Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein kontinuierliches Kultivierungsgefäß zusammenzusetzen, in dem die Reaktion auf Beleuchtung optogenetischer Mikroben automatisch mit einem Mikroskop in Echtzeit und über mehrere Tage gemessen werden kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zellbiologie und im Metabolic Engineering zu beantworten, z. B. wie dynamische Genexpression Reaktionen hervorrufen kann, die sich von der statischen Genexpression unterscheiden. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass die kontinuierliche Kultur es ermöglicht, Messungen über mehrere Tage hinweg zu sammeln.

Löten Sie zunächst die Erdungsleitung, die Datenleitung und die positive Spannungsleitung des digitalen Thermometers an die Leiterplatte. Schneiden Sie einen Stift von einer dreipoligen Stiftleiste ab und schneiden Sie die restlichen zwei Stifte ab. Löten Sie diesen in das Lochpaar mit der Bezeichnung R2 und verbinden Sie die beiden gelöteten Stifte, indem Sie einen 4,7-Kiloohm-Widerstand in die Stiftleiste einsetzen.

Verbinden Sie als nächstes die restlichen Komponenten mit der Platine. Überlagern Sie die Platine mit dem Mikrocontroller. Richten Sie das lichtdichte Gehäuse ein und installieren Sie die gesamte Software, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben.

Setzen Sie zunächst das lange Ende der Aluminiumöffnung durch die Dichtung in das Kultivierungsgefäß ein und schrauben Sie die Kappe auf. Decken Sie einen kurzen Aluminiumauslass mit einem Silikonschlauch mit mittlerem Durchmesser ab. Verstopfen Sie das Destillierende, indem Sie einen weiblichen Luer-Lock einsetzen und dann einen männlichen Luer-Lock-Stecker anschließen.

Diese Steckdose ist ergänzend und wird nicht verwendet. Verbinden Sie zwei kurze Segmente aus Silikonschläuchen mit mittlerem Durchmesser mit männlichen und weiblichen Luer-Locks. Verbinden Sie dann ein Ende mit einer kurzen Aluminiumsteckdose und stecken Sie das Destillierende ein.

Das Gefäß wird durch diesen Schlauch geimpft. Verbinden Sie als Nächstes zwei mittlere Schläuche mit den Enden der Peristaltikschläuche und -anschlüsse mit mittlerem Durchmesser. Verbinden Sie ein Ende mit einem kurzen Aluminiumanschluss und stecken Sie das andere ein.

Später wird diese mit der Medienflasche verbunden. Schließen Sie einen Silikonschlauch mit mittlerem Durchmesser an den längsten Aluminiumanschluss an. Das Röhrchen sollte lang genug sein, um den Medienkolben zu erreichen.

Verbinden Sie ein weiteres kurzes, einige Zentimeter langes Segment mit dem Ende und stecken Sie es dann in den Gummistopfen des Medienkolbens. Klemmen Sie das Rohr fest. Wenn diese Verbindung später gelöst wird, ermöglicht diese Verbindung, dass die Kultur gemischt, belüftet und durch die einströmenden Blasen auf einem positiven Druck gehalten wird.

Ein Rohr mit mittlerem Durchmesser, das lang genug ist, um den Boden des Kolbens zu erreichen, wird in den Stopfen eingeführt, durch den das Medium übertragen wird. Verbinden Sie ein weiteres Rohr mit mittlerem Durchmesser mit diesem und dann ein Rohr mit breitem Durchmesser am Ende. Stecken Sie das Destillierende ein.

Füllen Sie das dritte Loch im Stopfen mit einem kurzen Segment eines Schlauchs mit mittlerem Durchmesser, der mit zwei anderen Segmenten eines Schlauchs mit mittlerem Durchmesser verbunden und am Destillationsende verstopft ist. Diese wird an eine Vakuumpumpe und später an eine Aquarienpumpe angeschlossen. Führen Sie einen männlichen Luer-Lock in ein Segment eines Silikonschlauchs mit schmalem Durchmesser ein und führen Sie dann den PTFE-Schlauch fest ein.

