Quantitative 3D In Silico Modellierung (q3DISM) zerebraler Amyloid-beta Phagozytose in Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit

Das übergeordnete Ziel dieser quantitativen 3-D-In-silico-Modellierung oder q3DISM-Technik ist es, die Aufnahme von Amyloid-beta durch mononukleäre Phagozyten in den Gehirnen von Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit zu quantifizieren. Diese Methode adressiert einen dringenden Bedarf in der Alzheimer-Forschung, die Clearance von Amyloid-beta zu quantifizieren, das sich im Gehirn von Alzheimer-Patienten ablagert und senile Plaques bildet. Zum ersten Mal ermöglicht diese Technik eine echte 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung von Amyloid-beta durch Makrophagen in vivo. Wir begannen, cued 3-Dism zur Untersuchung der Amyloid-beta-Ablagerung zu verwenden, da wir ein robustes Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung der Mikrophagen-Phagozytose in vivo benötigten.

Diese Technik könnte sich bei der Erprobung experimenteller Alzheimer-Therapeutika als nützlich erweisen, um zu beurteilen, welche Medikamente Makrophagen für die effiziente Beseitigung von Amyloid-beta stimulieren. Wenn die Gewebeproben für die Immunfärbung bereit sind, füllen Sie die von den Stiften umgebene hydrophobe Barriere-Geweberegion mit Blockierungspuffer für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Am Ende der Inkubation wird der Blockierungspuffer über Nacht bei 4 Grad Celsius in der befeuchteten Kammer durch den ersten primären Antikörper von Interesse ersetzt.

Waschen Sie die Proben am nächsten Morgen in drei fünfminütigen PBS-Bädern bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Nach dem dritten Waschen inkubieren Sie die Objektträger mit dem entsprechenden fluoreszierenden Sekundärantikörper bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Nach einer Stunde die Abschnitte noch dreimal in PBS lichtgeschützt waschen.

Markieren Sie dann die Zellen in den nächsten zwei bis vier Tagen mit den anderen gewebegeeigneten Primär- und Sekundärantikörpern, die von Interesse sind, wie gerade gezeigt. Um zelluläre und superzelluläre Kompartimente und Amyloid-Beta-Ablagerungen effizient zu färben, ist es entscheidend, jeweils nur mit einem primären Antikörper zu markieren, gefolgt von dem entsprechenden sekundären Antikörper. Ein zeitaufwändiger, aber ergebnisoptimierender Prozess.

Lassen Sie die Schnitte nach dem letzten Waschen der Sekundärantikörperfärbung über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln vollständig trocknen. Decken Sie dann die getrockneten Proben mit einem Deckglas ab, das mit einem fluoreszierenden Eindeckmedium versiegelt ist, das DAPI enthält. Um die Proben durch konfokale Mikroskopie abzubilden, wählen Sie das 60-fach-Mikroskopobjektiv und fügen Sie der Linse Immersionsöl hinzu.

Legen Sie die Probe auf den Objektträgerhalter des Mikroskoptisches und heben Sie das Objektiv an, bis das Öl mit dem Objektträger in Kontakt kommt. Passen Sie mit epifluoreszierender Beleuchtung die Brennebene an, um die Amyloid-Plaques im Hippocampus oder in der Großhirnrinde zu lokalisieren. Nehmen Sie dann konfokale Bilder der aktivierten mononukleären Phagozyten auf, die die Amyloidablagerungen im Hippocampus oder im Kortex umgeben.

Für die qualitative 3D-In-silico-Modellierung analysieren Sie zunächst die konfokalen Datensätze mit wissenschaftlicher 3D-Bildverarbeitung in einem Analysesoftware-Kolokalisierungsmodul für die räumliche Nähe der aktivierten Makrophagenmarkerfärbung in allen Z-Ebenen gleichzeitig. Erstellen Sie Kolokalisationskanäle, die der Phagolysosomenfärbung innerhalb der aktivierten mononukleären Phagozyten entsprechen. Wählen Sie TRITC für Kanal A und FITC für Kanal B.In Fenster "Modus Check" aus, und wählen Sie "Threshold" aus.

Wählen Sie für die Kolokalisierungsintensitäten Quellkanäle aus. Klicken Sie auf Bearbeiten, um die Kolokalisierungsfarbe auszuwählen. Passen Sie dann die Schwellenwerte jedes Kanals unabhängig voneinander an, um die spezifische Färbung einzubeziehen und den Hintergrund und unspezifische Signale auszuschließen.

Die kolokalisierten Voxel werden in allen Z-Stapeln gleichzeitig in der ausgewählten Kolokalisierungsfarbe angezeigt. Klicken Sie anschließend auf Colokalisierungskanal erstellen. Der erstellte Kolokalisierungskanal wird im Fenster Anzeigeanpassung angezeigt.

