2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität

Unsere Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit der Interaktion zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix. Zellen können das extrazelluläre Matrixelement produzieren, aber auch abbauen. Der Abbau der Matrix kann bei physiologischen, aber auch bei pathologischen Prozessen wie Neurodegense und der Invasion von Zelltumoren auftreten.

Auf zellulärer Ebene können wir das Vorhandensein von Aktin-basierten Strukturen feststellen, die am Abbau der Matrix beteiligt sind. Und diese Strukturen werden Invadosomen genannt. Invadosom, es ist ein allgemeiner Begriff, der Podosomen in normalen Zellen und Invadopodien in Krebszellen umfasst.

Der Abbau dieses Invadosom kann sich in verschiedenen Formen, Punkten, Aggregaten und Rosetten selbst organisieren. Und die Aktivität dieses Invadosom wird durch Metalloproteinasen wie MMP2 und MT1-MMP gesteuert. Es ist noch lange nicht so, dass das Paar, MMP2, MT1-MMP durch die Kollagenfibrillen Typ 1 aktiviert wird.

Um die Aktivität von Invadosomen zu untersuchen, wurde ein klassischer Zymographie-in-situ-Assay verwendet. Um jedoch die Rolle und den Einfluss von Typ-1-Kollagenfibrillen in Invadosomen zu untersuchen, haben wir uns entschieden, einen neuen Assay zu entwickeln. Zu diesem Zweck haben wir eine gemischte Matrix aus Gelatine und Kollagenfibrillen vom Typ 1 hergestellt.

In diesem Film im ersten Teil zeigt Ihnen Eloide Henriet, wie wir diese Art von Matrix generieren. Im zweiten Teil zeigt Ihnen Zakaria Ezzoukhry, wie wir in der Lage sind, den Einfluss von Kollagenfibrillen vom Typ 1 auf die Morphologie, Bildung und Aktivierung der Invadosomen zu messen. Und im letzten Teil zeigt Ihnen Julie Di Marino, wie wir einen 3D-Kollageninvasions-Assay anpassen.

Ich zeige Ihnen, wie Sie eine gemischte Matrix aus Gelatine und Kollagenfibrillen vom Typ 1 herstellen. Ich werde zwei Arten von gemischten Matrizen machen. Eine, um den Zymographie-In-situ-Assay mit Fluoreszein-Gelatine und Nicht-Fluorescein Typ 1-Kollagen durchzuführen.

Und noch eines, das es uns ermöglicht, die Kollagenfibrillen mit nicht-fluoreszeinischer Gelatine und markierten Kollagenfibrillen sichtbar zu machen. Zur Herstellung der Gelatinematrix aliquotieren Sie 20 Mikroliter Gelatinetröpfchen auf ein Stück Parafilm. Decken Sie jedes Tröpfchen mit einem Deckglas aus autoklaviertem Glas ab.

20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und vor Licht schützen. Für die Gelatinefixierung aliquotieren Sie 40 Mikroliter Tröpfchen mit 0,5 % Glutaraldehyd in PBS. Übertragen Sie mit einer Pinzette mit Gelatine überzogene Deckgläser auf jedes Glutaraldehyd-Tröpfchen.

40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und vor Licht schützen. Nehmen Sie eine Multiwell-Zellkulturplatte und füllen Sie jede Vertiefung mit 500 Mikrolitern sterilem 1X PBS. Legen Sie am Ende der Inkubationszeit jedes Deckglas mit der Gelatineseite nach oben in jede Vertiefung.

Waschen Sie die Deckgläser zweimal für jeweils fünf Minuten in 1X PBS. In diesem Schritt können Deckgläser zum Experimentieren verwendet oder für die spätere Verwendung aufbewahrt werden. Pipettieren Sie 0,4 mg pro ml Kollagen in ein Röhrchen.

Den Fluoreszenzfarbstoff für eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro ml zugeben. Die Lösung wird im Röhrchen gemischt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und unter Schutz vor Licht inkubiert. Mit 1x DPBS auf das Endvolumen verdünnen und 500 Mikroliter der Lösung auf gelatinebeschichtete Deckgläser in einer Multiwell-Platte geben.

Vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Kollagenpolymerisation zu ermöglichen. Nach der Inkubation das überschüssige Kollagen entfernen. Fügen Sie Zellen für ein Endvolumen von 500 Mikrolitern hinzu und inkubieren Sie die Zellen vor der Fixierung bei 37 Grad Celsius.

Diese Art von Matrizen könnte mit anderen Matrixelementen wie Fibronektin, Vitronektin oder Kollagen Typ IV modifiziert werden. Ich für meinen Teil zeige Ihnen, wie Sie Immunfluoreszenz mit Tks5, einem Marker für Invadosomen, durchführen und wie Sie lineare Invadosomen auf Kollagen Typ 1 beschichteten Deckgläsern quantifizieren können. Wir können die Ergebnisse nach der Anzahl der Zellen darstellen, die in linearen Invadosomen vorhanden sind, aber wir können auch die Anzahl der Strukturen in jeder Zelle darstellen.

Fixieren Sie die Deckgläser 10 Minuten lang in 500 Mikrolitern 4%-Paraformaldehyd in PBS. Zweimal mit 1x PBS waschen und die Zellen mit 0,2%Triton X-100 in 1x PBS für 10 Minuten permeabilisieren. Aliquot 50 Mikroliter Tröpfchen Primärantikörperlösung in 4%BSA in 1x PBS auf ein Stück Parafilm.

Legen Sie jedes Deckglas auf ein Tröpfchen. 40 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubieren. Deckgläser zweimal mit 1x PBS waschen und Deckgläser in Sekundärantikörper, Kolloidin und Hoechst-Farbstoff 30 Minuten lichtgeschützt inkubieren.

