Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, alters- und passageangepasste Mocks in KSHV-infizierten Endothelzellen herzustellen, um die Untersuchung von KSHV-assoziierten Veränderungen in der Genexpression von Wirtszellen zu ermöglichen, einschließlich Veränderungen, die die maligne Transformation im Rahmen geeigneter Kontrollen vorantreiben. Diese Methode kann dazu beitragen, die wichtigsten pathophysiologischen Veränderungen in der Wirtszellbiologie zu definieren, die zu KSHV-assoziierten Krebserkrankungen führen, und so neue therapeutische Ziele für die Prävention oder Behandlung von Krankheiten zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieses Systems besteht darin, dass die maligne Transformation von Endothelzellen nach einer Infektion mit KSHV schnell und reproduzierbar erfolgt, was die Untersuchung früher Ereignisse im onkogenen Prozess mit alters- und passageangepassten Kontrollzellen ermöglicht.

Obwohl dieses Modell der viralen Onkogenese Einblicke in die Entwicklung des Kaposi-Sarkoms geben kann, kann es auch auf andere Krebsarten angewendet werden. Da es sich beim Kaposi-Sarkom um einen Gefäßtumor handelt, erstrecken sich die Implikationen dieses Zellkulturmodells auf das Verständnis anderer Krankheitsprozesse, die durch pathologische Angiogenese angetrieben werden. Bereiten Sie zunächst den sterilisierten TNE-Puffer vor und filtrieren Sie ihn, wie im Textprotokoll beschrieben.

Lagern Sie die Lösung dann bei vier Grad Celsius. Kulturieren Sie die KSHV-positive EBV-negative primäre Effusionslymphom-Zelllinie BCBL-1 in einem T150-Kolben, der mit 60 Millilitern RPMI-Medium gefüllt ist. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius 5% Kohlendioxid, um eine Suspension von etwa 1 bis 1,2 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter zu erhalten.

Sobald die richtige Dichte erreicht ist, spalten Sie die Zellen eins zu zwei mit frischem Medium und fügen Sie PMA bis zu einer Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter hinzu, um die KSHV-Produktion zu induzieren. Dann inkubieren Sie die Kulturen fünf Tage lang. Nach fünftägiger Inkubation ernten Sie Viruspartikel, indem Sie die Zellsuspensionen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem 300-fachen g drehen.

Übertragen Sie dann die Überstände in ein neues Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Überstände erneut bei 2.500 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um Zelltrümmer zu entfernen. Jetzt, da es geklärt ist, überlagern Sie fünf Milliliter 25%ige Saccharoselösung in TNE mit etwa 30 Millilitern des Überstands in sechs Ultrazentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die ausbalancierten Röhrchen bei 75.000 g für zwei Stunden bei vier Grad Celsius unter Vakuum. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, dekantieren Sie den Überstand und tupfen Sie den Rand jedes Röhrchens ab, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Dann resuspendieren Sie das pelletierte Virus in 150 Mikrolitern TNE-Puffer und poolen Sie alle Proben.

Mischen Sie die gepoolte Suspension gründlich und teilen Sie sie in 25 Mikroliter Aliquote. Lagern Sie den Stockvirus bei minus 80 Grad Celsius. Primäre humane dermale, mikrovaskuläre oder lymphatische Endothelzellen in EGM-Medium in einem T75-Kolben kultivieren.

Halten Sie die Zellkultur bei 37 Grad Celsius 5 % Kohlendioxid, bis etwa 50 % Konfluenz erreicht sind. Vor der Transduktion von Endothelzellen werden PA317 LXSN 16E6E7-Zellen in einem T150-Zellkulturkolben kultiviert, der mit 20 Millilitern DMEM bei 37 Grad Celsius 5 % Kohlendioxid gefüllt ist. Sobald eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht ist, ersetzen Sie das Medium aus der PA317-Zellkultur durch 16 Milliliter frisches Medium und inkubieren Sie die Zellen über Nacht.

Nach einer Inkubation über Nacht wird das Medium aus der PA317-Zellkultur entnommen und durch Zentrifugation bei 300 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur geklärt. Ersetzen Sie das EGM-Medium aus 50 % konfluenter Endothelzellkultur durch 12 Milliliter des geklärten PA317-Mediums. Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang.

Ersetzen Sie dann sechs Milliliter des PA317-Mediums durch sechs Milliliter frisches EGM-Medium und inkubieren Sie die Zellen über Nacht. Entfernen Sie anschließend das Medium aus der Endothelzellkultur und füttern Sie die Zellen mit 12 Millilitern frischem EGM. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 48 Stunden.

