Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Kräfte auf den Linker des Nukleoskeletts Zytoskelett oder LINC-Komplex durch FRET-Mikroskopie in lebenden Zellen über einen Biosensor zu bestimmen, der für das Protein des LINC-Komplexes, Nesprin-2G, entwickelt wurde. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Mechanotransduktion zu beantworten, wie z. B. die Kräfte, die auf Proteine im Zellkern lebender Zellen ausgeübt werden, und wie sich diese Kräfte unter verschiedenen Bedingungen ändern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Fähigkeit, sehr kleine Kräfte auf Proteine und lebende Zellen zu messen.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, Bilder aufzunehmen. Es ist schwierig, die Laserleistung und -verstärkung des Mikroskops zu optimieren, um ein gutes Signal zwischen allen Versuchsgruppen zu erhalten. Zu Beginn züchten Sie NIH 3T3-Faserblastenzellen auf einen Konfluenzwert zwischen 70 % und 90 % in einer Sechs-Well-Zellkulturschale in einem Standard-Zellkulturinkubator mit Temperatur- und CO2-Regulierung.

Entfernen Sie in einer Zellkulturhaube das Medium und spülen Sie jede Vertiefung mit etwa 1 Milliliter eines reduzierten Serumzellmediums aus. Geben Sie 800 Mikroliter reduziertes Serumzellmedium in jede Vertiefung und stellen Sie die Sechs-Well-Kammer in den Inkubator. Pipettieren Sie dann 700 Mikroliter reduziertes Serumzellmedium in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit der Aufschrift L mit 35 Mikrolitern Lipidträgerlösung, um die Lipo-Mischung zu bilden.

Mischen Sie die Suspension durch Pipettieren. Als nächstes pipettieren Sie 100 Mikroliter des reduzierten Serumzellmediums in jedes der sechs 1,5-Milliliter-Röhrchen, die mit eins bis sechs beschriftet sind. Pipettieren Sie die Plasma-DNA für den Nesprin Tension Sensor, Nesprin Headless Zero Force Control, mTFP1 und Venus in die Röhrchen eins bis sechs, wie im Textprotokoll beschrieben.

Verwenden Sie Pipettenspitzen nicht wieder, wenn Sie verschiedene Arten von DNA pipettieren. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter der Lipo-Mischung aus dem L-Röhrchen in jedes markierte Röhrchen und mischen Sie es durch wiederholtes Pipettieren, wobei Sie für jedes Röhrchen eine saubere Pipette verwenden. Inkubieren Sie die Suspension 10 bis 20 Minuten lang.

Geben Sie als nächstes 200 Mikroliter aus jedem markierten Röhrchen in eine Vertiefung der vorbereiteten Sechs-Well-Kammer mit den Zellen. Beschriften Sie den oberen Teil jeder Vertiefung mit der entsprechenden DNA. Stellen Sie dann die Sechs-Well-Kammer für vier bis sechs Stunden in einen Inkubator.

Nach der Inkubation aspirieren Sie das Medium und fügen Sie ein bis zwei Milliliter reduziertes Serumzellmedium zum Spülen hinzu. Aspirieren Sie das reduzierte Serumzellmedium und geben Sie zwei Milliliter Trypsin in jede Vertiefung, bevor Sie die Sechs-Well-Schale für fünf bis 15 Minuten in den Inkubator stellen. Während sich die Zellen im Inkubator lösen, beschichten Sie sechs Glasbodenschalen mit einer Schicht aus Fibronektin in einer Konzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter, gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Lassen Sie die Schalen die Oberfläche in der Zellkulturhaube beschichten. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie zwei Milliliter DMEM hinzufügen, sobald die Zellen abgelöst sind. Übertragen Sie dann den Inhalt jeder Vertiefung in ein beschriftetes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und drehen Sie ihn fünf Minuten lang in einer Schwingrotorzentrifuge mit dem 90-fachen g herunter.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 1.000 Mikrolitern DMEM mit einer Pipette. Aspirieren Sie das Fibronektingemisch aus den Glasschalen und pipettieren Sie 1.000 Mikroliter jeder Zellsuspension auf die Schalen. Nachdem sich die Zellen am Boden der Glasschalen abgesetzt haben, geben Sie einen weiteren Milliliter Medium in jede Vertiefung.

Lassen Sie die Zellen mindestens 18 bis 24 Stunden lang im Zellinkubator ansetzen und exprimieren. Um die Transfektionseffizienz zu überprüfen, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Anregungsfrequenz nahe 462 Nanometern für mTFP1 oder 525 Nanometern für Venus ausgestattet ist. Verwenden Sie einen Emissionsfilter, der in der Nähe von 492 Nanometern für mTFP1 oder 525 Nanometern für Venus zentriert ist.

