Name: Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie ein automatisiertes Kultivierungs- und Beleuchtungssystem für optogenetische Mikroben aufbauen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Messungen dynamischer Genexpression über mehrere Tage.

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Wir möchten, dass bei der Prüfung der Protokoll, Kieran Sweeney für hilfreiche Diskussionen und Bearbeitung, und Taylor Scott, My An-adirekkun und Stephanie Geller für das kritische Lesen des Manuskripts Molly Lazar und Verónica Delgado für die Unterstützung zu bestätigen. Megan Nicole McClean, Ph.D. hält an der Scientific-Schnittstelle vom Burroughs Wellcome Fund ein Career Award.

<ol><li>Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+control+of+DNA+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Light-mediated control of DNA transcription in yeast.</a> Methods. 58 (4), 385-391 (2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+A+light-inducible+CRISPR-Cas9+system+for+control+of+endogenous+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).</li>
<li>Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-inducible+organelle-targeting+system+for+dynamically+activating+and+inactivating+signaling+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast.</a> Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).</li>
<li>Lee, S., Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+protein+inactivation+by+optogenetic+trapping+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells.</a> Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-induced+dimerization+of+a+bacterial+LOV-HTH+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein.</a> Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).</li>
<li>Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LOV2+Domain-Based+Optogenetic+Tool+to+Control+Protein+Degradation+and+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).</li>
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<li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).</li>
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<li>Galanie, S., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+yeast-based+production+of+medicinal+protoberberine+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids.</a> Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).</li>
<li>Gerngross, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+production+of+human+therapeutic+proteins+in+yeasts+and+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.</a> Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).</li>
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<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.jbmethods.org/jbm/article/view/36/0">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of biological methods. 1 (2), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/1438429/">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
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<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).</li>
<li>McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).</li>
<li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li>
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<li>Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1967.tb03043.x/pdf">Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast.</a> Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).</li>
<li>Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+phosphate+scarcity+on+pharmaceutical+protein+production+in+S.+cerevisiae%3A+linking+transcriptomic+insights+to+phenotypic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses.</a> Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).</li>
<li>Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Systems+of+Bacteria+such+as+Escherichia+coli+in+Response+to+Nutrient+Limitation+and+Environmental+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses.</a> Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).</li>
<li>Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+bacterial+gene+circuit+dynamics+with+optically+programmed+gene+expression+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals.</a> Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir haben dieses Gerät mit Flexibilität im Auge behalten. Der gesamte Code verwendet wird, ist kostenlos und Open-Source. Die Standard-Bildanalyseprozess Segment Zellen ist einfach und schnell läuft. Benutzerdefinierte Analyse könnte durch die Aufzeichnung von Benutzereingaben durchgeführt werden, während ein repräsentatives Bild mit der FIJI grafischen Benutzeroberfläche Analyse, Umwandlung der Eingabe in ein Skript Beanshell und dann Setzen des Plugin, das Skript zu nennen. Wenn es aufgerufen wird, wird das Skript ein...

