Name: Chirurgische Verfahren und Methodik für ein präklinisches Murine - Modell von De Novo Mamma Krebs Metastase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Erfahren Sie die chirurgische Resektion primärer Mammatumoren in einem murinen Modell zur Untersuchung von de novo-Mammakarzinom-Metastasen. Diese Methode ermöglicht die Evaluation adjuvanter Therapien in einem klinisch relevanten Kontext.

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Die Autoren danken Jo Hill für die histopathologische Hilfe, Dr. John Gleysteen für den Unterricht in der chirurgischen Technik, Tessa Diebel für Videographie-Hilfe, alle Mitglieder der Wong- und Coussens-Labore für kritische Einblicke und Diskussionen und das OHSU Knight Cancer Institute für finanzielle Unterstützung. Die Autoren bestätigen die Unterstützung von T32GM071388-10 und T32CA106195-11 an CEG, das NCI / NIH, das Department of Defense Breast Cancer Research Program, die Susan G Komen Foundation, die Breast Cancer Research Foundation und eine Stand Up To Cancer - Lustgarten Foundation Pankreas-Krebs-Konvergenz-Traumteam Translationsforschungsstipendium (SU2C-AACR-DT14-14) an LMC, ein Frauengesundheitskreis der Stiftungspreis an MHW und das Brenden-Colson-Zentrum für Pankreasgesundheit an MHW und LMC.