Etwa 18 bis 24 Stunden nach Abschluss der Transfektion können Sie mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop die Effizienz der Transfektion untersuchen, indem Sie die Anzahl der Fluoreszenzzellen mit der Gesamtzahl der sichtbaren Zellen vergleichen. Wenn lebende Zellen innerhalb von 48 Stunden nach der Transfektion nicht abgebildet werden können, fixieren Sie die Zellen fünf Minuten lang in 4%-Paraformaldehyd. Lassen Sie die Zellen 24 bis 48 Stunden lang den Sensor exprimieren, bevor Sie fixiert werden.

Lagern Sie die Zellen in PBS und sehen Sie sie nach 48 Stunden an. Ersetzen Sie in einer Zellkulturhaube das Zellmedium durch ein bildgebendes Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt wird. Stellen Sie die Betrachtungsschalen in einen temperaturgesteuerten konfokalen Mikroskoptisch.

Platzieren Sie die Glasbetrachtungsschale mit mTFP1-transfizierten Küvetten über dem Ölobjektiv bei 60-facher Vergrößerung und einer numerischen Apertur von 1,4. Lokalisieren Sie mTFP1-exprimierende Zellen im Weitfeld-Fluoreszenzmodus. Wenn sich eine Fluoreszenzzelle im Sichtfeld befindet, wählen Sie den spektralen Detektionsmodus und nehmen Sie das Spektralbild auf.

Schließen Sie alle Frequenzen jenseits von 458 Nanometern in Schritten von 10 Nanometern ein. Wählen Sie einen hellen fluoreszierenden Bereich auf der Zelle aus. Fügen Sie den Fluoreszenz-ROI-Mittelwert als normierte Intensität zur Spektraldatenbank hinzu, indem Sie auf Spektren in Datenbank speichern klicken.

Optimieren Sie die Laserleistung und -verstärkung so, dass ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht wird. Die Einstellungen variieren je nach Gerät. Wiederholen Sie den Vorgang für Venus-exprimierende Zellen und bleiben Sie im Spektralmodus.

Verwenden Sie eine Anregungsfrequenz von 488 Nanometern anstelle von 458 Nanometern. Passen Sie die Leistungseinstellungen nach Bedarf an, aber ändern Sie nicht die Emissionsfrequenzen. Wählen Sie eine helle fluoreszierende ROI von etwa einem Radius von 20 Pixeln aus.

Fügen Sie den Fluoreszenz-ROI-Mittelwert als normierte Intensität zur Spektraldatenbank hinzu, indem Sie auf Spektren in Datenbank speichern klicken. Um die ungemischten Bilder aufzunehmen, schalten Sie zunächst den Aufnahmemodus auf spektrale Unmischung um. Fügen Sie die spektralen Fingerabdrücke von Venus und mTFP1 zu den Entmischungskanälen hinzu.

Stellen Sie den Anregungslaser wieder auf eine 458-Nanometer-Argonquelle ein. Platzieren Sie die Sichtschale des Nesprin-Zugspannungssensors über dem 60X-Ölobjektiv. Nachdem Sie sich auf eine Fluoreszenzzelle mit ausreichend heller Expression fokussiert haben, passen Sie die Verstärkung und die Laserleistung an, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren.

Nehmen Sie mindestens 15 bis 20 Bilder von Nesprin-Zugspannungssensorzellen mit relativ ähnlicher Helligkeit auf und vermeiden Sie eine übermäßige Pixelsättigung. Wiederholen Sie den Bildaufnahmevorgang mit Nesprin-Headless-Zellen unter Verwendung identischer Bildgebungsparameter. Ein repräsentatives 10-fach vergrößertes Bild von 3T3-Fibroblasten, die mit einem Nesprin-Spannungssensor unter Verwendung eines lipidvermittelten Trägers transfiziert wurden, ist hier zu sehen.

In der Regel wird nur ein Bruchteil der Zellen in einem bestimmten Sichtfeld transfiziert. Hier ist ein repräsentatives Paar von zwei 3T3-Kernen zu sehen, die Nesprin-TS in den spektral ungemischten Venus- und mTFP-Kanälen exprimieren. Ein zusammengeführtes Farbbild der beiden Kanäle wird im Bedienfeld ganz rechts angezeigt.

Hier ist eine repräsentative Probenahme von Nesprin-TS-maskierten Zellkernen von stabil exprimierenden MDCK-Zellen auf gemusterten und unstrukturierten Substraten. Verhältnisbilder sind definiert als das Verhältnis des Venuskanals dividiert durch den mTFP-Kanal und können verwendet werden, um relative quantitative Kraftvergleiche durchzuführen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die DNA-Röhrchen während der Transfektion sorgfältig zu markieren und die Bildgebungsparameter konstant zu halten, während die spektralen Ergebnisbilder aufgenommen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Zellen mit dem Nesprin-Zugspannungssensor transfizieren und spektral aufgelöste Bilder auf dem Computer aufnehmen können FRET-Index, der mit der Kraft auf den Zugkraftsensor korreliert. Obwohl in diesem Fall ein FRET-Sensor für Nesprin verwendet wird, kann er auch auf andere Proteine in der Zelle angewendet werden, bei denen eine Messkraft gewünscht ist.