Optogenetische Systeme verwenden Licht eine wachsende Liste von zellulären Prozessen , einschließlich Expression Gens zu kontrollieren, 1, 2, 3, 4, 5 Proteinlokalisierung, 6 - Protein - Aktivität, 6, 7, 8 Proteinbindungs, 8, 9, 10 und den Proteinabbau. 11 Verfahren für Zellen in einer kontrollierten Umgebung mit programmierten optischen Stimulation und zum Messen von deren Reaktion über biologisch relevanten Zeitskalen Züchten ist notwendig , das Potential dieser Werkzeuge für die Forschung in der Zellbiologie und der Biotechnologie zu nutzen. Unsere Methode nutzt chemostasis eine konstante Zellwachstumsrate in einem gut gemischten aufrechtzuerhalten, aegelesen und temperaturgeregelten Glaskulturgefäß 12, 13, die so programmiert Beleuchtung ausgesetzt ist. Wir Bild einzelnen Zellen in der Kultur Abstrom mit einem umgekehrten Mikroskop die Reaktion der Kultur zu programmierten Beleuchtungs zu messen. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind vollständig automatisiert, so dass die Fluoreszenzintensität und Zellmorphologie des Abflusses Zellkultur kann über mehrere Tage ohne Benutzereingabe gemessen werden. Dieses Protokoll kann in den meisten Labors vertraut mit wachsenden Zellkultur und Mikroskopie durchgeführt werden, und die verwendete Vorrichtung ist kostengünstig und aus leicht verfügbaren Komponenten. Ein transparentes Kulturgefäß über einer Matrix aus Leuchtdioden (LEDs) emittieren kann 1 &amp; mgr; W / cm 2 -10 mW / cm 2 von Licht angeordnet. Mikroben werden in dem Kulturgefäß kontinuierlich gewachsen; eine peristaltische Pumpe verwendet Medien bei der hinzufügenVerdünnungsrate wird eine andere verwendet Kultur mit einer geringeren Rate an das Mikroskop zurückzuziehen, und die Differenz entweicht durch einen Überlaufauslaß. Ein Heizkissen hält die Temperatur. Die Luft wird kontinuierlich in das Kulturgefäß gepumpt, um einen positiven Druck als auch zu halten, wie zu mischen und die Kultur belüften. Mit Ausnahme der Luftpumpe, Leistung dieser Vorrichtungen wird durch einen Mikrocontroller geregelt, die auch eine Eingabe von einem Thermometer und einem angeschlossenen Desktop-Computer empfängt. Der Abstrom Zellkultur wird auf eine Mikrofluidik-Vorrichtung auf der Bühne eines umgekehrten Mikroskops gepumpt. Nicht fluoreszierende und Fluoreszenzbilder werden automatisch erfasst. Die Zellen in den Bildern durch einen Algorithmus gekennzeichnet, daß jede Zelle als eine Region von Interesse (ROI) lokalisiert und mißt die Eigenschaften der einzelnen ROI. Um eine Anwendung dieses Protokolls zu demonstrieren, maßen wir die Antwort auf unterschiedlichen Lichtintensitäten von Saccharomyces cerevisiae - Zellen entwickelt , mit einem Blaulicht Verantve optogenetische System, das die Transkription von fluoreszierenden Proteins steuert. S. cerevisiae, wie Bäckerhefe allgemein bekannt ist , wurde ausgewählt , weil mehrere optogenetische Systeme für die bereits in diesem System Genexpression Steuerung 14 vorhanden ist , 15, 16. Darüber hinaus ist dieses Modellorganismus für Studien in der Systembiologie 17 und als Fahrgestell für biotechnologische Anwendungen 18, 19, 20 verwendet. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, die Transkription einer Kultur über mehrere Tage zu steuern, indem Eingangslichtintensitäten variierende und die Herstellung eines fluoreszierenden Reporter messen.

