Name: Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von KSHV-infizierten Endothelzellen zur Untersuchung maligner Transformation. Dieses Modell ermöglicht die Analyse früher onkogener Ereignisse und die Identifizierung neuer therapeutischer Ansätze für Kaposi-Sarkom.

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Diese Arbeit wurde durch K12 HD068322 (SCM) unterstützt; R01 CA179921 und P51 OD011092 (AVM); und 14PRE20320014 aus Amerika Heart Association (SB).

Hinweis: alle in diesem Protokoll beschriebene Verfahren durchgeführt werden, unter Bedingungen der BSL-2.
 1. KSHV Lager Vorbereitung <ol><li>bereiten TNE Puffer: auflösen 292,24 mg EDTA in DdH 2 O, 225 mL bringen, und passen Sie auf pH 8. 605,7 mg Tris in DdH 2 O auflösen, bis 225 mL bringen und auf pH 8 anpassen. EDTA und Tris Lösungen kombinieren, hinzufügen 4,38 g NaCl, endgültige Lautstärke bis 500 mL, filtern, Sterilisation und Lagerung bei 4 ° C .</li>
	<li>Kultur KSHV-positiv, EBV-Negative primären Erguss Lymphome Zelllinie BCBL-1 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C plus 5 % CO 2 in RPMI ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und Antibiotika, ca. 1 1.2 x 10 6 Zellen pro mL.</li>
	<li>Induzieren KSHV Produktion aufgeteilt Kulturen 1:2 mit frischem Medium und eine Endkonzentration von 20 ng/mL Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) hinzu und inkubieren Sie Kulturen für 5 Tage. Als Alternative Behandlung von Zellen mit Natrium-Butyrat (NaB; 0,1 mM) für 3 Tage induzieren lytische Virusreplikation.</li>
	<li>Um Viruspartikel zu ernten, Zentrifugieren Sie zuerst die Kultur Überstand bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur pellet-Zellen und Überstände auf frischen Rohre übertragen.</li>
	<li>Zur weiteren Klärung des Überstands um Zelltrümmer, vermeiden Zentrifugieren bei 2.500 x g für 10 min bei 4 ° c 
	Hinweis: als Alternative zu high-Speed Zentrifugation zur Klärung der Kultur Überstände, Filtration durch eine sterile 0,45 µm Filter durchgeführt werden kann. Wir haben einen deutlichen Rückgang der Titer mit Filtration beobachtet; Daher führen wir den zweiten Zentrifugationsschritt routinemäßig statt.</li>
	<li>5 mL 25 % Saccharoselösung in TNE Puffer mit etwa 30 mL der Überstand in 6 Ultrazentrifugen Rohre geklärte Kultur als nächstes überlagern.</li>
	<li>Zentrifuge ausgeglichen bei 75.000 x g für 2 h bei 4 ° C unter Vakuum Röhren.</li>
	<li>Kultur überstand abgießen und tupfen Sie den Rand des jedes Rohr, so viel überstand und Saccharose Lösung wie möglich zu entfernen, dann Aufschwemmen der Virus-Pellets, die möglicherweise nicht sichtbar, in 150 µL TNE Puffer.</li>
	<li>Alle Pool Nukleinsäuretablette Virus, vermengen, und frieren 25 µL-Aliquots bei-80 ° C .</li>
</ol> 2. Transduktion der EG mit E6 und E7 Papillomavirus Genes Hinweis: Wir verwenden routinemäßig standard Gewebe Kulturflaschen für den Anbau von primären EC Jedoch wenn unbefriedigende Wachstum der EG erhalten werden dann die Verwendung von kommerziellen Kulturflaschen berücksichtigt werden.