Um Endothelzellen zu subkultivieren, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 12 Millilitern kationenfreiem PBS. Geben Sie dann drei Milliliter einer handelsüblichen enzymatischen Dissoziationslösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 g zentrifugiert.

Nach dem Pelletieren werden die Zellen in frischem EGM-Medium resuspendiert und die Suspension gleichmäßig auf drei T75-Kolben verteilt. Das Volumen der Kulturen wird auf 12 Milliliter EGM pro Kolben eingestellt. Fügen Sie dann 200 Mikrogramm pro Milliliter G418 hinzu, um transduzierte Endothelzellen auszuwählen.

Ernten Sie die transduzierten Endothelzellen durch enzymatischen Verdau, wie zuvor gezeigt. Resuspendieren Sie das Endothelzellpellet in einem Milliliter EGM-Medium. Mischen Sie dann fünf Mikroliter der Zellsuspension mit 45 Mikrolitern Trypanblau-Lösung und zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer.

2,5 mal 10 bis zur fünften lebensfähigen Zellen in zwei Milliliter EGM-Medium pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte säen. Entfernen Sie am nächsten Tag das EGM-Medium und waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit drei Millilitern PBS mit Kalzium und Magnesium. Geben Sie dann zwei Milliliter EBM-Medium in jede Vertiefung.

Um Zellen mit KSHV zu infizieren, geben Sie fünf bis 20 Mikroliter des Virusstocks in jede Vertiefung und schwenken Sie die Platte, um die Suspensionen zu mischen. Geben Sie ein gleiches Volumen TNE-Puffer in jede Vertiefung, die scheininfizierte Zellen enthält. Nachdem Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 mal g zentrifugiert haben, inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie dann zwei Milliliter EGM-Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Kulturen über Nacht. Entfernen Sie nach der Inkubation das EGM-Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter frisches EGM. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 90 % erreichen, ernten Sie sie durch enzymatische Verdauung, wie zuvor gezeigt.

Die Zellen aus drei Vertiefungen werden in einen T75-Kolben gepoolt, der mit der Anzahl der Gesamtpassagen in der Passage nach der Infektion beschriftet ist. Erweitern Sie vor dem Testen oder Einfrieren Schein- und KSHV-infizierte Endothelzellkulturen, indem Sie sie für mindestens zwei weitere Passagen um ein bis drei aufteilen. Hier ist ein mikroskopisches Bild von konfluenten, scheininfizierten Endothelzellen zu sehen, das das klassische Aussehen von Kopfsteinpflaster zeigt.

Die Zellteilung in diesen Zellen wird bei Kontakt gehemmt, wenn die Kultur den Zusammenfluss erreicht. KSHV-infizierte Endothelzellen entwickeln eine längliche, spindelartige Morphologie, die an Kaposi-Sarkom-Spindelzellen erinnert. Im Gegensatz zu den scheininfizierten Zellen vermehren sich KSHV-infizierte Endothelzellen auch dann weiter, wenn sie den Konfluenz erreichen, was zur Entwicklung mehrschichtiger Zellherde führt.

Wenn sie den Kontakt mit dem Substrat verlieren, durchlaufen scheininfizierte Endothelzellen einen apoptotischen Zelltod, Anoikis, und sie bilden keine Kolonien im weichen Agar. Im Gegensatz dazu sind KSHV-infizierte Zellen resistent gegen Anoikis und wachsende Kolonien, wenn sie in Weichagar kultiviert werden. Die Entwicklung der spindelförmigen Morphologie in KSHV-infizierten Endothelzellen geht einher mit der Expression des viralen Latenzproteins ORF73 und in geringerem Maße eines viralen Prozessivitätsfaktors ORF59.

Bei einer Infektion mit KSHV BAC16, das mit einem grün fluoreszierenden Protein markiert war, entwickelten die Endothelzellen eine spindelförmige Morphologie und zeigten eine GFP-Expression, die die zufällige Beziehung zwischen der KSHV-Infektion und dem beobachteten Phänotyp bestätigt. Nach seiner Entwicklung ebnete dieses Zellkulturmodell den Weg für Forscher, um Veränderungen der mRNA und der Proteinexpression von Wirtszellen zu bewerten, die durch eine KSHV-Infektion induziert werden. Daher wurden wichtige pathogene Mechanismen, die der KSHV-vermittelten Onkogenese zugrunde liegen, identifiziert, die vielversprechende therapeutische Ziele darstellen.

Vergessen Sie nicht, dass KSHV ein BSL-2-Wirkstoff ist und mit geeigneten Verfahren und Praktiken zur Eindämmung der biologischen Sicherheit gehandhabt werden sollte.