<table><tbody><tr><td>Umfangreiches Laborhandbuch</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Ein umfangreiches, regelmäßig aktualisiertes Laborhandbuch finden Sie in der " Optogenetische Chemostat-Dateien" GitHub-Repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Dazu gehört auch eine Beschreibung des mikrofluidischen Werkzeugs, mit dem die repräsentativen Ergebnisse generiert wurden.</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td><td>Die kostenlose, quelloffene Software zum Betrachten und Bearbeiten von Leiterplattendesigns vom Typ .fzz ist unter "http://fritzing.org/download/"</td></tr><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - montiert)</td><td>Adafruit</td><td></td><td>50 Mikrocontroller verfügbar. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Arduino Stackable Header Kit</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10007</td><td>Stiftleisten für den Anschluss der Leiterplatte an den Mikrocontroller. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Einstellbarer 30W 110V Lötkolben - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>Zum Herstellen von elektrischen Verbindungen zur Leiterplatte. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Lötkolbenständer</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>Zum Herstellen von elektrischen Verbindungen zur Leiterplatte. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Mini-Lötspule - 60/40 Blei Kolophonium-Kern Lot 0,031" Durchmesser - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>Zum Herstellen von elektrischen Verbindungen zur Leiterplatte. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>0,1 &mu; F Kondensator</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>Stabilisiert die Spannung in der Leiterplatte. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>10 &mu; F-Kondensator</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-00523</td><td>Stabilisiert die Spannung in der Leiterplatte. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>MAX7219CNG LED-Matrix-/Ziffernanzeigetreiber - MAX7219</td><td>Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>LED-Treiber. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>8 Pin IC Sockel</td><td>Mouser Electronics</td><td>575-144308</td><td>16 erforderlich. Diese werden übereinander gestapelt, um das Kulturgefäß über der LED-Matrix zu stützen.</td></tr><tr><td>24 Pin IC-Sockel</td><td>Mouser Electronics</td><td>535-24-3518-10</td><td>Optional. Verwenden Sie diese Option, um den MAXIM 7219CNG-Treiber reversibel an die Leiterplatte anzuschließen.</td></tr><tr><td>Digitalmultimeter</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>Zur Fehlersuche in der Elektronik. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Break-Away-Stiftleisten - 40-poliger Stecker (lang zentriert, PTH, 0,1")</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>Stiftleisten für den Anschluss von LED-Matrix an die Leiterplatte. Die Enden können mit einem Drahtschneider abgeschnitten werden. 1 Satz erforderlich.&nbsp;</td></tr><tr><td>Bündiger Seitenschneider</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>Zum Trimmen langer Stiftleisten und Schneiden von Stromkabeln. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Premium-Buchse/Buchse Überbrückungsdrähte - 40 x 12" (300 mm)</td><td>Adafruit</td><td>793</td><td>Drahtband zum Anschluss des Steckbretts an die LED-Matrix. Kann Ende-zu-Ende mit Stiftleisten verbunden werden, um länger zu sein. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Half-Size Breadboard</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>Die LED-Matrix wird mit diesem verbunden und das Kultivierungsgefäß ruht darüber.</td></tr><tr><td>Miniatur 8x8 Blue LED Matrix</td><td>Adafruit</td><td>956</td><td>Lichtquelle. Die dominierende Wellenlänge beträgt 470 nm (blau). 1 erforderlich. Alternative Miniatur-LED-Matrizen desselben Herstellers sind mit dominanten Wellenlängen erhältlich: 624 nm (rot), 588 nm (gelb), 525 nm (grün), 572 nm (gelb-grün) und weiß.</td></tr><tr><td>Stapelbarer Header-3-polig</td><td>SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8 erforderlich.</td></tr><tr><td>Widerstandssatz - 1/4W (500 insgesamt)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>Für Elektronik. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>&nbsp; IRL520N MOSFET</td><td>International Rectifier</td><td>IRL520N</td><td>Spannungsregelschalter zur Steuerung des Gleichstroms. 4 erforderlich.</td></tr><tr><td>Hook-Up Wire - Sortiment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>Draht für Elektronik. 1 benötigt.</td></tr><tr><td>5V 2A (2000mA) Schaltnetzteil - UL Listed</td><td>Adafruit</td><td>276</td><td>Netzteil für das Heizkissen und Arduino. 2 erforderlich.</td></tr><tr><td>12 VDC 1000mA geregeltes Schaltnetzteil - UL-gelistetes</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>Für Schlauchpumpen. 2 erforderlich.</td></tr><tr><td>Elektrisches Heizkissen - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>Zum Heizen des Bioreaktors. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe mit variablem Durchfluss mit niedrigem Durchfluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td>Zum Pumpen von Medien. 1 erforderlich</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe mit mittlerem Durchfluss mit variablem Durchfluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>Zum Pumpen von Kulturen. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>9 VDC 1000mA geregeltes Schaltnetzteil - UL-gelistetes</td><td>Adafruit</td><td>63</td><td>Für die Stromversorgung von Mikrocontrollern. Anordnung 1.</td></tr><tr><td>Wasserdichter Hochtemperatur-DS18B20 Digitaler Temperatursensor + Extras</td><td>Adafruit</td><td>642</td><td>Thermometer für den Bioreaktor. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Micromanager</td><td>Micromanager</td><td>NA</td><td>Die kostenlose, quelloffene Software zur Steuerung von Mikroskopen ist unter "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" erhältlich</td></tr><tr><td>.</td><td>FIJI ImageJ</td><td>NA</td><td>Die kostenlose, quelloffene Bildanalysesoftware ist unter "http://fiji.sc/"</td></tr> <tr><td>erhältlichArduino Integrated Development Environment</td><td>Arduino</td><td>NA</td><td>Die kostenlose, quelloffene IDE ist unter "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"</td></tr> <tr><td>Custom Code</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>verfügbar. Der benutzerdefinierte Mikrocontroller-Code und das "Bioreactor Controller"-Plugin sind in der " Optogenetische Chemostat-Dateien" GitHub-Repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>USB-Kabel A auf B - 6 Fuß</td><td>SparkFun Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>Wird zum Herunterladen von Daten auf den Mikrocontroller verwendet. