Maus Mikroinfusionstechnik für Zielsubstanz Lieferung in das ZNS über Die Arteria carotis interna

Das übergeordnete Ziel dieser Operationstechnik ist es, exogene Substanzen in das Gehirn der Maus zu bringen, ohne in den Schädel einzudringen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen der Neurowissenschaften bezüglich der Wirkung von Medikamenten, Krankheitserregern und Exosomen im Gehirn zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie dem Tier ein minimales Trauma zufügt, die Integrität des neuronalen Netzwerks bewahrt und hohe Konzentrationen der Substanz im Gehirn erreicht.

Beginnen Sie mit der Verabreichung von Isofluran gemischt mit Sauerstoff, um die Maus in einer Induktionskammer zu betäuben. Nach der Einleitung der Anästhesie wird das Tier unter einem Stereomikroskop auf die Operationsoberfläche gebracht und der Nasenkonus platziert, um eine chirurgische Anästhesieebene aufrechtzuerhalten. Stellen Sie sicher, dass die Atemfrequenz etwa ein bis zwei Atemzüge pro Sekunde beträgt, ohne nach Luft zu schnappen.

Stellen Sie außerdem sicher, dass das Tier nicht auf die Stimulation der Schnurrhaare oder ein Einklemmen der Zehen reagiert. Tragen Sie mit einem sterilen Tupfer einen Tropfen Augengleitmittel auf jedes Auge auf, um Trockenheit zu vermeiden. Nachdem Sie die Operationsstelle mit einem Rasierer rasiert haben, bereiten Sie den Bereich mit 70% Ethanol und Chlorhexidin vor.

Während Sie durch das Stereomikroskop schauen, verwenden Sie eine chirurgische Schere und Pinzette, um einen Mittellinienschnitt im Nacken von oberhalb des Brustbeins bis unterhalb des Kiefers zu erstellen. Verwenden Sie eine Pinzette, um Fett- und Bindegewebe vorsichtig zu trennen und die Luftröhre freizulegen. Legen Sie dann einen weichen, runden Gegenstand mit einem Durchmesser von etwa null Komma fünf Zentimetern unter den Nacken, um den Hals zu verlängern und den Bereich weiter freizulegen.

Trennen Sie anschließend das Gewebe um die Luftröhre herum mit Haken oder einem Geweberetraktor. Auf der linken Seite der Luftröhre zupfen Sie das Bindegewebe vorsichtig auseinander, um die linke Halsschlagader (CCA) freizulegen. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das gesamte Bindegewebe, um die CCA-Bifurkation am Anfang sowohl der äußeren als auch der inneren Halsschlagader freizulegen.

Sobald die ECA und ICA freigelegt sind, verwenden Sie eine Pinzette, um ein Segment einer ein Zentimeter langen Nylonnaht unter die äußere Halsschlagader zu legen. Platzieren Sie dann ein zweites ein Zentimeter langes Segment. Dann binden Sie einen dauerhaften Knoten an der höchstmöglichen Stelle des ECA.

Binden Sie an der tiefstmöglichen Stelle der ECA, unmittelbar über der CCA-Bifurkation, einen lockereren, abnehmbaren Knoten. Verwenden Sie dann Gefäßklammern, um das CCA an der tiefstmöglichen Stelle zu schließen und das ICA zu schließen. Wenn Sie die Arteria carotis interna richtig verschließen, bevor Sie einen kleinen Schnitt in die Arteria carotis externa machen, können Sie Blutungen verhindern.

Machen Sie nun mit einer Mikrodissektionsfederschere einen zwei Millimeter großen Schnitt in der ECA zwischen den beiden Knoten. Es ist wichtig, die Schnitte klein zu halten, da ein großer Schnitt dazu führt, dass die zu infundierende Substanz austritt. Bauen Sie das Infusionssystem zusammen, indem Sie einen sechs Zoll langen Kapillarschlauch an eine Tuberkulinspritze anschließen, die 250 Mikroliter der zu infundierenden Substanz enthält.

Führen Sie dann die Spitze des Kapillarschlauchs vorsichtig in den Schnitt in der ECA ein. Schieben Sie die Spitze weiter vor, bis sie die Mitte zwischen der Bifurkation und dem Clip am CCA erreicht. Binden Sie den unteren ECA-Knoten fest.

Stellen Sie sicher, dass der Knoten locker genug ist, um die Kapillarflüssigkeit zu ermöglichen, und fest genug, um ein Auslaufen zu verhindern. Entfernen Sie dann den Clip aus dem ICA. Üben Sie vorsichtig Druck auf den Spritzenkolben aus, so dass die Substanz mit einer Infusion von etwa 10 Mikrolitern pro Sekunde infusionsfähig ist.

Nach der Infusion der Prüfsubstanz setzen Sie den Clip wieder auf den ICA. Entfernen Sie vorsichtig den Kapillarschlauch. Binden Sie dann den unteren ECA-Knoten vollständig fest.

Entfernen Sie den Clip vom ICA und vom CCA. Entfernen Sie dann den Retraktor oder die Gewebehaken und das Kissen. Reinigen Sie den zu nähenden Bereich mit steriler Kochsalzlösung und verschließen Sie dann den Schnitt mit Nylonnähten.

Nach der Verabreichung eines zugelassenen entzündungshemmenden Mittels und eines Analgetikums zur Linderung postoperativer Beschwerden legen Sie das Tier mindestens eine Stunde lang in einen Käfig auf einem Heizkissen und überwachen Sie die Genesung. Dieses Histogramm zeigt den HIV-Nachweis durch Echtzeit-PCRs sieben Tage nach der Virusinfusion über die linke Arteria carotis interna. Erwartungsgemäß sind die Viruswerte in der linken Hemisphäre höher.

Dieses Immunfluoreszenzbild zeigt einen Schnitt aus dem Gehirn einer Maus, der den GFP-Tag CD63, einen Exosomenmarker, nach einer extrazellulären Vesikelinfusion über die Arteria carotis interna zeigt. Die CD63-exprimierenden extrazellulären Vesikel, die grün dargestellt sind, sind mit dem Mikrogefäß des Maus-Gehirns assoziiert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der neurodegenerativen Erkrankungen, um Wechselwirkungen zwischen Medikamenten, Krankheitserregern und Exosomen bei Mäusen zu erforschen.