Name: Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Erfahren Sie, wie ein HBV-Reporter-System die frühen Stadien des Hepatitis-B-Virus-Replikationszyklus überwacht. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von Anti-HBV-Wirkstoffen in HepG2-Zellen.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch das Forschungsprogramm für Hepatitis der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) und durch Grants-in-Aids für wissenschaftliche Forschung des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) unterstützt.

1. Herstellung von rekombinanten HBV die Reporter-Protein kodiert <ol><li> Herstellung von HepG2 - Zellen <ol><li> Bereiten Zellkulturmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 U / ml nicht-essentiellen Aminosäuren). </li><li> Platte 4 x 10 6 HepG2 - Zellen in einer 10-cm kollagenbeschichtete Schale in 10 ml des Kulturmediums am Tag vor der Transfektion. Inkubieren HepG2 - Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator. HINWEIS: Bei ca. 4 x 10 6 HepG2 - Zellen in einem 10 cm Kollagen-beschichtete Schale in 10 ml Kulturmedium plattiert sind, werden sie 70-90% konfluent am nächsten Tag. </li></ol></li><li> Transfection <ol><li> Transfizieren HepG2 - Zellen mit 5 ug pUC1.2HBV delta epsilon 15 und 5 ug pUC1.2HBV / NL 15 eine Transfektion unter Verwendung vonReagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie das Kulturmedium und 10 ml frisches Kulturmedium hinzuzufügen. </li><li> Eine Woche nach der Transfektion übertragen das Kulturmedium, das rekombinante HBV in ein 50 ml-Röhrchen mit und gehen zu Schritt 1.3.1. 10 ml frisches Kulturmedium auf die Platte, die transfizierte Zellen enthalten. HINWEIS: Die Produktion des rekombinanten HBV wird 4 Wochen aufrechterhalten. Das Kulturmedium rekombinanter HBV enthält, kann für 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol></li><li> Reinigung rekombinanter HBV <ol><li> Entfernen Zelltrümmer aus dem Kulturmedium rekombinanter HBV durch Zentrifugation (2.300 × g für 5 min) enthält. </li><li> Führen Sie den Überstand durch ein 0,45 um Membranfilter. </li><li> Ein gleiches Volumen von 26% PEG / 1,5 M NaCl (Polyethylenglykol 6000: 130 g NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 und 5 ml 1 M HEPES, pH 7,6 in 500 ml) zu dem Kulturmedium enthaltend rekombinantesanft HBV und mischen. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge bei 2.300 xg für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und lösen Sie das Pellet in 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). </li><li> Entfernen der Trümmer durch Zentrifugation bei 2.300 xg für 5 min. </li><li> Belastung 0,5 ml TNE rekombinanten HBV auf 0,8 ml 20% Saccharose in TNE enthält. </li><li> Zentrifuge bei 100.000 × g für 3 Stunden bei 15 ° C. </li><li> Verwerfen, so viel von dem Überstand wie möglich, und das Pellet speichern. Resuspendieren in 1 ml serumfreiem DMEM pro 40 ml Kulturmedium zu starten. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Man filtriert durch ein 0,45 um-Filter. Bereiten Sie 0,5 ml Aliquots und bei -80 ° C. HINWEIS: Wenn Reporterprotein Kontamination des ursprünglichen Virusprobe beobachtet wird, reinigen das Virus durch Dichtegradientenzentrifugation Ultrazentrifugation von 5-30% Saccharose in TNE bei 100.000 × g für 2 Stunden, oder CsCl Dichte ins Gleichgewicht gebracht Zentrifugation from 1,1-1,6 g / ml bei 150.000 xg für 50 Std. </li></ol></li></ol> 2. Infektion von rekombinanten HBV <ol><li> Kultur HepG2 - Zellen stabil exprimieren NTCP (HepG2 / NTCP) 15 , das mit 10% FBS ergänzt HBV - Infektion in DMEM anfällig sind, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 250 ug / ml G-418 und 100 U / ml nicht - essentielle Aminosäuren bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Einen Tag vor der Infektion, Platte ca. 5 x 10 4 HepG2 / NTCP Zellen 14 in eine 96-Well - Kollagen - beschichtete Platte in 0,1 ml Kulturmedium. </li><li> Thaw rekombinante HBV in einem 37 ° C Wasserbad, bis ein kleines Stück Eis in der Flasche bleiben. </li><li> Vorbereiten des Mediums für eine Infektion durch Vereinigen der folgenden: 10 &amp; mgr; l von 40% PEG8000 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 2 &amp; mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO), 10 ul rekombinanter HBV und 78 &amp; mgr; l frisches Kulturmediumpro Well einer 96-Well-Platte. </li><li> 100 l rekombinanten HBV-Lösung in eine Vertiefung der 96-Well-Platte. </li><li> Einen Tag nach der Infektion, waschen Sie die infizierten Zellen 3-mal mit 300 &amp; mgr; l PBS pro Vertiefung der verunreinigenden Reporterprotein aus der Virusfraktion zu entfernen. </li><li> Inkubieren infizierten Zellen in 200 ul Kulturmedium, das 2% DMSO für eine Woche oder weniger. </li></ol> 3. Analyse <ol><li> Eine Woche nach der Infektion, waschen Sie die infizierten Zellen 3 mal mit PBS. </li><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l Lysepuffer zu den infizierten Zellen. </li><li> Rock the Kulturplatte für 5 Minuten, und dann Zentrifuge bei 2000 xg für 5 min. </li><li> In 50 ul des Reportersubstrat in das Luminometer Platte. </li><li> In 20 ul Zelllysat zu einem Luminometer Platte das Reportersubstrat enthält. Mischen Sie durch kurzes Vortexen. </li><li> Die Platte wird in das Luminometer und initiieren 15 zu lesen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das HBV - Genom hat vier primäre offene Leserahmen (ORFs) , einschließlich des Kerns, Polymerase, Oberflächen und X ORFs (Abbildung 1). Die Transkription dieser vier HBV ORFs dicht durch vier Promotoren reguliert wird: die Precore / Kern - Promotor - Enhancer enthält , II, S1 - Promotor, S2 Promotor und X - Promotor enthält Enhancer I 18. Die 3,5 kb und 3,4 kb mRNAs werden in Precore und Core Proteine ​​übersetzt sind. Die große Hüllprotein (L) von der größten subgenomischen mRNA...