<ol><li>Kultur primären menschlichen dermalen mikrovaskuläre oder lymphatischen EG in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C plus 5 % CO 2 im EG Wachstumsmedium (EGM; enthält EG basal Medium [EBM] mit EGM-2 BulletKit [mit FBS, ergänzt Hydrocortison, menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-B vaskulären EG Wachstumsfaktor, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-1, Ascorbinsäure, menschliche epithelialen Wachstumsfaktor, Antibiotika und Heparin]) in einem T75 Zelle Kultur Kolben um ca. 50 % Zusammenfluss.</li>
	<li>Für die Transduktion, Kultur PA317 LXSN 16E6E7 Zellen 24 , 35 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C zuzüglich 5 % CO 2 in DMEM mit 10 % FBS und Antibiotika in ergänzt eine T150 Zelle Kultur Flasche bis sie ca. 90 % Zusammenfluss sind. Dann über Nacht in 16 mL Medium inkubieren.</li>
	<li>Das PA317 Medium durch Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur zu klären.</li>
	<li>Entfernen die EGM aus den EG-Kultur und Overlay-Zellen mit 12 mL des Mediums geklärte PA317 und inkubieren Sie für 4 Std. 
	Hinweis: Zentrifugieren 16 mL konditionierten Medium 300 X g für 5 min ergibt eine kompakte Kugel, die durch die sorgfältige nachträgliche Entfernung von 12 mL geklärte Überstand nicht gestört wird. Jedoch wenn Übertragung der PA317 LXSN 16E6E7 Zellen Primärkulturen EG ist ein Anliegen (die Verpackung-Zell-Linie wird schnell entwachsen EG), dann Filtration von konditionierten Überstand durch einen 0,45 µm-Filter vor dem Transfer erfolgen kann.</li>
	<li>6 mL des Mediums PA317 mit frischen EGM zu ersetzen und über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Refeed EG mit 12 mL frische EGM und inkubieren Sie eine weitere 48 h.</li>
	<li>EG, Sub-Kultur Medium zu entfernen und waschen mit 12 mL PBS ohne kationen, und geben Sie 3 mL kommerzielle enzymatische Dissoziation Lösung (z.B. TrypLE) und Inkubation bei 37 ° C für 3 min.</li>
	<li>Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr übertragen und Zentrifugieren bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aufschwemmen der daraus resultierenden Zelle Pellet in frischen EGM und teilen gleichmäßig in 3 x T75 Flaschen mit einem Endvolumen von 12 mL EGM pro Flasche.</li>
	<li>G418 hinzufügen um EG ausgestrahlt mit E6 und E7 zu wählen, eine Endkonzentration von 200 µg/mL für zwei Durchgänge, nach denen die transduced EG vernickelt für Infektion oder in flüssigem Stickstoff eingefroren.</li>
</ol> 3. Infektion der ausgestrahlt EG mit KSHV <ol><li>am Tag vor der Infektion ernten EG durch enzymatische Verdauung mit der kommerziellen enzymatische Dissoziation-Lösung, wie oben beschrieben. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 1 mL der EGM. Verwenden Sie 5 µL Zellen, um eine 1/10-Verdünnung in Trypan blau vorzubereiten. Lebende Zellen mit einem Hemocytometer zu zählen und Samen 2,5 x 10 5 lebende Zellen in 2 mL EGM pro Bohrloch in 6-well-Platten.</li>
	<li>Am Tag der Infektion entfernen EGM waschen Zellen mit 3 mL PBS mit Calcium und Magnesium pro Bohrloch, und fügen Sie dann 2 mL EBM. 
	Hinweis: Es ist unerlässlich, EBM, anstatt EGM während der Infektion, zu verwenden, wie das Heparin in EGM Viruspartikel zu Bindung und anschließende Infektion des Ziels EC hemmen wird</li>
	<li>Zellen mit KSHV, infizieren 5 bis 20 µL Virus Brühe in jede Vertiefung und wirbeln Teller mischen. Für Mock-infizierten Zellen ein gleiches Volumen an TNE Puffer in jede Vertiefung hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Platten bei 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 90 min.</li>