Befestigen Sie dann einen weiblichen Luer-Lock an einem Rohr mit mittlerem Durchmesser. Fädeln Sie die weibliche Verriegelung entlang des PTFE-Schlauchs, um die Schlösser zu verbinden, und die andere mit einem kurzen Aluminiumanschluss. Stellen Sie sicher, dass der PTFE-Schlauch im Inneren des Kultivierungsgefäßes unter dem zweitlängsten Aluminiumrohr und über dem Boden baumelt.

Schneiden Sie nach Bedarf. Von hier aus wird das Medium in den Bildgebungskanal abgetastet, und der schmale Schlauch minimiert das Zwischenvolumen. Verbinden Sie als Nächstes den freiliegenden schmalen Silikonschlauch mit dem schmalen Schlauch und den Verbindungsstücken.

Damit werden abwechselnd drei Segmente aus Schläuchen mit schmalem Durchmesser und zwei Segmente aus PTFE-Schläuchen verbunden. Verbinden Sie diesen über einen Schlauch mit mittlerem Durchmesser mit dem Abwasserbehälter. Verbinden Sie dann ein Ende eines Silikonschlauchs mit mittlerem Durchmesser mit dem zweitlängsten Rohr der Aluminiumöffnung am anderen Ende des Abwasserbehälters.

Dieses Aluminiumrohr stellt das Kulturvolumen ein, und die überschüssige Kultur läuft in den Abwasserbehälter über. Wickeln Sie die Deckel des Kolbens mit Aluminiumfolie ein und autoklavieren Sie die Baugruppe dann 30 Minuten lang bei 121 Grad Celsius und 15 PSI. Befestigen Sie den Vakuumfilter an einer 100-Milliliter-Flasche.

Entfernen Sie die Nippelabdeckung und entfernen Sie dann den weißen Stopfen mit einer sterilen Pinzette vom Nippel des Vakuumfilters. Verbinden Sie den breiten Silikonschlauch mit dem Nippel, den anderen freien Schlauch des Medienkolbens mit einer Vakuumpumpe und stellen Sie sicher, dass der dritte Schlauch, der den Medienkolben mit dem Kulturgefäß verbindet, zugeklemmt ist. Füllen Sie den Filter mit Medien, schalten Sie die Vakuumpumpe ein und filtern Sie dann den Rest des Mediums.

Klemmen Sie den mit dem Vakuum verbundenen Silikonschlauch fest und schalten Sie die Vakuumpumpe aus. Entfernen Sie die Luers aus dem Zwischensegment des mittleren Silikonschlauchs, der mit der Vakuumpumpe verbunden ist, und führen Sie das blaue Ende eines sterilen Spritzenluftfilters in diesen Schlauch ein. Klemmen Sie dann den breiten Silikonschlauch ein und trennen Sie den männlichen Luer davon.

Ziehen Sie den Stecker aus der Buchse des Medieneinlassrohrs des Kulturgefäßes. Schließen Sie diese Luers an, um das Pumpen von Medien in das Kulturgefäß zu ermöglichen. Entfernen Sie dann den Filter aus der 100-Milliliter-Flasche und setzen Sie den Flaschenverschluss auf.

Verwenden Sie dieses Medium, um eine Starterkultur vorzubereiten. Die kontinuierliche Kultivierung wird in der Nähe eines Mikroskops aufgestellt, wobei der Medienkolben höher als das Kultivierungsgefäß und der Abwasserkolben niedriger als das Kultivierungsgefäß aufgestellt wird, um einen Rückfluss zu verhindern. Kleben Sie die Gummistopfen sicher auf das Medium und die Abwasserbehälter

Ziehen Sie dann die Enden des PTFE-Schlauchs von dem schmalen Silikonschlauch ab, der sie verbindet, und stecken Sie diese Enden in den Ein- und Auslass eines vorbereiteten mikrofluidischen Geräts. Schieben Sie dann das Medium in das Zuchtgefäß, indem Sie das weiße Ende des Spritzenluftfilters mit der Aquarienpumpe verbinden. Wenn das Medium das Niveau des Abwasseranschlusses erreicht, wickeln Sie die Mediumeinlassschläuche und -anschlüsse um die langsame Peristaltikpumpe und die schmalen Probenauslassschläuche und -anschlüsse um die schnelle Peristaltikpumpe.