Tiere, die in dem folgenden Protokoll verwendet werden, werden vom Oregon Health &amp; Science University&#39;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) abgedeckt, das so konzipiert ist, dass es mit dem Tierschutzgesetz und dem Public Health Service (PHS) -Politik übereinstimmt. Aufrechterhaltung der sterilen Bedingungen: Sterilisierte Instrumente sollten verwendet werden und zwischen Mäusen, sollte mit steriler Gaze abgewischt werden, in PBS gespült, gefolgt von Sterilisation mit Desinfektionsmittel 70% Ethanol für mindestens 15 Minuten. Eine chirurgische Kappe, Gesichtsmaske, Kleid und Handschuhe sollten für Überlebensoperationen getragen werden. Die präoperative Vorbereitung des Tieres für Überlebensoperationen ist in dem folgenden Protokoll enthalten. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von Reagenzien und Geräten. 1. Isolierung und Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus primären Mamma-Tumoren <ol><li> Anästhesieren Sie Spender weibliche 100 Tage alte transgene MMTV-PyMT (FVB / n) Mäuse und pflegen unter cKontinuierliche Sedierung durch Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesiemaske. Vergewissern Sie sich, dass die Maus mit einem abwesenden Fußrastenreflex richtig betäubt wird. </li><li> In einer sterilen Umgebung resezieren primäre Mamma-Tumoren von 100-Tage alten transgenen weiblichen MMTV-PyMT (FVB / n) Mäusen durch Trennen des Brusttumors von der darüber liegenden Haut und dem umgebenden Fettgewebe und / oder Lymphknoten mit steriler Schere. Euthanisieren der anästhesierten Mäuse durch zervikale Versetzung. </li><li> Mit sterilen Scheren oder einem Skalpell, primäre Primärtumoren manuell in kleine Stücke (~ 1,0 mm 3 ). Platzieren Sie Tumorstücke in 3,0 mg / ml Kollagenase A und 4,0 U / ml DNase I, gelöst in DMEM. Verwenden Sie ~ 10 ml des oben genannten Verdauungsmediums pro 1,0 cm Durchmesser Tumor. <ol><li> Führen Sie die Verdauung in einer sterilen 25 ml-Flasche mit einem sterilen Rührstab bei ~ 125 U / min und 37 ° C für 40 min. </li></ol></li><li> Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von fötalem Rinderserum (FBS) zu einer Endverdünnung von 10% und legen Sie die gesamte Mischung auf wEt ice wo es beibehalten wird. </li><li> Filtriere die verdaute Tumorsuspension durch ein 0,7 μm Nylon-Sieb in ein 50 mL konisches Röhrchen und verwirre jeden im Sieb verbleibenden Tumor. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 xg bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet in 10 ml DMEM pro 1,0 cm Tumor resuspendieren und durch ein 0,7 μm Nylon-Sieb filtrieren. Zählzellkonzentration, dann bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren. </li><li> Pellet in 10% Dimethylsulfoxid mit 90% FBS in einer Konzentration von 2 x 10 7 lebenden Zellen / ml resuspendieren. Spezielle Suspensionen des ganzen Primärtumors bei -80 ° C aufbewahren. </li></ol> 2. Orthotopische Injektion von Mamma-Tumor <ol><li> Teilweise aufgetaute gefrorene primäre Tumorsuspensionen bei 37 ° C, bis das gefrorene Pellet aus dem Kryogenrohr in 20 mL DMEM freigesetzt werden kann und die Zellen zählt. Bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren und Zellen in einem 1: 1 DMEM resuspendieren: Wachstumsfaktor-reduzierte solubilisierte Basalmembranpräparation eXtrahiert aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkom bei einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen / ml (siehe Tabelle der Materialien ). </li><li> Legen Sie die anästhesierte Empfänger weibliche syngene Maus ventrale Seite nach oben und pflegen unter kontinuierlichen Sedierung durch die Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesie-Maske. </li><li> Sterilisieren Sie die rechte 4. Brustdrüsen-Injektionsstelle mit aerosolisiertem 70% Ethanol und applizieren Poly (vinylpyrrolidon) -Iod mit einem sterilen Wattestäbchen. </li><li> 100 μl (1 x 10 6 lebende Zellen aus gefrorenen primären Tumorsuspensionen) in die ungekürzte rechte 4. Brustdrüse der 6 bis 10 Wochen alten weiblichen FVB / n-Maus mit einer 29 g 0,3 mL Insulinspritze injizieren. </li></ol> 3. Chirurgische Resektion des Orthotopischen Mamma-Tumors <ol><li> 38-60 Tage nach der Tumorzellinjektion, Euthanisierungsmäuse, die keine orthotopen Tumorvolumina im Bereich von 172 bis 450 mm 3 Volumen aufweisen (Länge x (Breite 2) </Sup&gt;) / 2] (etwa 75% der injizierten Mäuse). </li><li> Legen Sie anästhesierte Mäuse, die die richtige Tumorgröße ventral nach oben unter kontinuierlicher Sedierung durch Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesiemaske und bestätigen Sie, dass die Maus korrekt mit einem abwesenden Fußquetschreflex betäubt wird. Tragen Sie Tierarzneimittel auf die Augen zur Verhinderung der Trockenheit, während unter Sedierung. </li><li> Spray 70% Ethanol zur Sterilisation der chirurgischen Bereich um den primären Tumor, dann wenden Poly (vinylpyrrolidon) -Iod mit einem sterilen Wattestäbchen. HINWEIS: Die Haarentfernung an der chirurgischen Stelle führte zu Hautausschnitten und / oder Infektionen für ~ 5% Mäuse und wurde daher von diesem Schritt ausgeschlossen (Daten nicht gezeigt). </li><li> Wie in Abbildung 1C gezeigt , machen Sie einen anfänglichen