	<li>, Wenn das Ziel der Studie werden frühe Ereignisse erfordern eine synchrone virale Infektion, z.B. frühe Ereignisse in de Novo Infektion untersucht soll entfernen das virale Inokulum an dieser Stelle. Spülen und refeed Zellen mit 2 mL frische EGM. Andernfalls fügen 2 mL EGM und Kulturen über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Zellen mit 2 mL EGM am Tag nach der Infektion und dann jeden zweiten Tag refeed.</li>
	<li>Wenn Zellen sind etwa 90 % Zusammenfluss Ernten durch enzymatische Verdauung mit kommerziellen enzymatische Dissoziation-Lösung wie oben beschrieben, dann die Zellen aus drei Brunnen in einem T75 unter Hinweis auf die gesamte Durchgangsnummer und die Passage zu bündeln nach der Infektion.</li>
	<li>Erweitern Mock und KSHV-infizierten EG mit 1:3 Zwischenzeiten für mindestens zwei weitere Passagen zu welchem Zeitpunkt Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren oder in Experimenten verwendet werden können. 
	Hinweis: Wie bei der Aufteilung der EG mit E6 und E7 ausgestrahlt, Wartung Kulturen von Mock und KSHV-infizierten Zellen sollte aufgeteilt werden vor dem Erreichen der Mündung (~ 85 bis 90 %).</li></ol>
 4. Bestätigung Infektion mit KSHV durch Immunfluoreszenz Hinweis: Erkennung von der KSHV Latenz-assoziierten nuclear Antigen (LANA-1/ORF73) bietet eine zuverlässige quantitative Messung der Infektion. Anti-LANA-Antikörper sind im Handel erhältlich.
<ol><li>Am Tag vor der Färbung, Platte zwei Brunnen, die jeweils mit Mock-KSHV-infiziert oder EG auf einer 24-Well-Platte 1 x 10 5 pro Zellen nun in 1 mL EGM und über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Waschen Zellen zweimal mit 500 µL PBS plus Calcium und Magniseum. Waschen für 30 s auf einem schaukelnden Plattform.</li>
	<li>Zellen mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur in einem extern-beatmete Dampfhaube befestigen.</li>
	<li>Waschen Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer (0,1 % Triton x-100 plus 0,02 % Ziegenserum in PBS plus kationen).</li>
	<li>Zellen mit 500 µL 2 % Ziegenserum in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur blockieren.</li>
	<li>Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.</li>
	<li>Kennzeichnen einen Brunnen von Mock-KSHV-infiziert oder EG mit 200 µL Primärantikörper 01:10 verdünnt0 in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Inkubieren Sie die verbleibenden zwei Brunnen in 200 µL Waschpuffer nur.</li>
	<li>Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.</li>
	<li>Beschriften aller vier Brunnen mit 200 µL Sekundärantikörper verdünnt 1: 100 in Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Rocker.</li>
	<li>Zellen dreimal mit 500 µL Waschpuffer waschen.</li>
	<li>In jede Vertiefung gelten 20 µL Montage mittlerer mit DAPI und ein Deckglas und bewerten Färbung mit einem inversen Mikroskop fluoreszierende.</li>
	<li>Bestimmen die prozentuale Infektion KSHV-infizierten Zellen durch zählen der Anzahl der LANA-positiven Kerne in mindestens 200 Zellen. Infektion mit rekombinanten KSHV-Bac16 sich auch durch Beobachtung der Kulturen für den Ausdruck der GLP lässt.</li>
</ol>