Chronische Infektion mit dem Hepatitis - B - Virus (HBV) ist ein wichtiger Risikofaktor für chronische Lebererkrankungen 1. Obwohl die derzeitigen therapeutischen Strategien auf Nukleotid - Analoga basieren, die HBV - pol Funktion und / oder die Verabreichung von Typ - I - Interferon hemmen , die diese Behandlungen können HBV nicht beseitigen Immunantworten bei infizierten Personen sowie indirekt Unterdrückung der HBV - Proliferation durch, 2 Funktionen Interferon-stimulierte Gen aktiviert DNA vollständig 3. Die Entstehung von HBVs Darüber hinaus, die Mittel anti-pol resistent sind von Belang ist 4. Die Verabreichung der kombinierten antiviralen Mitteln direkt die verschiedenen Schritte des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) oder Hepatitis-C-Virus (HCV) Lebenszyklus wurde Targeting gezeigt, erfolgreich zu unterdrücken oder den Virus (es) zu beseitigen. Ähnlich wie diese Idee, die Entwicklung von anti-HBV-Mittel (n), die direkt auf den verschiedenen Stufen des H handelnBV Lebenszyklus ist wichtig für die Zukunft HBV Therapien zu etablieren. Im Allgemeinen erleichtert die Schaffung eines einfachen in vitro - Kultursystem des Zielvirus die Entwicklung von Antivirusmitteln. Es gibt jedoch mindestens zwei Hindernisse für die Entwicklung von in vitro Kultursystemen anti-HBV - Mittel zu screenen. Die erste ist das Fehlen einer geeigneten in vitro - Zellkultursystem für die HBV - Infektion / Proliferation. Im Gegensatz zu anderen Viren, wie HIV und HCV, die in etablierten Zelllinien vermehrt werden, ist es schwierig , HBV in vitro zu kultivieren , da der experimentellen Beschränkungen einschließlich einer engen Wirtsbereich. Die Verwendung von spezifischen Zellkultursystemen wie dem menschlichen Hepatom - Zelllinie HepaRG, die HBV - Infektion empfänglich ist, 5, 6, 7 wurden , um diese Probleme zu überwinden , entwickelt. Darüber hinaus PXB Zellen, isoliert von Urokinase-type - Plasminogen - Aktivator transgenen / SCID - Mäuse mit primären humanen Hepatozyten (PHH) geimpft wurden zu einer HBV - Infektion und Replikation 8 bis anfällig gezeigt. HBV-Replikationsniveaus in HepaRG sind jedoch abhängig von dem zellulären Differenzierungszustand nach der Kultur, die inkonsistente und nicht reproduzierbare Ergebnisse der HBV-Infektion / Replikation Niveaus führen kann. PXB wird häufig für HBV-Infektion Experimenten verwendet, sondern wird durch die Verfügbarkeit begrenzt. Ein Tetracyclin induzierbare Expressions HBV Zellinie HepAD38, wurde ebenfalls weit verbreitet HBV - Replikation zu untersuchen, aber dieses System erlaubt nur Auswertung nach der Transkription und nicht am Eingang Schritt des HBV - Infektion 9. Vor kurzem hat die Identifizierung von Natriumtaurocholat cotransporting Polypeptid (NTCP) als funktioneller Rezeptor für HBV 10 die Entwicklung einer Variablen HBV Kultursystem erlaubt. Tatsächlich NTCP Expression in nicht-empfindlichen hepatocarcinoma Zellen wie Huh7 undHepG2 ermöglicht HBV - Infektion 10 und somit die Wahl der HBV empfänglichen Zelllinien expandiert wurde, sind viele der experimentellen Beschränkungen lösen. Das zweite Problem ist das Fehlen eines einfachen Testsystems HBV-Infektion und Replikation zu bewerten. Bewertung der HBV-Infektion wird in der Regel durch die Analyse von HBV-DNA, RNA und Proteinen durchgeführt. Allerdings Quantifizierung dieser Virusmarker ist zeitraubend, oft teuer und nicht immer einfach. Daher kann die Entwicklung eines einfachen Testsystems, wie beispielsweise ein Reporter-Gen verwendet, Probleme mit dem HBV-Assay-Systeme assoziiert überwinden. Da jedoch die Genomgröße, die in einer HBV - Kapsid verpackt werden kann , ist begrenzt - weniger als 3,7 kb 11 - die Größe eines Reportergens sollte so kurz wie möglich sein. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von mehreren cis-Elemente über das Genom verstreut sind, die für die virale Replikation essentiell sind, begrenzt die verfügbaren Positionen in<html> Einsetzen des Reportergens in das Genom. Mehrere Berichte haben fremde Gene einzuführen versucht, einschließlich HIV-1 Tat, grün fluoreszierendes Protein und DsRed, in das HBV - Genom 11, 12, 13. Jedoch sind diese rekombinanten HBVs nicht nützlich für das Screening von HBV-Infektion / Replikation, oder der Hochdurchsatz-Screening von Faktoren HBV-Infektion / Replikation zu beeinflussen. Dies ist vor allem wegen der geringen Produktivität von rekombinanten Viren und die reduzierte Intensität der Reportergenexpression durch ineffiziente Virusproduktion verursacht. Um diese Probleme zu überwinden, bauten wir einen Reporter HBV mit einer hohen Ausbeute an Virusproduktion. Dieses Virus ist sehr empfindlich für die Überwachung der frühen Phasen des HBV-Replikationszyklus von der Eingabe auf die Transkription. Um dies zu erreichen, wurde NanoLuc (NL) als Marker-Gen ausgewählt, weil es eine kleine (171 Aminosäuren) wurde entwickelt, lumineszente reporterclass = &quot;xref&quot;&gt; 14. Außerdem ist NL etwa 150-fach heller als firefly oder Renilla-Luciferase und die Lumineszenzreaktion ist ATP-unabhängig, was darauf hindeutet, dass die falsche Trefferrate niedrig sein wird für die Hochdurchsatz-Screening. Die Produktionseffizienz des rekombinanten HBV beträgt etwa 1/5 der Mutter HBV und ähnliche Ebenen für frühere HBV rekombinanten Viren berichtet; jedoch überwindet die Helligkeit NL Virus Produktivitätsprobleme, so dass es für das Massenscreening von anti-HBV-Mittel verwendet werden. Screening von anti-HBV-Mittel unter Verwendung von primären Hepatozyten, HepaRG, HepAD38 und NTCP transduzierten Hepatozyten können für das Screening von anti-HBV-Mittel durch herkömmliche Verfahren (n) nützlich sein. Jedoch das hier beschriebene System hat verschiedene Vorteile, wie einfache Handhabung, hohe Empfindlichkeit und geringe Kosten für das Screening. Diese Vorteile sind für Hochdurchsatz-Assays zu entwickeln und neue HBV Mittel für therapeutische Zwecke zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Nano-Glo Luciferase Assay Regent</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mischlösung</td><td>Nacalai tesque</td><td>09367-34&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 11140050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 31985070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm/kollagenbeschichtete Schale</td><td>Iwaki</td><td>4020-010</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol (PEG) 6000&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81255</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol (PEG) 8000&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai tesque</td><td>31319-45&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mol/L EDTA Lösung</td><td>Nacalai tesque</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP, 0,45 &mu; m, Polyethethersulfon, Filter</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenbeschichtete 96-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>NO3585</td><td></td></tr><tr><td>Passive Lyse 5x Puffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96 Mikrotiterplatten-Luminometer</td><td>Promega</td><td>E6501</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30403-55</td><td></td></tr><tr><td>Luminometerplatte</td><td>Greiner bio-one</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>HepG2-NTCP1-myc-clone22</td><td>-</td><td>-</td><td>Referenz 15</td></tr><tr><td>pUC1.2HBV delta epsilon</td><td>-</td><td>-</td><td>Referenz 15</td></tr><tr><td>pUC1.2HBV/NL-</td><td></td><td></td><td>-Referenz 15</td></tr><tr><td>50 ml Tube</td><td>Violamo</td><td>1-3500-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3956</td><td></td></tr><tr><td>HBIG</td><td>Japan Blood Products</td> <td>Organization-IFN</td><td></td></tr><tr><td>-&beta;</td><td>Mochida</td><td>Pharmaceutical 14987224005413</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung eines systems hepatitis-b-virus reporter den frühen stadien des replikationszyklus zu überwachen