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Der Vorteil des Ladens von LED-Matrixwerten aus einer CSV-Datei besteht darin, dass ein Programm vom Plugin aufgerufen werden kann, um diese Werte basierend auf den Bildanalyseergebnissen zu aktualisieren, und diese Werte können wieder auf den Mikrocontroller geladen werden, was eine Rückkopplungssteuerung ermöglicht. Es ist verfügbar über die " Optogenetische Chemostat-Dateien" GitHub-Repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Tota-Frost-Gele (Diffusionspapier)</td><td>B& H</td><td>B& F H # LOFSFTL MFR # T1-72</td><td>Für LED-Matrix. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>Schwarzer Schaumstoff für die Einhausung von Zuchtgefäßen. 4 erforderlich.</td></tr><tr><td>Standard-Fotodioden-Leistungssensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>Zur Messung der Lichtintensität. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Beschriftungsband</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>Zum Etikettieren und Sichern von losen Bauteilen. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Kompaktes Leistungs- und Energiemesspult, Digital 4" LCD</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Zur Messung der Lichtintensität. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>100 mL GL45 Hybridisierungs-Glasflasche</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>(7910-40150)</td><td>Bioreaktorbehälter. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Montage mit sechs Anschlüssen</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>Benutzerdefiniert&nbsp;</td><td>Für das Bioreaktorgefäß. Schlauchspezifikationen: .125" OD x .055" ID. Anschluss A: 1,0" lang über dem Kappen-Slug und bis zum Boden des Rohrs. Anschlüsse B,C,E,F: 1,0" lang über dem Kappenslug, 33 mm lang unten. Anschluss D: 1,0" lang über dem Kappen-Butzen, 65 mm&nbsp; Lange unten. 1 erforderlich. Enthält einen offenen Schraubverschluss aus Polypropylen mit einem Durchmesser von 45 mm und eine weiße Silikondichtung, um eine dichte Abdichtung zwischen der Kappe und dem Gefäß zu gewährleisten.</td></tr><tr><td>Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Zoll, 3er-Pack</td><td>Amazon</td><td>B0009F3P3U</td><td>Clear Scotch Tape. Dies ist bei vielen anderen Anbietern erhältlich. Es wird verwendet, um Markierungen auf dem Kulturgefäß abzudecken und das Deckglas mit der PDMS-Schiene am Aluminium-Stützrahmen zu befestigen.</td></tr><tr><td>1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wand Tygon Sanitär Silikonschlauch</td><td>Vereinigte Staaten Plastic Corp.</td><td>57288</td><td>Schlauch. ~25' erforderlich.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Twistit weißer Gummistopfen, Größe 10</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-62992-32</td><td>Medienkolbenstopfen und Abwasserkolbenstopfen. 2 erforderlich.</td></tr><tr><td>2L Laborkolben</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td>Medienkolben und Abwasserkolben. 2 erforderlich.</td></tr><tr><td>Tag-Pinchhahn</td><td>Fisher Scientific</td><td>5867</td><td>Zum Klemmen von Schläuchen. 3 erforderlich.</td></tr><tr><td>Ersatzschlauch 1/16" ID</td><td>Rückverfolgbare Produkte</td><td>3372</td><td>Die Schlauchpumpen werden mit einem Satz Schläuche geliefert, die jedoch nach wochenlangem Gebrauch verschleißen.</td></tr><tr><td>Ersatzschlauch 1/50" ID</td><td>Rückverfolgbare Produkte</td><td>3371</td><td>Die Schlauchpumpen werden mit einem Satz Schläuche geliefert, die jedoch nach wochenlangem Gebrauch verschleißen.</td></tr><tr><td>Luer-Stecker mit Sicherungsring x 1/16" Schlauchtülle, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td>Anschlüsse. ~10 Luer sind erforderlich.</td></tr><tr><td>Luer-Stecker mit Sicherungsring x 1/8" Schlauchtülle, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td>Anschlüsse. 5 erforderlich, eines für jedes Gummistopfenloch zum Befüllen mit Schlauch.</td></tr><tr><td>Luer-Buchse x 1/16" Schlauchtülle, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>Anschlüsse. ~10 Luer erforderlich.</td></tr><tr><td>Luer-Buchse x 3/16" Schlauchtülle Adapter</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-08</td><td>Anschlüsse. ~10 Luer erforderlich.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer-Zubehör, weibliche Luer-Kappe, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>SC-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer-Zubehör, männlicher Luer-Lock-Stecker, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-Schlauch mit Mikrobohrung, 0,022" ID x 0,042" AD, 100 ft/Rolle</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td>Schlauch. 1 Rolle erforderlich.</td></tr><tr><td>Masterflex platingehärteter Silikonschlauch, L/S 13, 25 ft</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-13</td><td>Schlauch. ~25' erforderlich.</td></tr><tr><td>3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wand Tygon Sanitär Silikonschlauch</td><td>Vereinigte Staaten Plastic Corp.</td><td>57293</td><td>Schlauch. ~1' erforderlich.</td></tr><tr><td>Vakuumfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>974107</td><td>Nalgene Vakuumfilter für sterile Filtermedien.</td></tr><tr><td>Aquel Oxy-Boost 200</td><td>Rena Aquatic Supply</td><td>AP200</td><td>Doppelmembran-Luftpumpe mit einstellbarem Durchfluss zum Belüften und Mischen von Medien. 1 erforderlich.&nbsp;</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Poren-Spritzenvorsatzfilter</td><td>Corning International</td><td>431229</td><td>Dadurch wird sichergestellt, dass die Luft aus der Aquarienpumpe das Gerät nicht verunreinigt. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Slygard 184 Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td>Für mikrofluidische Geräte. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Amerikanischer Rasierhobel GEM Scientific Einschneidige Rasierklingen</td><td>Fisher Scientific</td><td>17989000</td><td>Zum Schneiden von Rohren und PDMS. 1 Klinge erforderlich.</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core Locher 1,2 mm ID</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHAWB100028 ALDRICH</td><td>Zum Stanzen von Ein-/Auslass in mikrofluidischen Geräten. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas 22x60-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Für mikrofluidische Geräte. 1 erforderlich.</td></tr><tr><td>Rechteckiger Aluminiumrahmen mit quadratischem Fenster</td><td>Custom</td><td>Custom</td><td>Zur Unterstützung des mikrofluidischen Kanals. Außenmaße: 3 Zoll x 1,25 Zoll. Innenmaße (ausgeschnittener Teil): 7/8 Zoll x 7/8 Zoll Dicke: ~1/32 Zoll</td></tr></tbody></table>

