Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu und rühren Sie zwei Stunden lang, um das Gleichgewicht einzustellen. Nach dem Einstellen der Lösung auf pH 5,0 geben Sie 141 Milligramm EDC-Pulver zu der DMPA-Magnetoferritin-Lösung hinzu. Rühren Sie weitere dreieinhalb Stunden lang weiter.

Filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter, um eventuelle Präzipitate zu entfernen, und dialysieren Sie das Protein, wie im Textprotokoll beschrieben. Kultivieren Sie hMSCs, wie im Textprotokoll beschrieben. Waschen Sie die belagten Zellen mit zwei Milliliter PBS bei Raumtemperatur.

Fügen Sie dann ein Milliliter der sterilisierten kationisierten Magnetoferritin-Lösung zu den beimpften Zellen hinzu und inkubieren Sie für den gewünschten Zeitraum. Waschen Sie die Zellen mit PBS und heben Sie sie anschließend ab, indem Sie 0,5 Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügen und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach Zugabe von einem Milliliter Kulturmedium zur Inaktivierung des Trypsin-EDTA überführen Sie die Lösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren fünf Minuten bei 524 × g. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 Milliliter Puffer für die magnetische Trennung.

Befestigen Sie als Nächstes den Magneten am Multistativ und setzen Sie eine magnetische Trennsäule auf den Magneten. Setzen Sie einen Vortrennfilter auf die Säule. Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter magnetischen Trennpuffer auf den Vortrennfilter und lassen Sie ihn durch Filter und Säule laufen, um diese zu waschen.

Als Nächstes stellen Sie ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen unter die Säule und geben 0,5 Milliliter der Zellsuspension in das Filterreservoir der magnetischen Trennsäule. Wenn das Reservoir leer ist, geben Sie 0,5 Milliliter Puffer für die magnetische Trennung hinzu. Wenn das Reservoir erneut leer ist, fügen Sie weitere 0,5 Milliliter Puffer für die magnetische Trennung hinzu.

Wiederholen Sie die Waschung ein weiteres Mal, sodass ein Gesamtvolumen an magnetischem Puffer von 1,5 Millilitern vorliegt. Dieser Waschschritt eluiert alle nicht-magnetisierten Zellen aus der Säule. Entfernen Sie die Säule vom Magneten und setzen Sie sie in ein frisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Entfernen Sie anschließend den Filter aus dem Säulenreservoir. Geben Sie 1 Milliliter Puffer für die magnetische Trennung in das Reservoir und durchlaufen Sie die Säule unverzüglich mit dem vom Hersteller beigefügten Kolben. Dadurch werden die magnetisierten Zellen aus der Säule in das Zentrifugenröhrchen eluiert.

Fahren Sie mit der Eisenquantifizierung wie im Textprotokoll beschrieben fort. Transmissions-Elektronenmikroskopiebilder negativ gefärbter Magnetoferritin-Proben zeigten, dass sich Nanopartikel innerhalb des Proteinkäfigs gebildet haben. Zeta-Potential-Messungen bestätigen, dass Magnetoferritin nach der Kationisierung eine positive Oberflächenladung erhielt.

Die Behandlung menschlicher mesenchymaler Stammzellen mit kationisiertem Magnetoferritin für eine Minute führte zur Magnetisierung von 92 % der Zellpopulation und zur Aufnahme von 3,6 Pikogramm Eisen pro Zelle. Eine Verlängerung der Inkubationszeit auf 15 Minuten resultierte in der Magnetisierung der gesamten Zellpopulation. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie verstehen, wie man ein magnetisches Nanopartikel in der Hohlkammer des Apoferritins synthetisiert, indem man schrittweise Metallsalz-Vorläufer der Proteinslösung hinzufügt.

Und anschließend, wie das Protein mittels TMPA-Kupplung chemisch kationisiert wird. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, können die Synthese, Reinigung und Kationisierung von Magnetoferritin innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden, sofern alles ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Sauerstoffkontamination zu vermeiden und während der gesamten Synthese von Magnetoferritin die richtige Temperatur und den richtigen pH-Wert aufrechtzuerhalten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Frachtstoffe wie Quantenpunkte oder therapeutische Wirkstoffe in den kationisierten Apoferritin-Mantel eingeschlossen werden, um eine effizientere Abgabe dieser Materialien in Zellen zu erreichen. Diese Technik kann für Forscher auf dem Gebiet der magnetischen Zellmanipulation den Weg ebnen, magnetische Markierungen in Zellen zu untersuchen, die eine geringe Aufnahme von Nanopartikeln aufweisen oder die sehr empfindlich gegenüber längerer Exposition gegenüber Nanopartikeln oder erhöhten Nanopartikelkonzentrationen sind.