Hautschnitt mit stumpfen Scheren medial-kaudal zum Tumor. </li><li> Als nächstes machen Sie eine überlegene Exzision der Haut ( Abbildung 1C ) medial zum Tumor. Achten Sie auf die Notwendigkeit, jede Vaskulatur fe zu kauterisierenDen auf der Haut befindlichen Tumor vor dem Ausbau des Einschnitts. </li><li> Setzen Sie den Hautschnitt seitlich fort (hinter dem Tumor), dann machen Sie eine überlegene Hautexzision (lateral to tumor) und mediale Exzision (überlegen zum Tumor) ( Abbildung 1C ). </li><li> Nachdem die Haut in Umfangsrichtung um den Tumor herausgeschnitten worden ist ( Abbildung 1C ), heben Sie die überliegende Haut an den Tumor mit Pinzette, während stumpfes Sezieren der Tumor weg von der Bauchwand Muskulatur und halten die Brustdrüsen intakt. </li><li> Identifizieren (durch stumpfes Präparieren) und große Gefäße kauterisieren Laufen durch die 4. und 5. Brustdrüsen. </li><li> Verbrauch etwa die Hälfte der 4. und 5. Brustdrüsen am Kauterisation Ort des Tumors zu befreien, darüber liegende Haut und Segmente der Brustdrüsen (1C). </li><li> Im Falle von Blutungen, identifizieren aktiv BlutungenSchiffe und sofort kauterisieren. Wenn mehr als 250 μl Blut verloren gehen, schließen Sie die Maus aus dem Studium und euthanisieren Sie es. </li><li> Schließen Sie Exzisionsstellen mit Wundklammern mit einem Wundklammerapplikator ( Abbildung 1C ). HINWEIS: Entfernen Sie die Wundclips 10 Tage nach der Operation mit einem Wundclip-Entferner. </li><li> Verabreichung von warmer steriler Kochsalzlösung subkutan (4% des Körpergewichts des Tieres) und halten das Tier mit einer Wärmelampe warm. Überprüfe die Tiere alle 5-10 Minuten bei der Erholung von der Anästhesie. HINWEIS: Die Verabreichung von entweder Bupivacain oder Lidocain erhöhte die postoperative Mortalität (Daten nicht gezeigt). Mäuse, die Anzeichen von Schmerzen zeigten (Knicken, unfreiwillig zu bewegen, Bruchlosigkeit) 1 h nach der Operation wurden euthanasiert. <ol><li> Sobald die Maus vollständig erholt ist, bringen Sie sie an die Gesellschaft anderer Mäuse zurück. </li></ol></li></ol> 4. Isolierung und Verarbeitung von Blut und Lunge für Durchflusszytometrie und Histologie &lt;Ol&gt; <li> Bei den Studienendpunkten sollten Mäuse auf verschiedene histopathologische Untersuchungen vorbereitet werden. 90 min vor der Euthanasie geben jeder Maus eine intraperitoneale Injektion von Bromodeoxyuridin (BrdU, 50 μg / g Mausgewicht) bei einer Konzentration von 6,25 μg / μL in 1x PBS. ANMERKUNG: Gefrorene Bestandteile von gelöstem Bromodeoxyuridin werden innerhalb von 1 Monat nach der Herstellung verwendet. </li><li> 10 min vor der Euthanasie, mit der Maus anästhesiert, sammeln Sie retroorbitales Blut (&gt; 500 μl) unter Verwendung von heparinisierten Kapillarröhrchen und übertragen anschließend auf Röhrchen, die mit Dipottium-EDTA auf Eis gehalten wurden. </li><li> Zum Entfernen von Lungen und restlichen Brustgewebe, bilden einen Mittellinienschnitt mit einer Schere aus dem Unterleib zu der Mündung der Brust- und Bauchhöhle (2A) zu exponieren, und schälen sich seitlich um die Haut freizulegen , auch die verbleibenden rechten 4. und 5. Brust Drüsen </li><li> Das verbleibende Brustdrüsengewebe verbrauchen und untersuchenUm das primäre Tumor-Nachwachsen auszuschließen, indem man das mit dem Serum beschichtete Formalin-fixierte Paraffin-eingebettete (FFPE) Gewebe durch Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) -Färbung ( ergänzende Abbildung 1 ) bewertet . </li><li> Um die Lunge zu entfernen, öffne die Bauchwand mit einer Schere zum Zwerchfell, dann test du das Tier, indem du die Bauchaorta abschneide, um Blut vor der Perfusion der Lungen abzulassen ( Abb. 2B -2C ). </li><li> Schneiden Sie das Zwerchfell entlang der Brustkorb aus einer Bauch-Ansatz, um sicherzustellen, dass die Lunge und Herz zu vermeiden. Dann den Thorax durch Schneiden durch die seitlichen Seiten des Brustkorbes aussetzen ( Abbildung 2D ). </li><li> Unter Verwendung einer 23-Gauge-Nadel auf einer 20-ml-Spritze, perfuse Lungen mit ~ 5,0 mL DPBS (~ 10 ml / min) durch den rechten Ventrikel des Herzens, bis die Lungen ganz weiß sind ( Abbildung 2E -2F ). Sofort schneiden Sie das Herz von der Hauptvesse abIst das Blut nicht wieder in die Lunge. </li><li> Damit das Lungengewebe für histopathologische Untersuchungen fixiert und verarbeitet werden kann, injizieren Sie ~ 1,0 ml 10% Formalin bei 4 ° C in die exponierte Trachea-Abschrägungsseite in Richtung der Lunge mit einer 23-Gauge-Nadel ( Abbildung 2G- 2H ). Setzen Sie die Einspritzung ein, sobald die Lungen vollständig ausgedehnt und mit Fixiermittel gefüllt sind ( Abbildung 2I ). </li><li> Lungen-Lungen-Lappen aus der Trachea und Emersions-Lungengewebe in neutral-gepuffertem Formalin für die anschließende Paraffin-Einbettung oder OCT-Gefriermedium pro Standard-histopathologischen Verfahren. </li><li> Quantifizierung der metastatischen Belastung in den Lungen durch serielle Abschnitte von FFPE-Lungengewebe und Auswertung von Mikrotomabschnitten (100 μm, dreizehn Abschnitte) durch H &amp; E-Färbung ( Abbildung 1B ). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegung von Konflikten mit den hier dargestellten Daten.

