Name: Die histologische Quantifizierung der chronischen Myokardinfarktes bei Ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Erfahren Sie die histologische Quantifizierung von Infarktgröße und Linksherzremodellierung bei Ratten mittels systematischer Probenahme und Bildanalyse. Diese Methode ermöglicht präzise morphometrische Bewertung für kardiologische Forschung.

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Die Studie wurde unterstützt vom Schweizerischen Nationalfonds [SNF 310030-149986 an MNG], der Universität Freiburg und dem Spital Freiburg.

Alle Tiere erhielten humane Pflege im Einklang mit der Europäischen Konvention zum Tierpflege. Chirurgische Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit dem Schweizer Tierschutzgesetzes durchgeführt, nachdem die Erlaubnis des Staates Veterinäramt zu erhalten, Fribourg, genehmigt durch das Bundesamt für Veterinärwesen, Schweiz. 1. Herzernte HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter Isofluran-Narkose durchgeführt. Es wurden Anstrengungen unternommen Leiden der Tiere zu verringern. Insbesondere erhielten alle Tiere eine subkutane Injektion von 0,1 mg / kg Buprenorphin Präanästhesie. Das chirurgische Protokoll für Myokardinfarkt inducting wurde bereits an anderer Stelle 13 beschrieben. <ol><li> Führen Sie eine Sternotomie auf einem myocardial Infarkt Tier unter Narkose (intubiert Tier, 2,5% Isofluran, richtige von Pfote Prise Reflex bestätigt Anästhesie). <ol><li> Öffnen Sie das Tier durch die Haut schneiden und dann die Muskelnmit chirurgische Scheren. Schneiden Sie die Rippen auf der linken und rechten Seite, und dann auf die Brust zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die restlichen Adhäsionen nach der vorhergehenden Operation (LAD-Ligation). Schneiden Sie die Aorta und entfernen Sie das Herz. Legen Sie das Gewebe in 1 M KCl (in PBS), und dann waschen Sie es mit PBS. </li></ol></li></ol> 2. Gewebepräparation <ol><li> Setzen Sie das Infarkt Herz in Längsrichtung in einem Acrylrattenherz-Matrix. Halten Sie es bei -20 ° C für 1 Stunde. </li><li> Schneiden Sie das Herz direkt in der Matrix eine Rasierklinge mit einer Quer verwenden. Stellen Sie sicher, jede Scheibe ist 2 mm dick. Schneiden Sie ca. 5 bis 7 Rutschen für jedes Herz (basierend auf dem Umbau Ebene); dies ist eine systematische Probenahme genannt. </li><li> Bei diesem Schritt ist es, die 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung durchführen optional (halten Sie die Ausrichtung des Herzens Scheiben Basis-Spitze). <ol><li> Inkubieren in 1% TTC in PBS für 50 min bei 37 ° C. Inkubieren es in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bis 1 Std. Setzen Sie die Abschnitte between zwei Glasplatten mit 2-mm-Distanzscheiben und nehmen Sie Bilder mit einem stereo Mikroskop gekoppelt mit einer Kamera bei 15-facher Vergrößerung. VORSICHT! Paraformaldehyd ist giftig. </li></ol></li><li> Slide Einfrieren (1 st Option) <ol><li> Setzen Sie jede Folie in einer Kunststoff-Form (10 x 10 x 5 mm) mit Eindeckmittel für die Kryotomie (optimale Schnitttemperatur, OCT), halten Sie die Ausrichtung (der Ort, den Scheitel orientierte Seite des Abschnitts nach unten auf dem Boden der Form). Frieren Sie die Blöcke mit 2-Methyl Dämpfe unter Kühlung mit flüssigem Stickstoff 10 - 15 min. Schließlich lagern Sie das Gewebe bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Paraffinization (2. Option) <ol><li> Platzieren Sie jede Folie in Kassetten Einbetten (halten Sie die Ausrichtung, indem die Spitze orientierte Seite des Abschnitts nach unten auf dem Boden der Kassette) und dann in 4% PFA für 24 Stunden. Legen Sie es in einem Gewebe-Prozessor-Maschine über Nacht. <ol><li> Inkubieren in 70% igem Ethanol für 2 Stunden. Inkubieren es in ethan95% für 2 Stunden ol. Inkubieren es in Ethanol 100% für 3 Stunden. Inkubieren es in Xylol 4 Stunden. Inkubieren es in Paraffin (geschmolzenes bei 60 ° C in einem Ofen) für 5 Std. Schließlich machen Blöcke durch jedes Herz Dia in Paraffin eingebettet wird. