Stabile Zelllinien zur Untersuchung von Proteinfunktionen, Spatiotemporal Lokalisierung und Protein Interaction Networks induzierbare LAP-getaggt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine induzierbare Lokalisierungs- und Affinitätsreinigung oder LAP-markierte stabile Zelllinien zu generieren, um die Proteinfunktion, die raumzeitliche Lokalisation und die Proteininteraktionsnetzwerke zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Molekular- und Zellbiologie zu beantworten, die sich auf die Proteinfunktion, die Lokalisierung des Proteinzellzyklus unter Null und die Proteininteraktionen beziehen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie für die Hochdurchsatzanalyse von Proteingruppen geeignet ist und zur Zerlegung der Proteinkomponenten biologischer Signalwege verwendet werden kann.

Um dieses Verfahren zu starten, klonen Sie den offenen Leserahmen des interessierenden Gens in den LAP-getaggten Vektor und transfizieren Sie ihn in HEK293-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Ersetzen Sie einen Tag nach der Transfektion das Minus-Medium Tet DMEM/F12 durch ein frisches Medium. Zwei Tage nach der Transfektion teilen Sie die Zellen auf 25% Konfluenz.

Lassen Sie die Zellen etwa fünf Stunden lang, um sich anzuheften. Fügen Sie dann hygromycinhaltiges Minus-Tet-DMEM/F12-Medium in der vorgegebenen Konzentration hinzu. Verwenden Sie für HEK293-Zellen 100 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin.

Tauschen Sie das Medium nach Bedarf aus, bis deutliche Zellherde erscheinen, die undurchsichtigen Flecken auf der transparenten Platte ähneln. Geben Sie 20 Mikroliter Trypsin auf jeden Zellherd und spritzen Sie es mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze zweimal auf und ab. Übertragen Sie die Zellen in eine 24-Well-Platte und expandieren Sie die Zellen durch kontinuierliches Wachstum in hygromycinhaltigen Minus-Tet-DMEM/F12-Medien.

Erweitern Sie die validierte LAP-markierte Zelllinie für die Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) Isolierung von Proteinkomplexen. Dazu werden alle HEK293-Zellen kontinuierlich in größere Platten und/oder Rollerflaschen umgefüllt und das ohne Tet DMEM/F12-Medien bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Bei Tet/Dox-induzierbaren Zelllinien induzieren Sie die Zellen für 10 bis 15 Stunden, indem Sie eine Konzentration von 0,2 Mikrogramm pro Milliliter Tet/Dox hinzufügen, wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 70 % erreichen.

Ernten Sie die Zellen durch Rühren oder Trypsinisieren. Pelletieren Sie sie dann fünf bis 10 Minuten lang bei 875 mal g. Um den Anti-GFP-Antikörper an Protein-A-Kügelchen zu koppeln, äquilibrieren Sie 160 Mikroliter gepackte Protein-A-Kügelchen mit PBST in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 1 Milliliter PBST. Nach jedem Waschschritt während dieses Vorgangs werden die Kügelchen 10 Sekunden lang bei 5000 g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Nachdem Sie die Kügelchen in 500 Mikrolitern PBST resuspendiert haben, geben Sie 80 Mikrogramm affinitätsgereinigten, schnellen Anti-GFP-Antikörper in jedes Röhrchen, das 160 Mikroliter Kügelchen enthält.

Eine Stunde lang bei Raumtemperatur mixen. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit einem Milliliter PBST, dann waschen Sie die Kügelchen zweimal mit einem Milliliter 0,2 molaren Natriumborat, pH Nach der letzten Wäsche fügen Sie 900 Mikroliter Natriumboratpuffer hinzu, um das endgültige Volumen auf einen Milliliter zu bringen. Geben Sie dann 100 Mikroliter 220 molare DMP in die Bead-Suspension, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar zu erreichen.

Drehen Sie die Röhrchen 30 Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Kügelchen nach der Inkubation mit DMP einmal mit einem Milliliter 0,2 molar Ethanolamin, 0,2 molar Natriumchlorid pH 8,5, um den Restvernetzer zu inaktivieren. Suspendieren Sie dann die Kügelchen wieder in einem Milliliter desselben Puffers und drehen Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Nachdem Sie die Kügelchen pelletiert haben, suspendieren Sie sie in weiteren 500 Mikrolitern des Puffers. Die aufbereiteten Kügelchen sind bei vier Grad Celsius mehrere Monate haltbar. Um die Zelllysate vorzubereiten, resuspendieren Sie 500 Mikroliter des gepackten Zellvolumens in 2,5 Milliliter LAP 300 mit 0,5 Millimolaren DTT und Proteaseinhibitoren.

90 Mikroliter 10%iges Nonylphenoxypolyethoxylethanol zugeben und durch Inversion mischen. Die Mischung 10 Minuten auf Eis legen. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 21.000 mal g.

Nach der Zentrifugation wird dieser Überstand mit niedriger Geschwindigkeit entnommen und eine 10-Mikroliter-Probe für die Gelanalyse beiseite gelegt. Nach dem Transfer des Überstands mit niedriger Geschwindigkeit in eine TLA 100.3-Röhre wird eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit 100.000 g gedreht. Sammeln Sie diesen Hochgeschwindigkeitsüberstand in einem Röhrchen und legen Sie ihn auf Eis, wobei Sie eine 10-Mikroliter-Probe für die Gelanalyse aufbewahren.