Änderungen und Fehlersuche: Wenn der stumpfe Sezierungs-Tumor von der Bauchwand entfernt ist, kann der Tumor an der Bauchwand haften bleiben. Dies wurde bei &lt;5% der mit Tumoren injizierten Mäuse beobachtet (Daten nicht gezeigt). Für Mäuse mit an der Bauchwand anhaftenden Tumoren sollte die Maus euthanasiert werden, da die Resektion ohne primärem Tumorwachstum schwierig ist. Einschränkungen von Modell / Technik: <p class="j...

Frauen in Nordamerika haben ein ~ 12% lebenslanges Risiko der Entwicklung von Brustkrebs 2 ; Eine Mehrheit dieser Personen wird primäre Tumore über die Operation entfernt haben, und je nach Krebs Subtyp, wird dann erhalten gezielte, endokrine, Chemo- und / oder Strahlentherapie in der adjuvanten Einstellung 3 . Beispiele umfassen, mit Hormonrezeptor-positiven Tumoren diagnostizierten Frauen HER2-zielgerichteten Therapien mit Bestrahlung / Chemotherapie, während keine zielgerichteten Therapien noch verfügbar sind für triple negative Tumoren 3 Empfangen anti-Östrogen - Therapien und Frauen mit HER2-positiven Tumoren erhalten. Trotz Fortschritten in der Strahlung, Chemotherapie, personalisierte und Hormon-basierte Therapien, die chirurgische Resektion ergänzen, wiederholt sich die Krankheit bei 30-70% der Frauen, die mit der Stufe II oder III-Krankheit 4 diagnostiziert wurden, da Therapien bei der Beseitigung der metastatischen Erkrankung in entfernten Organen weitgehend unwirksam sind Lunge, Knochen, bRegen und / oder Leber 5 . Dies ist besonders bedeutsam, da bei der Metastasierung in Abwesenheit eines primären Tumorwachstums dies impliziert, dass disseminierte maligne Zellen wahrscheinlich bereits in sekundären Organen zum Zeitpunkt der endgültigen Operation vorhanden waren. So sind dringend Therapien erforderlich, um das Wachstum von metastatischen Tumoren zu beseitigen oder zu verlangsamen. Während de novo Mausmodelle der Brustkarzinogenese bemerkenswert informativ bei der Aufdeckung von Mechanismen zur Regulierung der neoplastischen Progression 1 sind , haben bestehende Modelle auch mehrere Einschränkungen. Eines davon ist die Tatsache, dass de novo transgene Modelle typischerweise Primärtumore in multiplen Brustdrüsen entwickeln, wobei die primäre Tumorbelastung die Dauer der Studien begrenzt. Während primäre Tumorzell-Flucht und metastatische Seeding wahrscheinlich früh in der neoplastischen Progression in diesen Modellen auftreten, entsteht eine offene Entwicklung von metastatischen Tumoren spät, und je nach oN der Maus Modell und Belastung Hintergrund, ist oft teilweise durchdringend 1 . Dies begrenzt den Nutzen der de novo- Modelle zur Entdeckung von Molekülen, die die Metastasierung in sekundären Organen regulieren, und zur Bewertung der präklinischen Wirksamkeit von Therapeutika in der adjuvanten Umgebung. Um diese Einschränkungen zu umgehen, entwickelten wir ein de novo autochthones Modell der Mamma-Karzinom-Metastase in die Lunge. Parentale transgene Weibchen ( dh MMTV-PyMT auf dem FVB / n-Stammhintergrund für hierin beschriebene Studien), die Spätstadium de novo Mamma-Tumoren tragen, sind bis zu 100 Tage 6 gealtert, wobei zu diesem Zeitpunkt ihre primären Tumoren chirurgisch reseziert und enzymatisch dissoziiert werden Einzelzelle Suspensionen. Suspensionen (1 x 10 6 Zellen) werden wiederum orthotopisch in 6-7-wöchige Empfänger-syngene weibliche Mäuse explantiert, wo sich einzelne primäre Mamma-Tumoren über einen Zeitraum von 38 bis 60 Tagen entwickeln ( 3 ) werden Empfängermäuse anästhesiert und Primärtumoren werden chirurgisch reseziert, so dass das Tumorwachstum an der chirurgischen Stelle minimiert wird, im Einklang mit der Operation bei Frauen ( Ergänzende Abbildung 1 ). Auf dem FVB / n-Stamm-Hintergrund entwickeln Mäuse histologisch nachweisbare metastatische Herde in der Lunge mit 45% Penetrance um ~ 115 Tage nach der Operation ( Abbildung 1B ). Mit dieser verlängerten Latenz des metastatischen Tumorwachstums ist das Modell eindeutig für die adjuvante Therapieabgabe positioniert und zur Aufklärung und Bewertung der zugrunde liegenden Biologie, die die metastatische Progression nach chirurgischer Entfernung von Primärtumoren beeinflusst.