Onkogenese ist ein mehrstufiger Prozess, der wichtige Sicherheitsvorkehrungen innerhalb eines Organismus36umgeht. KS-Läsionen entlang ein Spektrum der chronischen Entzündung zu wahren Sarkome bestehen, erfordert Aufklärung bestimmter pathophysiologischen Prozesse durch KSHV vermittelt, dass einige Studien in Zellmodellen Kultur durchgeführt werden, die Umwandlung9unterstützen. Es sollte angemerkt werden, dass Verlust von Kontakt-Hemmung und Anchorage-abhängigen Wachstum, Ph...

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Multi-focal Angioproliferative Tumor Auswirkungen auf Haut, Schleimhaut und viszeralen Websites, der am häufigsten in der Umgebung von fortgeschrittenen Immununterdrückung1entwickelt. Vier epidemiologische Formen sind beschrieben worden: Classic, eine träge Form, das in der Regel ältere Menschen des Mittelmeerraums und des Nahen Ostens Erbes; iatrogene, durch Behandlung mit immunsuppressiven Medikamenten nach Organtransplantationen; Epidemie, eine AIDS-definierenden Krebs; und eine HIV-unabhängige Form häufig bei Kindern in endemischen Gebieten in Afrika endemisch. Mit dem Aufkommen der effektive Kombination Anti-retroviral Drogen-Therapien für die Behandlung von HIV ist Epidemie KS in Entwicklungsländern viel seltener diagnostiziert. Jedoch bleiben die klinisch aggressiven endemischen und epidemischen Formen unter die am häufigsten diagnostizierten Krebsarten in vielen afrikanischen Ländern2,3,4. Daher ist die Identifizierung von wirksame Pathogenese gezielt Medikamente zur Behandlung von KS Forschungsschwerpunkt.
Histologisch, zeichnen sich KS-Läsionen durch umfangreiche aber abnorme Neovaskularisation wobei Spindel Zellen EG Ursprungs diskontinuierliche vaskulären Netzwerken5bilden. Diese abnormen Gefäße ("vaskuläre Schlitze") erlauben Extravasation der Erythrozyten, die Läsionen ihre charakteristische Farbe geben. Darüber hinaus enthalten Läsionen zahlreiche Leukozyten, die chronischen Entzündung (z.B. Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen) charakterisieren. Rückbildung der KS-Läsionen nach Immunrekonstitution wurde beschrieben, was darauf hindeutet, dass KS Funktionen einer hyper-proliferative Läsion und wahre Tumor6,7,8,9.
KS Herpesvirus (KSHV), dem Erreger der KS, wurde im Jahr 199410identifiziert. Seit dann viele in Vitro Zellkultur Modelle entwickelt worden um Pathogenese Studien ermöglichen, einschließlich der Zellen aus Biopsie Tumormaterial und primäre explantiert oder Telomerase exprimierenden EG infiziert mit KSHV in-vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. keines der derzeit verfügbaren Modelle voll rekapituliert die KS Tumor Mikroumgebung, aber alle haben wertvolles Wissen zu unserem Verständnis der Pathobiologie KSHV Infektion beigetragen. Im Gegensatz zu den anderen bekannten tumorigenic menschliche Herpesvirus Epstein - Barr-Virus (EBV), KSHV nicht leicht transformiert Zellen in Kultur nach de Novo Infektion19,20,21, 22. aber diese Einschränkung überwunden durch transducing primären menschlichen EG entweder gemischt mikrovaskuläre oder lymphatischen Ursprungs mit der E6 und E7 Gene aus humanem Papillomavirus Typ 16 vor der Infektion mit KSHV23,24 . Ausdruck dieser exogene Onkogene erhöht drastisch das transformierende Potenzial der KSHV in-vitro- teilweise durch weitere Hemmung der Retinoblastoma Protein und p5323,24. Diese EG-Transduktion Methode hat mehrere Labore, wichtige Veränderungen im Host zu identifizieren erlaubt Zelle Genexpression, die durch KSHV Infektion hervorgerufen und, die Erleichterung der KS Zelle überleben und Verbreitung25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. der hierin beschriebenen Protokolle sind unkompliziert und hoch reproduzierbare und führt zu der Generation von Alter und Durchgang abgestimmt KSHV-infizierten EG und Mock-infizierten Steuerelemente, können viel länger als primäre Zellen gezüchtet werden und werden, ermöglichen Sie die Untersuchung von onkogenen Mechanismen KSHV angestellt. Obwohl das Protokoll enthält ein Verfahren zur Herstellung von Wildtyp KSHV aus der primären Erguss Lymphome Zelllinie BCBL-1, E6/E7-verewigt EG sind auch sehr anfällig für Infektionen mit rekombinanten BACmid abgeleitet KSHV-BAC1630. Protokolle für die Vorbereitung des BAC16 sind an anderer Stelle beschrieben33,34.