Klicken Sie auf den Colokalisierungskanal, um die Kanalstatistik zu öffnen. Der Prozentsatz des kolokalisierten Volumenmaterials A über dem Schwellenwert stellt das Monozytenvolumen dar, das von den Phagolysosomen eingenommen wird. Analysieren Sie mit dem Colocalization Module den Kolokalisationskanal auf räumliche Nähe zu den Amyloid-Beta-Signalen, um das in den Phagolysosomen eingekapselte Amyloid-Beta zu quantifizieren.

Wählen Sie den Kolokalisierungsdatensatz Kanal A und Cy5 für Kanal B aus, und erstellen Sie einen Kolokalisierungskanal, wie gerade gezeigt. Klicken Sie auf den Colokalisierungskanal, um die Kanalstatistik wieder zu öffnen. Der Prozentsatz des kolokalisierten Volumenmaterials A über dem Schwellenwert stellt das phagolysosomale Volumen dar, das vom Amyloid-beta eingenommen wird.

Rekonstruieren Sie mit dem Surpass-Modul die konfokalen Bildstapel und generieren Sie 3D-Modelle des verkapselten Amyloid-Beta in den Monozyten-Phagolysosomen. Wählen Sie im Fenster "Anzeigeanpassung" die Option TRITC aus, um nur die Makrophagen-Färbung anzuzeigen, und klicken Sie in den Volumeneigenschaften auf "Neue Oberfläche hinzufügen". Wählen Sie unter Einstellungen in Schritt eins von fünf, Algorithmus, die Option Oberfläche aus.

Wählen Sie unter Farbe den gewünschten Farbtyp aus und passen Sie die Transparenz entsprechend an. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Region von Interesse auswählen und klicken Sie auf Weiter. Passen Sie in Schritt zwei von fünf (Interessenbereich) die X-, Y- und Z-Koordinaten an, um ein Fenster um die gewünschte Zelle zu zeichnen, und klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie in Schritt drei von fünf (Quellkanal) den TRITC-Quellkanal aus und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Glätten. Stellen Sie den Detaillierungsgrad der Oberfläche auf 0,4 Mikrometer ein und klicken Sie auf Weiter. Passen Sie in Schritt vier von fünf, Schwellenwert, den Schwellenwert so an, dass die erzeugte Lautstärke perfekt mit dem TRITC-Kanalsignal überlappt, und klicken Sie auf Weiter.

Klassifizieren Sie schließlich in Schritt fünf von fünf Oberflächen, und wählen Sie im Abschnitt Filtertypen die Objekte aus, die je nach Größe in die zu erstellenden Volumina ein- oder ausgeschlossen werden sollen. Wiederholen Sie die gleichen Schritte, um 3D-Oberflächen für Phagolysosomen mit dem FITC-Kanal und Amyloid-Beta mit dem Cy5-Kanal zu erstellen. Nach qualitativer 3-D-in-silico-Modellierung, wie gerade gezeigt, kann die Amyloid-beta-Aufnahme in die Monozyten-Phagolysosomen im Gehirn von transgenen Mäusen und Ratten analysiert werden.

Interessanterweise ist das von CD68-positiven Phagolysosomen eingenommene Volumen in Iba1-positiven mononukleären Phagozyten, die sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten mit Plaques assoziiert sind, signifikant erhöht, was zeigt, dass die mononukleären Phagozyten in der Nähe von Plaques für Phagozytose bereit sind, verglichen mit den Zellen, die sich abseits der Plaques befinden. Es ist auch bemerkenswert, dass Plaque-assoziierte mononukleäre Phagozyten bei transgenen Mäusen im Vergleich zu Zellen, die von Plaques entfernt sind, eine erhöhte Amyloid-Beta-Aufnahme aufweisen, während bei transgenen Ratten insgesamt eine sehr bescheidene Aufnahme von Amyloid-Beta-Fibrillen beobachtet wird, wobei keine offensichtliche Veränderung der Amyloid-Beta-Fibrillen-Phagozytose in Abhängigkeit vom Abstand zu den Plaques zu beobachten ist. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Qualität der konfokalen Bilder entscheidend ist und dass bei der Kolokalisationsanalyse für alle Kanäle ähnliche Schwellenwerte angewendet werden sollten.

Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neuroinflammation geebnet, um phagozytische Ereignisse im Gehirn von Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gehirnschnitte von Nagetieren für mononukleäre Phagozyten, Phagolysosomen und Amyloid-Beta markiert. Zur Quantifizierung der Phagozytose von zerebralem Amyloid-beta in 3-D in vivo.