design und implementierung eines automatisierten illuminating, anzucht und probenahmesystem für mikrobielle optogenetische anwendungen

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetische Systeme verwenden genetisch kodierten Proteine, die Konformation in Reaktion auf bestimmte Wellenlängen des Lichts verändern zellulärer Prozesse zu verändern. Es besteht ein Bedarf für die Kultivierung und Messsysteme, die Beleuchtung und die Stimulation von optogenetische Systeme programmiert einzuarbeiten. Wir stellen ein Protokoll für den Aufbau und die Verwendung eines kontinuierlichen Kultivierungsvorrichtung mikrobiellen Zellen mit programmierter Dosen von Licht zu beleuchten, und automatisch erfassen und die Bilder der Zellen in dem Ausfluß zu analysieren. Der Betrieb dieser Vorrichtung als Chemostat ermöglicht die Wachstumsrate und der Zellumgebung streng kontrolliert werden. Der Austrag der kontinuierlichen Zellkulturen werden regelmäßig Proben genommen und die Zellen werden durch Mehrkanal-Mikroskopie abgebildet. Die Kultivierung, Probenahme, Bildverarbeitung und Bildanalyse sind vollständig automatisiert, so dass dynamische Reaktionen in der Fluoreszenzintensität und zellulärer Morphologie von aus der Kultur Abstrom abgetastete Zellen über mehrere Tage gemessenohne Benutzereingabe. Wir zeigen die Nützlichkeit dieser Kultivierungsvorrichtung durch dynamisches Protein - Produktion in einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae konstruiert mit einem optogenetische System induziert die Transkription aktiviert.