Das Medium wird belüftet, indem der Luftschlauch zwischen dem Medienkolben und dem Kulturgefäß gelöst wird. Kleben Sie dann das Heizkissen und das Thermometer an das Kultivierungsgefäß, damit die Temperatur kontrolliert werden kann. Wickeln Sie den Medienschlauch um das Kultivierungsgefäß, so dass das eintretende Medium die gleiche Temperatur wie das Gefäß hat.

Setzen Sie dann das Kulturgefäß in das schwarze Schaumstoffgehäuse über der LED-Matrix ein und achten Sie darauf, dass die Röhren nicht eingeklemmt werden. Verwenden Sie das Plug-in des Bioreaktor-Controllers, um die Pumpe des langsamen Mediums für ein Zehntel aller 30 Sekunden einzuschalten. Die Durchflussrate ist sehr gering, aber größer als die Verdunstungsrate.

Klemmen Sie den Zuluftschlauch zwischen den Medienkolben und das Kulturgefäß. Beimpfen Sie das Kulturgefäß mit einer Pipette mit einem Milliliter aus einer Starterkultur. Klemmen Sie dann das Destillationsende dieses Rohrs und lösen Sie den Luftschlauch.

Lassen Sie die Kultur über Nacht wachsen. Decken Sie das Gehäuse so ab, dass kein Licht eindringt. Verwenden Sie am nächsten Tag das Plug-in des Bioreaktorreglers, um die Schlauchpumpen so einzustellen, dass sie sich für einen längeren Zeitraum drehen, der den gewünschten Medien und Probenahmedurchflussraten entspricht.

Lassen Sie die Kulturdichte über Nacht ins Gleichgewicht kommen. Füllen Sie am nächsten Tag die Positionsliste und den Mikromanager der Bühne mit einer Reihe von nicht überlappenden Positionen, an denen sich die in den mikrofluidischen Kanal gepumpten Zellen in der Fokusebene befinden. Öffnen Sie dann das Bioreaktor-Controller-Plugin.

Wählen Sie den gewünschten Zeitverlauf der LED-Matrix, die Bildkanäle und andere experimentelle Einstellungen aus den Eingabeaufforderungen aus und beginnen Sie dann mit der Datenerfassung. Diese Apparatur wurde verwendet, um eine Kultur von Saccharomyces cerevisiae zu stimulieren, die gelb fluoreszierendes Protein als Reaktion auf blaues Licht über ein induzierbares optogenetisches Transkriptionssystem exprimiert. Es wurden Basenkontrast- und Fluoreszenzbilder des mikrofluidischen Kanals aufgenommen.

Aus den Phasenkontrastbildern wurden Zellumrisse identifiziert, mit den Fluoreszenzbildern abgebildet und die Fluoreszenzbilder in Echtzeit aufgezeichnet. Die Heatmap zeigt hier die Fluoreszenzverteilung einer Kultur aufgrund der Produktion von gelb fluoreszierenden Proteinen bei Aktivierung des optogenetischen Systems. Die Fluoreszenz von etwa 170.000 Zellen wurde aus über 30.000 Bildern analysiert, die von 28 Tischpositionen über einen Zeitraum von 70 Stunden aufgenommen wurden.

Während dieser Studie wurde die Kultur sechs Stunden lang unterschiedlichen Intensitäten von blauem Licht ausgesetzt, gefolgt von sechs Stunden völliger Dunkelheit. Die Zellen waren vor der ersten Messung Licht ausgesetzt worden, weshalb die Fluoreszenzintensität während der ersten Dunkelperiode abnimmt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden über einen Zeitraum von drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, eine sterile Technik zu verwenden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Echtzeit-Feedback-Steuerung, zur Steuerung der Proteinkonzentration verwendet werden. Diese Technik wird es ermöglichen, Organismen mit optogenetischen Konstrukten dynamisch zu untersuchen, über längere Zeiträume, länger als dies mit Platten oder Chargenkulturen möglich ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein kontinuierliches Kulturgerät, ein Licht und ein Mikroskop integriert, um optogenetische Mikroben zu stimulieren und zu untersuchen.