Nach der Inkubation zweimal mit 1x PBS waschen, gefolgt von destilliertem Wasser, um Salze zu entfernen. Deckgläser mit polymerisierendem Eindeckmedium auf einen Objektträger aufkleben. Lassen Sie den Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, bevor Sie die Bildgebung aufnehmen.

Für die Bildanalyse wird ein Bild von Aktin und Tks5 nacheinander mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Um die Größe und Anzahl der linearen Invadosomen pro Zelle zu quantifizieren, verwenden Sie die ImageJ-Software und das mitgelieferte Makro. Führen Sie zunächst das Makro in ImageJ aus und öffnen Sie das Aktbild.

Öffnen Sie anschließend das Tks5-Image. Legen Sie den Schwellenwert fest und wenden Sie das Makro an. Die analysierten Ergebnisse werden in zwei Tabellen angezeigt.

Die Anzahl der linearen Invadosomen pro Zelle und andere Informationen, wie z. B. die prozentuale Fläche, die von linearen Invadosomen in der Zelle verwendet wird, finden Sie in der Übersichtstabelle. Die Größe jedes linearen Ovadosoms wird in der Ergebnistabelle angegeben. Nach der Quantifizierung der Bilder können wir die Ergebnisse präsentieren, indem wir die Anzahl der Strukturen pro Zelle anzeigen.

Meinerseits passen wir also eine Methode an, um das Vorhandensein von linearen Invadosomen in 3D zu demonstrieren. Wir haben festgestellt, dass das Gel nur aus Kollagen-Eins-Fibrillen besteht, und dieser Assay wird verwendet, um die Zellinvasion im Kollagen-Eins-Kontext zu bewerten. Bereiten Sie Typ-1-Kollagenlösung auf Eis in einer Endkonzentration von zwei mg pro ml vor.

Geben Sie den Fluoreszenzfarbstoff in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Mischen Sie die Lösung und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang lichtgeschützt auf Eis. Anschließend 50 Mikroliter eiskaltes 10x PBS hinzufügen.

Fügen Sie dann 6,25 Mikroliter eiskaltes einmolares Natriumhydroxid hinzu. Fügen Sie steriles Wasser hinzu, um die richtige Konzentration zu erhalten, und mischen Sie die Lösung. Legen Sie die Boyden-Kammereinsätze in eine Multiwell-Zellkulturschale.

Fügen Sie 100 Mikroliter Kollagen hinzu, eine Lösung zu jedem Einsatz. Um das Kollagengel zu polymerisieren, inkubieren Sie die Schale eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie mit Serum angereichertes Zellkulturmedium in jede Vertiefung und platzieren Sie die Einsätze in das Medium.

Aussaat von 30.000 Zellen in serumfreien Medien auf dem Kollagengel. Um die Zellen zu fixieren, geben Sie 4%ige Paraformaldehydlösung in eine leere Vertiefung. Entfernen Sie das Zellmedium aus dem Einsatz, ohne das Kollagengel zu berühren.

Legen Sie den Einsatz mit der 4%igen Paraformaldehydlösung in Vertiefungen und fügen Sie zusätzliche 4%ige Paraformaldehydlösung auf das Kollagengel hinzu. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Fixierung die 4%ige Paraformaldehydlösung entfernen und mit 1x PBS waschen.

Nach dem Waschen sollte das Kollagengel transparent werden. Nun sind die Einsätze bereit für die Immunfluoreszenz. Zuerst die Einsätze abtropfen lassen.

Setzen Sie dann die Einsätze in neue Vertiefungen der Multiwell-Platte ein. Um die Zellen zu permeabilisieren, geben Sie eine Lösung von 0,2% Triton X-100 in 1X PBS für 30 Minuten auf das Kollagengel. Lassen Sie die Einsätze abtropfen.

Mit 1X PBS waschen und eine Stunde lang vor Licht geschützt die primäre Antikörperlösung auf das Kollagengel geben. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung, waschen Sie sie mit 1X PBS und inkubieren Sie das Kollagengel mit der sekundären Antikörperlösung 1,5 Stunden lang lichtgeschützt. Waschen Sie die Sekundärantikörperlösung mit 1X PBS.

Um das Kollagengel für die Montage vorzubereiten, schneiden Sie die Einlegemembran mit einem Skalpell ab. Legen Sie das an der Membran befestigte Kollagengel in eine Glasbodenschale. Es ist wichtig, dass die Oberseite des Gels mit dem Boden der Schale in Kontakt kommt.

Fügen Sie Eindeckmedien und ein Deckglas für die mikroskopische Betrachtung hinzu. Mit diesem Assay konnten wir die Schlüsselrolle des DDR1-Rezeptors bei der Zellinvasion in Kollagen-Ein-Gel nachweisen. Dieser Assay kann auch verwendet werden, um die Wirkung von Medikamenten auf die Zellinvasion zu bewerten.

In unserer anderen Studie haben wir gezeigt, dass allein das Hinzufügen eines neuen Elements der extrazellulären Matrix zu ihrer physiologischen Bestätigung, hier Kollagenfibrillen vom Typ 1, die Morphologie, die molekulare Zusammensetzung und die Aktivität von Invadosomen verändern kann. Mit den verschiedenen Assays, die in diesem Film beschrieben werden, haben wir die Existenz neuer Strukturen demonstriert, einer neuen Organisation von Invadosomen, die wir lineare Invadosomen nannten. Durch die Generierung komplexer und physiologischerer Matrizen ermöglichen wir die Identifizierung neuer Signalwege, die an der Zelladdition, -migration und -invasion beteiligt sind.