Diese Vorrichtung wurde verwendet , um eine Kultur von S. cerevisiae exprimieren , gelb fluoreszierendes Protein (YFP) in Reaktion auf blaues Licht durch einen induzierbaren optogenetische Transkriptionssystem auf dem CRY2 / CIB1 Proteinpaar 30 basierend zu stimulieren. Die Zellen wurden chemostatically in Phosphat begrenzte Medien mit einer durchschnittlichen Verdünnungsrate von 0,2 ± 0,008 gewachsen. Phosphat Begrenzung wird in S. cerevisiae Ch...

Wir haben eine kontinuierliche Kultivierungsvorrichtung zur Verwendung mit optogenetische Systeme Kulturen von Mikroben zu beleuchten und regelmäßig Bildzellen in dem Abwasser mit einem umgekehrten Mikroskop. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind voll automatisiert, so dass dynamische Reaktionen auf Beleuchtung kann über mehrere Tage gemessen werden.

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein kontinuierliches Kultivierungsgefäß zusammenzusetzen, in dem die Reaktion auf Beleuchtung optogenetischer Mikroben automatisch mit einem Mikroskop in Echtzeit und über mehrere Tage gemessen werden kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zellbiologie und im Metabolic Engineering zu beantworten, z. B. wie dynamische Genexpression Reaktionen hervorrufen kann, die sich von der statischen Genexpression unterscheiden. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass die kontinuierliche Kultur es ermöglicht, Messungen über mehrere Tage hinweg zu sammeln.Löten Sie zunächst die Erdungsleitung, die Datenleitung und die positive Spannungsleitung des digitalen Thermometers an die Leiterplatte. Schneiden Sie einen Stift von einer dreipoligen Stiftleiste ab und schneiden Sie die restlichen zwei Stifte ab. Löten Sie diesen in das Lochpaar mit der Bezeichnung R2 und verbinden Sie die beiden gelöteten Stifte, indem Sie einen 4,7-Kiloohm-Widerstand in die Stiftleiste einsetzen.Verbinden Sie als nächstes die restlichen Komponenten mit der Platine. Überlagern Sie die Platine mit dem Mikrocontroller. Richten Sie das lichtdichte Geh

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Optogenetik ist zu einem mächtigen Werkzeug für den Einsatz in verhaltensneurowissenschaftlichen Experimenten geworden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Design und die Einrichtung von Lasersystemen und bietet ein vollständiges Protokoll für die Durchführung mehrerer und gleichzeitiger optogenetischer In-vivo-Stimulationen, die mit den meisten Verhaltenstestparadigmen von Nagetieren kompatibel sind.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu analysieren von Zelle zu Zelle Übertragung der oszillierenden Informationen durch optogenetische Kontrolle und Überwachung der Genexpression zu leben. Dieser Ansatz bietet eine einzigartige Plattform, um eine funktionale Bedeutung der dynamischen Ausdruck Genprogramme in mehrzelligen Systeme zu testen.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Dieses Protokoll beschreibt, wie optogenetische Experimente zur Kontrolle der Genexpression mit rotem und tiefrotem Licht unter Verwendung von PhyB und PIF3 durchgeführt werden können. Enthalten sind Schritt-für-Schritt-Anleitungen für den Aufbau eines einfachen und flexiblen Beleuchtungssystems, das die Steuerung der Genexpression oder anderer Optogenetik mit einem Computer ermöglicht.