<table><tbody><tr><td>Isofluoran</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N/A</td><td>Verschreibungspflichtige Bestellung</td></tr><tr><td>Kollagenase A</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher 12634010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pyrex Flasche</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS139525</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Bio&nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0,7 & Mikro; m Nylon-Sieb&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>konisches 50-ml-Röhrchen&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel</td><td>BD</td><td>354230</td><td>Wachstumsfaktor-reduziertes solubilisiertes Basalmembranpräparat, extrahiert aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maussarkom</td></tr><tr><td>Poly(vinylpyrrolidon)&ndash; Jodkomplex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>29 gauge 0,3 mL Insulinspritze</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>Small Vessel Cauterizer Kit</td><td>FST</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wundclips</td><td>Texas Scientific</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Wundclip applier&nbsp;</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Wickelclip-Entferner&nbsp;</td><td>BD</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridin</td><td>Roche</td><td>10280879</td><td></td></tr><tr><td>Heparinisierte Kapillarröhrchen&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer-Röhrchen mit Dikalium-EDTA</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Spritze&nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>OCT-Gefriermedium</td><td>VWR</td><td>25608930</td><td></td></tr><tr><td>Formalin, gepuffert, 10% (Phosphatpuffer)</td><td>Fisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>23g Nadel</td><td>Fisher</td><td>14-826-6B</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n Maus</td><td>Jackson Laboratories</td><td>001800</td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgische verfahren und methodik für ein präklinisches murine - modell von de novo mamma krebs metastase