<table><tbody><tr><td>BCBL-1-Zellen</td><td>NIH AIDS Reagenzprogramm</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Neugeborene dermale mikrovaskuläre Endothelzellen</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basalmedium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLETMExpress, ohne Phenolrot</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS mit Calcium und Magnesium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein in-vitro- modell für die erforschung der zellulären transformation von kaposi-sarkom-herpesvirus

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi-Sarkom (KS) ist eine ungewöhnliche Tumor bestehend aus wuchernden Spindel Zellen, die durch Infektion der Endothelzellen (EG) mit KSHV initiiert und entwickelt sich in den meisten Fällen im Rahmen der Immunsuppression. Trotz jahrzehntelanger Forschung optimale Behandlung von KS bleibt schlecht definiert und klinischen Ergebnisse sind besonders ungünstig in beschränkten Ressourcen. KS-Läsionen sind getrieben von pathologischen Angiogenese, chronische Entzündungen und Onkogenese und verschiedene in-vitro- Kultur Zellmodelle wurden entwickelt, um diese Prozesse zu studieren. KS ergibt sich aus KSHV-infizierten Zellen endothelialen Ursprungs, also EC-Linie Zellen am besten geeignete in-vitro- Surrogate von der Spindel Zelle Vorläufer zur Verfügung stellen. Da EG haben eine begrenzte in-vitro- Lebensdauer, und die onkogenen Mechanismen KSHV angestellt sind weniger effizient als die der anderen tumorigenic Viren, es war jedoch schwierig zu beurteilen, die Prozesse der Transformation in der PV oder Telomerase-verewigt EC Daher wurde ein neuartiger EG basierende Kultur-Modell entwickelt, die Transformation nach Infektion mit KSHV bereitwillig unterstützt. Ektopische Expression der Gene des menschlichen Papillomavirus Typ 16 E6 und E7 erweiterte Kultur von Alter und Durchgang abgestimmt Mock und KSHV-infizierten EG ermöglicht und unterstützt die Entwicklung einer wahrhaft transformierten (d. h. tumorigenic) Phänotyp in infizierten Zellkulturen . Diese gefügig und hoch reproduzierbare Modell KS hat die Entdeckung von mehreren wesentlichen Signalwege mit hohem Potenzial für die Übersetzung in klinischen Umgebungen erleichtert.

Die Morphologie der primären EG wird klassisch als "Kopfsteinpflaster" beschrieben, und diese Morphologie wird nicht durch Ausdruck der Papillomavirus E6 und E7 Gene (Abbildung 1A) verändert. Ausdruck der E6 und E7 Gene allein nicht dazu veranlassen, einen veränderten Phänotyp; so Zellen sind anfällig für Hemmung wenden Sie sich an und werden nicht mehr geteilt beim Zusammenfluss in Kultur zu erreichen. Die Zellen werden jedoch vermehren und nachwachsen, Zusammenfluss von...

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Tumor induziert durch eine Infektion mit onkogenen Viren menschliche Herpesvirus-8/KS Herpesvirus (HHV-8/KSHV). Die Endothelzellen Kultur Modell hier beschriebenen eignet sich eindeutig für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen KSHV Wirtszellen verwandelt.

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, alters- und passageangepasste Mocks in KSHV-infizierten Endothelzellen herzustellen, um die Untersuchung von KSHV-assoziierten Veränderungen in der Genexpression von Wirtszellen zu ermöglichen, einschließlich Veränderungen, die die maligne Transformation im Rahmen geeigneter Kontrollen vorantreiben. Diese Methode kann dazu beitragen, die wichtigsten pathophysiologischen Veränderungen in der Wirtszellbiologie zu definieren, die zu KSHV-assoziierten Krebserkrankungen führen, und so neue therapeutische Ziele für die Prävention oder Behandlung von Krankheiten zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieses Systems besteht darin, dass die maligne Transformation von Endothelzellen nach einer Infektion mit KSHV schnell und reproduzierbar erfolgt, was die Untersuchung früher Ereignisse im onkogenen Prozess mit alters- und passageangepassten Kontrollzellen ermöglicht.Obwohl dieses Modell der viralen Onkogenese Einblicke in die Entwicklung des Kaposi-Sarkoms geben kann, kann es auch auf andere Krebsarten angewendet werden. Da es sich beim Kaposi-Sarkom um einen Gefäßtumor handelt, erstrecken sich die Implikationen dieses Zellkulturmodells auf das V

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wirtszelle Faktoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Errichtung und Wartung von Kaposi-Sarkom (KS). Wir skizzieren Methoden zur Wirtszelle Faktoren in KSHV-infizierten DMVEC Zellen verändert zu identifizieren und in KS Tumorgewebe. Zellulären Genen durch Viren verändert wird als potenzielles Ziel (e) für neuartige Therapeutika dienen.