Aufbau eines einfachen und vielseitigen Beleuchtungssystems für optogenetische Experimente

Die zuverlässige Kontrolle lichtempfindlicher Säugetierzellen erfordert die Standardisierung optogenetischer Methoden. Um dieses Ziel zu erreichen, skizziert diese Studie eine Pipeline von Genschaltkreiskonstruktion, Zelltechnik, optogenetischem Gerätebetrieb und Verifikationsassays, um die Untersuchung der lichtinduzierten Genexpression unter Verwendung eines optogenetischen Genschaltkreises mit negativer Rückkopplung als Fallstudie zu standardisieren.

Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

Biolumineszenz-Licht, das von einem Luciferase-Enzym emittiert wird, das ein niedermolekulares Substrat, ein Luciferin, oxidiert, kann genutzt werden, um photosensorische Proteine zu aktivieren, wodurch der Lichtstimulation eine weitere Dimension hinzugefügt und die Manipulation einer Vielzahl von lichtvermittelten Funktionen in Zellen über zeitliche und räumliche Skalen hinweg ermöglicht wird.

Biolumineszente Optogenetik 2.0: Nutzung der Biolumineszenz zur Aktivierung photosensorischer Proteine in vitro und in vivo

Die optogenetische Kontrolle des mikrobiellen Stoffwechsels bietet eine flexible dynamische Kontrolle über Fermentationsprozesse. Das Protokoll zeigt hier, wie man blaulichtregulierte Fermentationen für die chemische und Proteinproduktion auf verschiedenen volumetrischen Skalen aufbaut.

Lichtgesteuerte Fermentationen für die mikrobielle Chemikalien- und Proteinproduktion

Wir beschreiben ein reproduzierbares, automatisiertes und unvoreingenommenes Bildgebungssystem zur Charakterisierung der neuromuskulären Verbindungsfunktion unter Verwendung von menschlichem Skelettmuskelgewebe und optogenetischen Motoneuronen. Dieses System ermöglicht die funktionelle Quantifizierung der neuromuskulären Konnektivität im Laufe der Zeit und erkennt eine verminderte neuromuskuläre Funktion, die durch Neurotoxine und Myasthenia gravis Patientenserum verursacht wird.

Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs

Dieses Protokoll beinhaltet die Transfektion von cAMP-Sensoren und bPAC-nLuc, einem optogenetischen Protein, um seine zelluläre Verteilung und Reaktion auf Lichtstimulation genau zu verfolgen. Der innovative Ansatz, eine cAMP-Antwortkarte mit Hilfe eines Punktscansystems zu erstellen, birgt das Potenzial, die Forschung mit optogenetischen Proteinen in verschiedenen Bereichen voranzutreiben.

Kartierung der zellulären Verteilung eines optogenetischen Proteins mit Hilfe eines Lichtstimulationsgitters

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Verwendung der automatisierten Plattform Lustro zur Durchführung einer Hochdurchsatz-Charakterisierung optogenetischer Systeme in Hefe.

Hochdurchsatz-Optogenetik-Experimente in Hefe mit der automatisierten Plattform Lustro

Diese Arbeit beschreibt eine Methode für Hochdurchsatz-Experimente mit einem 3D-gedruckten LED-Array, um die lichtinduzierbare Genexpression in HEK293T Zellen zu optimieren.

Schnelle Optimierung eines lichtinduzierbaren Systems zur Kontrolle der Genexpression von Säugetieren

Erfahren Sie, wie Sie ein automatisiertes Kultivierungs- und Beleuchtungssystem für optogenetische Mikroben aufbauen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Messungen dynamischer Genexpression über mehrere Tage.

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen (Video) | JoVE Journal

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

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