Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in Drosophila
December 15th, 2016
Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Neurodegeneration im Drosophila-Gehirn zu quantifizieren, die durch eine Vielzahl von Faktoren wie Alter, genetische Veränderungen oder Umwelteinflüsse verursacht wird, ohne dass eine spezifische Färbung erforderlich ist. Diese Methode ist sehr nützlich bei der Analyse von Schlüsselfragen im Bereich der neurodegenerativen Erkrankungen. Zum Beispiel, welche Gene oder Umweltfaktoren diese Krankheiten verursachen oder dazu beitragen?
Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass systematische Fehler vermieden oder minimiert werden, da Kontrollfliegen und Versuchsfliegen als eine Probe behandelt werden. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es Übung erfordert, um sicherzustellen, dass sich der richtige Bereich des Gehirns auf der Folie befindet, und um Schäden zu vermeiden, die beim Schneiden auftreten können. Zu Beginn fädeln Sie die Fliegen am Hals zunächst mit einer Pinzette in die Kragen ein.
Richten Sie alle Köpfe in der gleichen Ausrichtung aus und stellen Sie sicher, dass der Kopf oder die Augen nicht beschädigt werden. Fügen Sie Augenlose Senoculus-Fliegen an zufälligen, bekannten Positionen ein, damit die Reihenfolge der Fliegen in den Abschnitten leicht erkennbar ist. Wenn der interessierende Fliegenstamm helle oder weiße Augen hat, fädeln Sie rotäugige Fliegen in Abständen entlang des Streifens ein, um sicherzustellen, dass genügend Pigment vorhanden ist, um den Objektträger zu färben.
Notieren Sie die Reihenfolge der Fliegen zusammen mit der Halsbandnummer, wenn mehr als eine Fliegen verwendet wird. Sobald ein Halsband fertig ist, legen Sie es für drei Komma fünf bis vier Stunden in die Carnoy-Lösung. Führen Sie eine Reihe von Ethanol-, Methylbenzoat- und Paraffinwäschen durch, um das Fliegengewebe für die Einbettung vorzubereiten.
Legen Sie dann die Manschetten in eine Gummi-Eiswürfelschale, auf jedem Abschnitt. Gießen Sie geschmolzenes Paraffin vorsichtig über die Kragen, vermeiden Sie Luftblasen und lassen Sie es über Nacht aushärten. Entfernen Sie die Paraffinblöcke mit den Manschetten aus dem Tablett.
Trenne den Paraffinblock mit einer Rasierklinge vom Kragen. Sanftes Abbrechen des Kragens. Die Körper verbleiben im Kragen, während die Köpfe im Paraffinblock bleiben.
Um das Gewebe zu schneiden, erwärmen Sie zunächst eine Heizplatte auf 50 Grad Celsius. Lege alle Werkzeuge, die mit dem Wachs in Berührung kommen, wie z. B. Rasierklingen oder Befestigungsblöcke aus Metall, zum Erwärmen auf die Platte. Bestimmen Sie die gewünschte Ausrichtung für das Trennen und befestigen Sie dann das Paraffinsegment am Montageblock, indem Sie es an der Kontaktseite kurz aufschmelzen.
Schneiden Sie mit einer Rasierklinge das überschüssige Paraffin von den Fliegenköpfen ab, so dass nur eine kleine Reihe mit den eingebetteten Köpfen übrig bleibt. Setzen Sie den Montageblock in den Objekthalter des Mikrotoms ein und richten Sie die Köpfe parallel zur Klingenkante aus. Schneiden Sie sieben Mikrometerschnitte aus und übertragen Sie das Schnittband auf Objektträger.
Legen Sie die Objektträger etwa eine Minute lang bei 37 Grad Celsius auf eine erhitzte Platte, damit sich das Farbband ausdehnen kann. Entfernen Sie überschüssiges Wasser und lassen Sie die Objektträger über Nacht weiter trocknen. Entfernen Sie nach dem Trocknen das Paraffinwachs, indem Sie die Objektträger senkrecht in ein hohes Objektträger-Färbeglas legen, das 30 Minuten bis eine Stunde lang mit Entparaffinierungsmittel gefüllt ist.
Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Nehmen Sie zum Schluss die Objektträger aus dem Glas und geben Sie jeweils zwei Tropfen Einbettmedien. Decken Sie die Abschnitte mit einem großen Deckglas ab und lassen Sie die Objektträger ein bis zwei Tage trocknen.
Bestimmen Sie bei geringer Vergrößerung an einem Fluoreszenzmikroskop die Ausrichtung des Gehirns und fokussieren Sie sich auf die interessierende Region. Sobald dieser Bereich identifiziert ist, nehmen Sie die erforderlichen Bilder auf. Zählen Sie mit Hilfe der Bildgebungssoftware die Anzahl der Vakuolen pro Kopf.
Messen Sie die Vakuolengröße, indem Sie die gewünschte Vakuole auswählen und die Anzahl der abgedeckten Pixel bestimmen. Dieses Bild zeigt Schnitte von verschiedenen Fliegenköpfen, die von links nach rechts ausgerichtet sind. Von oben nach unten werden serielle Schnitte desselben Fliegenkopfes visualisiert.
Die Augenlose Senoculus-Kontrollfliege ist durch den Pfeil gekennzeichnet. Die Schnitte werden durch das natürlich vorhandene fluoreszierende Augenpigment verfärbt, das die Schnitte beim Schneiden überflutet. Paraffin-Kopfteile von sieben, 14 und 21 Tage alten Swiss Cheese One Fliegen zeigen eine fortschreitende altersbedingte Zunahme der Vakuolenzahl und -fläche.