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Ein geschwindigkeitsbestimmender Aspekt von transgenen Mausmodellen des Mamma-Adenokarzinoms ist, dass die primäre Tumorlast im Brustgewebe typischerweise Studienendpunkte definiert. Studien, die sich auf die Aufklärung der Mechanismen der De-novo-Metastasierung im Spätstadium konzentrieren, sind daher kompromittiert, ebenso wie Studien, die die Wirksamkeit von Krebstherapien untersuchen, die auf Mediatoren der Metastasierung im adjuvanten Setting abzielen. Zahlreiche murine Mammakarzinommodelle wurden durch gezielte Expression dominanter Onkoproteine in Brustepithelzellen entwickelt, was zu Modellen führt, die variabel histopathologische und transkriptomdefinierte Brustkrebs-Subtypen nachahmen, die bei Frauen üblich sind1. Obwohl mit diesen Modellen viel über die Biologie der Mammakarzinogenese gelernt wurde, ist ihr Nutzen bei der Identifizierung von Molekülen, die das Wachstum von Metastasen im Spätstadium regulieren, beeinträchtigt, da Mäuse aufgrund einer signifikanten Primärtumorlast in der Regel zu früheren Zeitpunkten eingeschläfert werden. Da ein erheblicher Prozentsatz der Frauen, bei denen Brustkrebs diagnostiziert wurde, nach der chirurgischen Resektion von Primärtumoren und vor dem Vorliegen einer nachweisbaren metastasierenden Erkrankung eine adjuvante Therapie erhält, werden präklinische Modelle der De-novo-Metastasierung dringend als Plattformen zur Evaluierung neuer Therapien benötigt, die auf metastasierende Herde abzielen. Um diese Defizite zu beheben, haben wir ein Mausmodell der De-novo-Metastasierung von Mammakarzinomen entwickelt, bei dem primäre Mammatumoren chirurgisch reseziert werden und sich anschließend über einen Zeitraum von 115 Tagen nach der Operation Metastasierungsherde entwickeln. Diese lange Latenzzeit bietet ein handhabbares Modell zur Identifizierung funktionell signifikanter Regulatoren der Metastasierung bei Mäusen ohne Primärtumor sowie ein Modell zur Bewertung der präklinischen therapeutischen Wirksamkeit von Wirkstoffen, die darauf abzielen, funktionell signifikante Moleküle zu blockieren, die das Überleben und Wachstum von metastasierten Tumoren unterstützen.

Größer als 75% der Empfängermäuse, die 1 x 10 6 Zellen aus primären Mamma-Tumoren erhalten, die von MMTV-PyMT-Mäusen abgeleitet sind, entwickeln einzelne Mamma-Adenokarzinome im Bereich von 172 bis 450 mm 3 innerhalb von 38-60 Tagen (Daten nicht gezeigt). Mäuse, die für eine Randomisierung in Frage kommen, werden dann nach der chirurgischen Resektion von Primärtumoren in die Studiengruppen eingeschrieben ( Abbildung 1C ). Primärer Tumor...

Präklinische Modelle, die eine adjuvante Therapie mit Brustkrebs-Metastase auswerten, fehlen. Um dies zu lösen, entwickelten wir ein murines Modell der de novo pulmonalen Mamma-Adenokarzinom-Metastase, wobei Therapien, die in der adjuvanten Einstellung (postchirurgische Resektion von Primärtumoren) verabreicht werden, auf die Wirksamkeit bei der Auswirkung von zuvor gesäten pulmonalen Metastasen untersucht werden können.

Chirurgische Verfahren und Methodik für ein präklinisches Murine - Modell von De Novo Mamma Krebs Metastase