Für die erste Affinitätserfassung durch Bindung an Anti-GFP-Kügelchen eluieren Sie die antikörpergekoppelten Kügelchen vor, indem Sie sie dreimal mit einem Milliliter Elutionspuffer waschen, um die entkoppelten Antikörper zu entfernen und den Hintergrund zu reduzieren. Führen Sie dies schnell durch. Lassen Sie die Kügelchen nicht zu lange in hohem Salzgehalt.

Waschen Sie die Kügelchen dann dreimal mit einem Milliliter LAP 200 N.Mischen Sie anschließend den Hochgeschwindigkeits-Überstandsextrakt eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit Antikörperkügelchen. Nachdem Sie den Extrakt 10 Minuten lang bei 21.000 g zentrifugiert haben, reservieren Sie eine 10-Mikroliter-Probe des Überstands für die Gelanalyse. Die Kügelchen werden dreimal schnell mit einem Milliliter LAP 200 N gewaschen, der 0,5 millimolare DTT- und Proteaseinhibitoren enthält.

Verwenden Sie denselben Puffer, um die Kügelchen zwei weitere Male zu waschen, mit einer Inkubationszeit von fünf Minuten für jede Wäsche. Waschen Sie die Kügelchen dann noch zwei Mal schnell mit 1 Milliliter LAP 200 N, das 0,5 millimolares DTT und keine Proteasehemmer enthält, bevor Sie die Protease Tobacco Etch Virus (TEV) hinzufügen. Geben Sie 10 Mikrogramm der TEV-Protease in einem Milliliter LAP 200 N zu den Kügelchen und drehen Sie die Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag pelletieren Sie die Kügelchen und geben den Überstand in eine frische Tube. Spülen Sie die Kügelchen zweimal mit 160 Mikrolitern LAP 200 N, das 0,5 millimolare DTT und Proteaseinhibitoren enthält, um alle Proteinreste zu entfernen. Für die zweite Affinitätserfassung durch Bindung an S-Protein-Agarose waschen Sie ein Röhrchen mit 80 Mikrolitern S-Protein-Agarose-Aufschlämmung dreimal mit einem Milliliter LAP 200 N. Geben Sie den TEV-eluierten Überstand zu den S-Proteinkügelchen und schütteln Sie sie drei Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Nach dem Pelletieren werden die Kügelchen dreimal mit einem Milliliter LAP 200 N gewaschen, das 0,5 millimolare DTT und Proteaseinhibitoren enthält. Waschen Sie die Kügelchen dann zweimal mit einem Milliliter LAP 100. Eluieren Sie die Proteine vom S-Protein Agarose, indem Sie 50 Mikroliter 4x Laemmli Probenpuffer hinzufügen und 10 Minuten lang auf 97 Grad Celsius erhitzen.

Um interagierende Proteine durch massenspektrometrische Analyse zu identifizieren, testen Sie die Qualität der Reinigung, indem Sie die gesammelten Proben durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysieren. Färben Sie das resultierende Gel mit Silber. Außerdem werden die Eluate immunabgetupft und mit Anti-GFP-Antikörpern untersucht, um sicherzustellen, dass die LAP-markierte Reinigung funktioniert.

Um stöchiometrische und substöchiometrische Co-Reinigungsspezies zu identifizieren, entnehmen Sie die endgültige Elutionsprobe und trennen Sie sie mit SDS-PAGE. Färben Sie das Gel mit einer massenspektrometrischen kompatiblen Proteinfärbung. Die markantesten Banden im Gel und der Raum dazwischen werden herausgeschnitten, um die Banden für die Analyse durch Massenspektrometrie separat zu bearbeiten.

Hier ist eine repräsentative Western-Blot-Analyse der Proteinproben aus nicht-induzierten und Dox-induzierten LAP-Tau HEK293-Zellen dargestellt. Die Zellen werden mit Anti-Tubulin-Antikörpern untersucht, um die Tubulin-Beladungskontrolle nachzuweisen, und mit Anti-GFP, um das LAP-markierte Tau-Protein nachzuweisen. Beachten Sie, dass LAP-Tau nur exprimiert wird, wenn die Zellen mit Dox induziert werden.

Mytotische Zellen, die LAP-Tau exprimieren, wurden fixiert und mit Anti-Tubulin-Antikörpern für DNA und Tubulin co-gefärbt, und die subzelluläre Lokalisation von LAP-Tau wurde durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Beachten Sie, dass LAP-Tau während der Mitose an der mitotischen Spindel und den Spindelpolen lokalisiert ist. Hier ist ein repräsentatives silbergefärbtes Gel der LAP-Tau Reinigung zu sehen.

Die Spuren stellen das Molekulargewicht, die gereinigten Lysate und die endgültigen Eluate dar. Die Proben wurden auf einem 4-20%SDS-PAGE-Gel durchgeführt und das Gel wurde silbergefärbt, um die gereinigten Proteine sichtbar zu machen. Beachten Sie, dass eine Bande, die LAP-Tau entspricht, mit einem Sternchen gekennzeichnet ist, und mehrere andere Banden, die co-reinigenden Proteinen entsprechen, zu sehen sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man induzierbare LAP-markierte stabile Zelllinien erzeugt und wie man biochemische Aufreinigungen von LAP-markierten Proteinen für die proteomische Analyse und Identifizierung von Proteininteraktionsnetzwerken durchführt.