Diese Degeneration ist quantifizierbar, indem man die Vakuolen zählt und die kombinierte Fläche berechnet, und erweist sich als signifikant. In ähnlicher Weise wurde bei Wildtyp-Fliegen gezeigt, dass Neurodegeneration mit zunehmendem Alter auftritt. Bei der Untersuchung von Kopfabschnitten von 10-, 30- und 60-Tage-Wildtyp-Fliegen wurden nur wenige bis keine Vakuolen in der 10-Tage-Bedingung beobachtet
.In den Gehirnen der 30 Tage alten Individuen begannen sich Vakuolen zu bilden. Bei den 60-Tage-Individuen waren signifikant mehr und größere Flächenvakuolen vorhanden. Einmal gemeistert, können die Abschnitte innerhalb einer Woche für die Analyse zur Verfügung stehen.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Reihenfolge der Fliegen im Halsband sorgfältig zu notieren. Um sicherzustellen, dass Sie sie später, nach der Analyse, identifizieren können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Schnitte vorbereiten und die Neurodegeneration im Drosophila-Gehirn quantifizieren können.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Neurodegeneration im Drosophila-Gehirn mit Fokus auf die Vakuolenbildung. Es minimiert experimentelle Fehler, indem Kontroll- und Versuchsfliegen als eine Probe verarbeitet werden.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Neurodegeneration
- Modellorganismen
Hintergrund
- Drosophila dient als Modell für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen.
- Neurodegeneration kann durch Alter, Genetik und Umwelt beeinflusst werden.
- Die Vakuolenbildung ist ein wichtiger Indikator für Hirndegeneration.
- Diese Methode vermeidet spezifische Färbungen und vereinfacht die Analyse.
Zweck der Studie
- Neurodegeneration in Drosophila ohne spezifische Färbung zu quantifizieren.
- Faktoren zu analysieren, die zu neurodegenerativen Erkrankungen beitragen.
- Eine zuverlässige Methode für Forscher im Bereich bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Fliegen werden in Halsbänder eingefädelt, um sie zu verarbeiten.
- Kontroll- und Versuchsfliegen werden als eine Probe behandelt.
- Die Vakuolenbildung wird als Indikator für Degeneration quantifiziert.
- Es wird darauf geachtet, Schäden beim Schneiden zu vermeiden.
Hauptergebnisse
- Die Methode quantifiziert effektiv die Neurodegeneration.
- Minimierte systematische Fehler erhöhen die Zuverlässigkeit.
- Erleichtert die Analyse genetischer und umweltbedingter Faktoren.
- Bietet einen praktischen Ansatz für Forscher, die neu auf diesem Gebiet sind.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Neurodegeneration.
- Es ermöglicht die Bewertung verschiedener beitragender Faktoren.
- Verbessert die Genauigkeit von Studien zur Neurodegeneration bei Drosophila.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of neurodegenerative phenotypes in Drosophila, supporting early-stage target validation by linking genetic or environmental manipulations to measurable histopathological outcomes. By minimizing systematic error through paired control-experimental processing, it enhances data reliability for mechanistic de-risking in discovery workflows. The approach provides a scalable, staining-independent readout suitable for high-content screening of neurodegeneration modifiers.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying vacuole formation as a proxy for neuronal degeneration in genetic or environmental models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible, side-by-side comparison of control and experimental conditions within the same histological preparation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative, age-dependent neurodegeneration metrics that correlate with functional decline.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized paraffin sections suitable for automated imaging and vacuole quantification across large sample sets.
- Quantitative Output: Delivers numerical readouts (vacuole count and area) that enable dose-response analysis and hit confirmation in modifier screens.
- Platform Reuse: The collar-based sectioning method allows serial analysis of entire brains, increasing sensitivity for detecting mild or regional phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models age-dependent neurodegeneration observed in human conditions, enabling translational biomarker alignment via vacuole progression.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking histopathological changes to genetic or environmental exposures over time.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway involvement by allowing systematic evaluation of neurodegeneration across developmental stages and genetic backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing a histopathological bridge between genetic screening and functional validation in neurodegeneration research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of neurodegeneration in models of gene knockdown, overexpression, or environmental stress.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (vacuole number and size) that support assay standardization and cross-laboratory comparability.
- Analytics: Generates morphometric data that can be statistically compared across conditions to identify significant degenerative changes.
- Translational Research: Connects to preclinical validity through age-related vacuole accumulation, mirroring progressive neurodegeneration in human disease models.
- Enterprise Reuse: The paraffin sectioning and imaging workflow is adaptable across Drosophila strains and experimental setups, promoting institutional standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false positives through internal controls and systematic error minimization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput via standardized collar preparation, sectioning, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing objective, quantifiable neurodegeneration data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on histopathological severity and progression kinetics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila neuroanatomy and histological sectioning to ensure consistent brain orientation and slide quality.
- Dependent on microtome precision and embedding media quality to produce serial sections suitable for vacuole analysis.
- Necessitates standardized imaging and analysis protocols to ensure vacuole counting and sizing are reproducible across users and timepoints.
- Adaptation considerations include adjusting collar size and section thickness for different fly strains or head orientations.
- Practical limitations include the learning curve associated with collar assembly and paraffin removal, which may affect early-stage reproducibility.