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Wir haben ein neues Mausmodell der De-novo-Metastasierung von Mammakarzinomen entwickelt, das den Verlauf von Brustkrebs beim Menschen genau nachahmt und eine präklinische Plattform für die Bewertung der Biologie, des zugrunde liegenden metastasierenden Fortschreitens der Erkrankung und der Wirksamkeit von Therapien bietet, die im adjuvanten Setting verabreicht werden. Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Oregon Health and Science University genehmigt. Unser Mausmodell wird durch die Gewinnung enzymatisch dissoziierter Primärtumoren von transgenen, 100 Tage alten Maus-Mammatumor-, Polyoma-, Mittel-T- oder MMTV-PyMT-Mäusen etabliert.Einmal werden 10 bis sechs Tumorzellen orthotopisch in syngene Empfängermäuse injiziert, und es entwickeln sich über einen Zeitraum von 38 bis 60 Tagen Primärtumoren. Mäuse mit Tumoren von 170 bis 450 Kubikmillimetern werden für die chirurgische Resektion des Primärtumors rekrutiert. Die Analyse 115 Tage nach der Operation ergab Mäuse mit histologisch nachweisbaren Metastasierungsherden in der Lunge mit einer Penetranz von 45 %.Dieses Video zeigt die chirurgische Resektion des primären Mammatumors, einer entscheidenden Komponente des präklinischen Mausmodells. Mäusen wird 2%iges Isofluran verabreicht und die Operation kann beginnen, sobald der Quetschreflex des Fußes fehlt. Besprühen Sie die Haut über dem Primärtumor mit 70%Ethanol.Betadin wird dann mit einem sterilen Wattestäbchen auf den Operationsbereich aufgetragen, beginnend auf der Haut über dem Tumor, gefolgt von der Umgebung des Primärtumors. Mit einer stumpfen Schere wird ein erster Schnitt in die Haut medial kaudal des Primärtumors gesetzt. Die Inzision wird in einer oberen Richtung medial zum Primärtumor verlängert.Identifizieren und kauterisieren Sie potenzielle Gefäße, die den Tumor von der darüber liegenden Haut versorgen. Wenn Blutungen auftreten, sollte eine weitere Kauterisation durchgeführt werden. Wenn Sie einen seitlichen Hautschnitt vornehmen, der dem Primärtumor unterlegen ist, achten Sie darauf, dass Sie die darunter liegende Brustdrüse nicht durchtrennen, da möglicherweise Gefäße vorhanden sind.Der Hautschnitt wird dann umlaufend um den Primärtumor verlängert. Dünne Verwachsungen in der Brustdrüse medial des Tumors werden dann vorsichtig präpariert, um den Tumor von der Bauchdecke zu trennen. In diesen Adhäsionen können Blutgefäße vorhanden sein.Verätzen Sie alle Gefäße, die in den Adhäsionen identifiziert wurden, vor dem Schneiden. Pfeile zeigen die vierte und fünfte rechte Brustdrüsen, die über und unter dem Tumor dargestellt sind. Die fünfte Brustdrüse wird dann kauterisiert und herausgeschnitten, da sie kleine Gefäße enthalten kann, die schwer zu visualisieren sind.Nachdem der Tumor von der Bauchdecke getrennt wurde, können größere Gefäße identifiziert werden. Das Gefäß, das durch die vierte Brustdrüse verläuft, ist durch den oberen Pfeil dargestellt. Die darunter liegende Oberschenkelarterie ist durch den mittleren Pfeil dargestellt.Und das große Gefäß, das den Tumor zwischen der vierten und fünften Brustdrüse versorgt, ist durch den unteren Pfeil gekennzeichnet. Anschließend wird eine Kauterisation entlang des großen Gefäßes durchgeführt, das zwischen der vierten und fünften Brustdrüse verläuft, wobei darauf geachtet wird, dass eine Verätzung der darunter liegenden Oberschenkelarterie am Bein vermieden wird. Nachdem die Kauterisation des großen Gefäßes abgeschlossen ist, wird das Gefäß bis zur vierten Brustdrüse durchtrennt.Lokalisieren und kauterisieren Sie das zweite große Gefäß, das durch die vierte Brustdrüse verläuft. Schneiden Sie durch das Gefäß, ohne die gesamte Brustdrüse zu durchtrennen, so dass das Gefäß im Falle einer Blutung leicht identifiziert und weiter kauterisiert werden kann. Anschließend wird der Rest der vierten Brustdrüse exzidiert.Anschließend wird die darüber liegende Haut mit einem AutoClip-Wundclip-Applierer mit gewickelten Clips verschlossen. Stellen Sie sicher, dass die darüber liegende Haut ausreichend von der Bauchdecke getrennt ist, um ein Einklemmen des darunter liegenden Muskels zu vermeiden. Bringen Sie den lateralen und medialen Rand der Wunde zusammen und heben Sie die Haut in anteriorer Richtung an, um den Wundclip anzubringen.Achten Sie darauf, dass der Urogenitaltrakt oder der darunter liegende Muskel des rechten Beins nicht abgeschnitten wird. Die Mobilisierung des rechten Beins durch Entfernen des Tapes kann das Anlegen von Wundclips erleichtern. Die Wundklammern sollten 10 Tage nach der Operation entfernt werden.Die chirurgische Resektion des Primärtumors, die in diesem Video gezeigt wird, ermöglicht die Entwicklung von disseminierten Krebszellen in den Metastasierungsherden in der Lunge 115 Tage nach der Operation, wobei ein Vertreter von jedem im Bild eines Metastasierungsherdes gezeigt wird. Angesichts der Tatsache, dass ein großer Prozentsatz der Frauen, bei denen Brustkrebs diagnostiziert wurde, einer chirurgischen Entfernung des Tumors unterzogen wird und nach der Operation einer metastasierenden Erkrankung erliegen kann, haben wir ein präklinisches Mausmodell etabliert, das den Verlauf der Erkrankung und Behandlung der Patientinnen nachahmt. Durch die Aufzeichnung der Methodik zur chirurgischen Entfernung des primären Mammatumors kann diese Schlüsselkomponente unseres Mausmodells der De-novo-Metastasierung von Mammakarzinomen leicht reproduziert werden, um die Biologie der metastasierenden Erkrankung nach der Tumorresektion und die Wirksamkeit der adjuvanten Therapie zu beurteilen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Ein Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell mit Ultraschall bildgesteuerten Injektion von intra MDA-MB231/Br-GFP Zellen etabliert. Entwicklung von Hirnmetastasen multifokale längs mit hochauflösenden 9,4 T MRT überwacht.