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Derzeit ist es möglich, rekombinante Formen verschiedener Viren zu konstruieren, wie z.B. das humane Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) und das Hepatitis-C-Virus (HCV), die fremde Gene wie einen Reporter oder ein Markerprotein in ihrem Genom tragen. Diese rekombinanten Viren ahmen in der Regel den Lebenszyklus des ursprünglichen Virus in infizierten Zellen originalgetreu nach und weisen die gleiche Abhängigkeit vom Wirtsbereich auf. Die Entwicklung eines rekombinanten Virus ermöglicht ein effizientes Screening von Inhibitoren und die Identifizierung spezifischer Wirtsfaktoren. Bisher war die Konstruktion des rekombinanten Hepatitis-B-Virus (HBV) jedoch aufgrund verschiedener experimenteller Einschränkungen schwierig. Die Haupteinschränkung ist die kompakte Genomgröße von HBV und eine ziemlich strenge Genomgröße, die 1,3 Genomgrößen nicht überschreitet und in Virionen verpackt werden muss. So sollte die Größe eines einzufügenden fremden Gens kleiner als 0,4 kb sein, wenn keine Deletion der Genom-DNA durchgeführt werden soll. Um diese Größenbeschränkung zu überwinden, ist daher die Deletion eines Teils der HBV-DNA erforderlich. In dieser Arbeit berichten wir über die Konstruktion von rekombinantem HBV, das für ein Reportergen kodiert, um das frühe Stadium des HBV-Replikationszyklus zu überwachen, indem ein Teil der HBV-Kern-kodierenden Region durch das Reportergen ersetzt wird, indem ein Teil der HBV-Pol-kodierenden Region gelöscht wird. Der Nachweis einer rekombinanten HBV-Infektion, der durch die Reporteraktivität überwacht wurde, war hochsensitiv und kostengünstiger als der Nachweis mit den derzeit verfügbaren konventionellen Methoden zur Bewertung der HBV-Infektion. Dieses System wird für eine Reihe von Anwendungen nützlich sein, einschließlich des Hochdurchsatz-Screenings zur Identifizierung von Anti-HBV-Inhibitoren, Wirtsfaktoren und virusanfälligen Zellen.