Identifizieren Dysregulated Gene von Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) Induced

Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Verfahren zur Beobachtung der einzelnen DNA-Molekülen in lebende Zellen beschrieben. Die Technik basiert auf der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Proteins an lac-Repressor-Bindungsstellen in die DNA von Interesse entwickelt basiert. Dieses Verfahren kann gut auf rekombinanten DNAs in lebende Zellen im Laufe der Zeit zu folgen.

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Quelle: McAllister, S. C., Hanson, R. S., et al. Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der zellulären Transformation durch das Kaposi-Sarkom-Herpesvirus. J. Vis. Exp.(2017)Dieses Video demonstriert die retrovirale Transduktion primärer endothelialer Zellen mit den HPV16-E6/E7-Onkogenen. Die integrierten Onkogene inaktivieren die Tumorsuppressoren p53 und Rb und verlängern dadurch die Zelllebensdauer. Die G418-Selektion bereichert transduzierte Zellen und ergibt immortalisierte endotheliale...

Immortalisierung von Endothelzellen durch retrovirale Transduktion viraler Onkogene

Wir beschreiben ein Protokoll, um die antivirale Zytokin-Produktion in Mäusen mit einem Modell-Herpesvirus, murinen Gammaherpesvirus-68 (γ HV68) infiziert, die für die menschliche Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) und Epstein-Barr-Virus (EBV) eng verwandt ist, zu messen. Mit Hilfe genetisch veränderter Mausstämme und embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF), untersuchten wir die antivirale Zytokin-Produktion in vivo und ex vivo. "Reconstituting" den Ausdruck der angeborenen...

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

Wir haben eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsprotokoll für den Nachweis eines persistenten DNA-Virus-Genom in Gewebeschnitten von Tiermodellen. Dieses Protokoll ermöglicht das Studium Infektionsprozess von codetection des viralen Genoms, dessen RNA-Produkte, und viralen oder zellulären Proteinen in einzelnen Zellen.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Phänotypische Wildtyp-Astrozyten und neurale Stammzellen, die von Mäusen entnommen wurden, die mit floxierten, bedingten onkogenen Allelen gezüchtet und über virale Cre-vermittelte Rekombination transformiert wurden, können zur Modellierung der Astrozytom-Pathogenese in vitro und in vivo durch orthotope Injektion von transformierten Zellen in Gehirne von syngenen, immunkompetenten Wurfgeschwistern verwendet werden.

Modellierung Astrozytom Pathogenese In-vitro- Und In Vivo Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines tumortragenden Mausmodells zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung.

Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese

Dieses Protokoll bietet experimentelle In-vitro-Werkzeuge zur Bewertung der Transformation menschlicher Brustzellen. Detaillierte Schritte zur Nachverfolgung der Zellproliferationsrate, der verankerungsunabhängigen Wachstumskapazität und der Verteilung von Zelllinien in 3D-Kulturen mit Kellermembranmatrix werden beschrieben.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro System zur Modellierung der de novo lytischen Infektion des Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus unter Verwendung von BAC16-abgeleiteten Virionen. Die Methode ermöglicht die Untersuchung der frühen Virusreplikation und -verbreitung. Die Produktion infektiöser Viren wird durch GFP-basierte Assays für infektiöse Einheiten und Echtzeit-PCR von verkapselten Virusgenomen quantifiziert.

Etablierung und Quantifizierung der de novo lytischen Infektion durch zellfreies Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus

Erfahren Sie die Kultivierung von KSHV-infizierten Endothelzellen zur Untersuchung maligner Transformation. Dieses Modell ermöglicht die Analyse früher onkogener Ereignisse und die Identifizierung neuer therapeutischer Ansätze für Kaposi-Sarkom.

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

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