Ultraschall-Imaging-guided Intra Injection zur Entwicklung eines Mausmodells von Brustkrebs Hirnmetastasen durch Längs MRI Gefolgt

Die Aktivierung von latenten Mutationen mit Adenovirus-Cre im duktalen System der Brust führt zu einem klinisch relevanten metastasierten Brustkrebs. Der Einbau eines YFP-Promotors ermöglicht die Verfolgung von distalen metastasierten Tumorzellen. Dieses Modell ist nützlich, um latente Metastasen und Anti-Tumor-Immunität zu untersuchen und neuartige Immuntherapien zur Behandlung von Brustkrebs zu entwickeln.

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Eine präklinische, Mausmodell der Lebermetastasen über eine hemispleen Injektionstechnik durchgeführt.

Einer präklinischen Mausmodell der Lebermetastasen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entstehung von Brusttumoren zu untersuchen. Mit dieser Technik werden Brusttumoren der Maus entfernt und Primärzellen aus Tumoren präpariert. Ein Lungenextraktionsprotokoll zur Untersuchung von Lungenmetastasen ist enthalten. Darüber hinaus ist ein weiteres Protokoll zur Analyse embryonaler Fibroblasten der Maus aus dem Mausembryo enthalten.

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

Um den mehrstufiger Prozess der Peritonealdialyse Verbreitung von Ovarialkarzinomen klären, die aktuelle Studie stellt eine murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumorentstehung und Metastasierung Peritonealdialyse über orthotoper Impfung mit diesen Tumorzellen.

Murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumor-Entwicklung und Peritoneal Metastasierung<em&gt; über</em&gt; Orthotopische Inokulation mit Ovarialkarzinomzellen

Wir führen einen murinen orthotopen Brust Krebs Modell und radikale Mastektomie Modell mit Biolumineszenz-Technologie, die Tumorlast um menschliche Muttermilch Tumorprogression imitieren zu quantifizieren.

Generieren eines murinen orthotopen metastasierendem Brustkrebs Krebs Modells und Durchführung von murinen radikale Mastektomie

In diesem Protokoll beschreiben wir ein Mausmodell der unvollständigen chirurgischen Resektion von Weichteilsarkom zum Testen (neo)adjuvante Therapien.

Ein Mausmodell von unvollständig resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvante Therapien

Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Die modellierung der intrakraniellen Hirnmetastasen wird durch die Unfähigkeit erschwert, die Tumorgröße und die Reaktion auf die Behandlung mit präzisen und zeitnahen Methoden zu überwachen. Die vorgestellte Methodik koppelt die intrakranielle Tumorinjektion mit einer Magnetresonanztomographie-Analyse, die in Kombination präzise und konsistente Injektionen, eine verbesserte Tierüberwachung und genaue Tumorvolumenmessungen kultiviert.

Modellierung von Hirnmetastasen durch intrakranielle Injektion und Magnetresonanztomographie

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Erfahren Sie die chirurgische Resektion primärer Mammatumoren in einem murinen Modell zur Untersuchung von de novo-Mammakarzinom-Metastasen. Diese Methode ermöglicht die Evaluation adjuvanter Therapien in einem klinisch relevanten Kontext.

Chirurgische Verfahren und Methodik für ein präklinisches Murine - Modell von De Novo Mamma Krebs Metastase

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