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des HBV - Genoms transkribiert RNAs, Virusproteine und deren codierende Region auf dem Genom. Das Reportergen und seine Position in dem Genom sind ebenfalls angegeben. Abbildung 2 zeigt die HBV - Reporterplasmid und Helferplasmid das Reportergen enthält. Die pUC1.2HBV / NL Reporter wurde durch Deletieren Nukleotidpositionen 223-811 konstruiert von der Transkriptionsinitiationsstelle des precore mRNA von pUC1.2H...

Hier haben wir eine neu entwickelte Hepatitis B-Virus (HBV) Reportersystem beschreiben, die frühen Stadien des HBV-Lebenszyklus zu überwachen. Dieses in vitro System vereinfacht wird in das Screening von anti-HBV - Agenten unterstützen , eine Hochdurchsatz - Strategie.

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Das übergeordnete Ziel dieses rekombinanten HBV-Reportersystems besteht darin, die Durchführung von Hochdurchsatz-Screenings für anti-Hepatitis-B-Virus- (HBV-)Wirkstoffe zu erleichtern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im HBV-Bereich zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von anti-HBV-Wirkstoffen und die Bestimmung von Wirtsfaktoren, die an der HBV-Replikation beteiligt sind. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass das HBV-Reportersystem die frühen Phasen des HBV-Replikationszyklus verfolgen kann.Nach der Zubereitung des Zellkulturmediums am Tag vor der Transfektion viermal 10 hoch 6 HepG2-Zellen in Medium auf eine 10 cm große, mit Kollagen beschichtete Petrischale geben. Die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator inkubieren. Mit einem Transfektionsreagenz gemäß den Herstelleranweisungen die Zellen mit 5 µg pUC1 2HBV delta epsilon und 5 µg pUC1 2HBV/NL transfizieren.Am nächsten Tag das Kulturmedium entfernen und 10 mL frisches Kulturmedium hinzufügen. Dann, eine Woche nach der Transfektion, das Kulturmedium, das das rekombinante HBV enthält, in ein 50 mL-Röhrchen überführen. Danach 10 mL frisches Kulturmedium in d

development-hepatitis-b-virus-reporter-system-to-monitor-early-stages

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Nishitsuji, H., et al. Entwicklung eines Hepatitis-B-Virus-Reportersystems zur Überwachung der frühen Phasen des Replikationszyklus. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Herstellung und Reinigung rekombinanter Hepatitis-B-Viruspartikel, wodurch sichere, replikationsdefiziente Virensuspensionen für die Untersuchung früher Infektionsereignisse sowie für Hochdurchsatz-Screenings zur Identifizierung antiviraler Wirkstoffe ermöglicht werden.

Herstellung und Reinigung rekombinanter Hepatitis-B-Viruspartikel

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Dieses Video demonstriert eine in vitro Technik zum Nachweis einer Hepatitis-B-Virus (HBV)-Infektion über ein rekombinantes HBV-Reportersystem. Bei der Infektion von Wirtszellen exprimiert das rekombinante virale Genom das Luciferase-Reporterenzym, das bei der Oxidation seines Substrats Biolumineszenz erzeugt und so zum Nachweis einer Virusinfektion beiträgt.

Ein in vitro rekombinantes Virusreportersystem zum Nachweis von Virusinfektionen

Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein wichtiger menschlicher Krankheitserreger, der Lebererkrankungen, einschließlich Leberzirrhose und Krebs, verursacht. Ein HCV-infektiöses Zellkultursystem ist essentiell, um den molekularen Mechanismus der HCV-Replikation zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung verschiedener Stadien des HCV-Replikationszyklus.

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das spezifische Schritte des Viruseintritts untersucht, um neuartige antivirale Wirkstoffe zu identifizieren und zu bewerten.

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Wir beschreiben hier die in-vitro- Erzeugung von HBV-DNA über eine Hepatitis B-Virus-Infektion-System und die hochempfindliche Erkennung seiner (1 – 2 Kopien)-Integration mit Inverse nested PCR.

Erkennung von niedrigen Kopie Nummer integrierte virale DNA gebildet durch In-vitro- Hepatitis B-Infektion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schrittweise Anleitung zur 3-d "Leber-on-a-Chip" Infektion mit dem Hepatitis B-Virus Experimente zur Verfügung stellen.

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Hepatitis-B-Virus-Infektion (HBV) in neuartigen 293T-Zellen (293T-NE-3NRs, die menschliche NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und traditionelle Leberzellen (HepG2-NE, exzessizierenden menschlichen NTCP) exdrücken.

Modellierung der Hepatitis-B-Virusinfektion in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs-Zellen

Wir präsentieren ein Protokoll zum Screening von Anti-Hepatitis-B-Virus-Verbindungen (HBV), die auf prä- und postvirale Eintrittsphasen abzielen, wobei die isotherme Titrationskalorimetrie verwendet wird, um die Bindungsaffinität (KD) mit dem Wirtsnatriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid zu messen. Die antivirale Wirksamkeit wurde durch die Unterdrückung viraler Lebenszyklusmarker (cccDNA-Bildung, Transkription und virale Assemblierung) bestimmt.

Ein kompetentes Hepatozytenmodell, das den Eintritt von Hepatitis-B-Viren durch Natriumtaurocholat cotransportierendes Polypeptid als therapeutisches Ziel untersucht

Der auf der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende Nachweis und die Quantifizierung der DNA des Hepatitis-B-Virus (HBV) ist eine empfindliche und genaue Methode zur Diagnose und Überwachung von HBV-Infektionen. Hier stellen wir ein Protokoll für den HBV-DNA-Nachweis und die Viruslastmessung einer Probe vor.

Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-basierter Nachweis und Quantifizierung von Hepatitis-B-Virus-DNA

Erfahren Sie, wie ein HBV-Reporter-System die frühen Stadien des Hepatitis-B-Virus-Replikationszyklus überwacht. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von Anti-HBV-Wirkstoffen in HepG2-Zellen.

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

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