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Masson-Goldner Trichromfärbung <ol><li> Machen Sie Gewebeschnitte aus Paraffinblöcken mit einem manuellen Mikrotom (Dicke: 5 um) oder von Oktober Blöcke mit einem Kryostaten auf -18 ° C (Dicke: 7 &amp; mgr; m). </li><li> Stain eine Folie aus jedem Herzteil für jede Ratte (3 bis 4 Querschnitte pro Folie) mit Masson-Goldner Trichrom - Färbung (siehe Anhang). HINWEIS: Starten Sie von diesem Schritt für die Paraffinschnitten. <ol><li> Schmelzen die Objektträger bei 60 ° C in einem Ofen. Unter einem Abzug Deparaffinisieren sie in Xylol zweimal für jeweils 10 min. Rehydrieren sie in 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und destilliertem Wasser für 3 min pro. HINWEIS: Starten Sie von diesem Schritt für die Kryoschnittess. </li><li> Fix sie in Bouin-Lösung über Nacht. Dann spülen Sie Leitungswasser für 10 in Laufen - 15 min. Spülen Sie sie in destilliertem Wasser. Inkubieren sie in Mayers Hämatoxylin für 3 min. </li><li> Entfernen Sie die Folien und lassen Sie sie in destilliertem Wasser für 5 min. Dann brüten sie in Säure Fuchsin-Ponceau für 5 min. Spülen Sie sie in 1% Essigsäure für 1 min. </li><li> Als nächstes für 1 min sie in Phosphomolybdänsäure Orange G inkubiert. Spülen Sie sie in 1% Essigsäure für 1 min, brüten sie in hellgrünen Farbstoff für 10 min, und spülen sie in 1% Essigsäure für 1 min. </li><li> Dehydrieren sie in 70% Ethanol (30 sec), 95% Ethanol (30 sec) und 100% igem Ethanol (5 min). Geben Sie einen Tropfen eines harzigen Eindeckmedium auf den Gewebeschnitten, bedecken sie mit Deckgläsern, und lassen Sie sie trocknen. </li></ol></li></ol> 4. Infarktgrößenanalyse <ol><li> Erwerben Sie ein Bild von jeder Folie auf einem Stereomikroskop (15-facher Vergrößerung) gekoppelt mit einer Kamera. Fotografieren Sie ein Lineal mit der gleichen Einstellungs. </li><li> Verwenden der Bildanalyse-Software die Narbendicke in der Mitte des Infarkts, das Septum Dicke zu messen, den linken Ventrikel (LV) Hohlraumbereich, der Infarktbereich und dem Gewebe LV Bereich verwendet wird. <ol><li> Stellen Sie die Waage mit dem Lineal Bild (Abbildung 1A). <ol><li> Klicken Sie auf Messungen dann Set Umrechnungsfaktor wählen. Zeichnen Sie eine Linie auf der Kalibrierungs bar. Rechtsklick auf das Bild und klicken Sie auf End - Kalibrierung. Notieren Sie sich den Bar - Wert und dann auf OK klicken. </li></ol></li><li> Wählen Sie die LV aus dem gefärbten Herz Bild (Abbildung 1B). Verwenden Sie das Multiple - Segment - Tool. Wählen Sie den LV Punkt-für-Punkt, und dann einen Rechtsklick Kopieren / Einfügen überall. </li><li> Messen Sie die Narbe und Septum Dicke mit dem einzigen Segment Messwerkzeug (1C </strong&gt;). </li><li> Automatische Erkennung der LV Hohlraum, Infarkt und LV Bereiche der automatischen Bereich Messwerkzeug im RGB - Modus (Abbildung 1D) verwendet wird . <ol><li> Klicken Sie auf das Werkzeug. Aktivieren Sie nur Grenzen und Angrenzend im RGB - Modus. Schließlich, klicken Sie in den Bereich von Interesse, es zu erkennen. Falls erforderlich, Präzisionswerkzeuge. </li></ol></li></ol></li><li> Berechne die Infarktgröße als das Verhältnis der Infarktbereich zum Bereich LV. </li><li> Berechnen Sie den Erweiterungsindex wie folgt: [LV Hohlraumbereich / gesamte LV-Bereich] / [Infarktdicke / Septum Dicke], mit der gesamten LV-Bereich einschließlich der LV Hohlraum und LV Gewebebereiche. </li><li> Schließlich berechnen für jedes Herz ein &quot;durchschnittlich&quot; wie folgt: [durchschnittlich Erweiterungsindex aus den Infarkt Dias] * [Anzahl der Infarkt Dias / Gesamtzahl der Folien]. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Fibrotische Gewebe genau in einem chronischen MI Rattenmodell bewertet werden analysiert unter Verwendung von systematischen Probenahme des geernteten Herz und Bild von Trichromie-gefärbten histologischen Schnitten von der Basis bis zur Spitze erhalten. Zwei Schritte sind besonders wichtig für ein erfolgreiches Protokoll-Implementierung. Erstens ermöglicht die Verwendung von KCl für Herz Ernten des Herzmuskels in einem entspannten ...

Myokardinfarkt (MI) ist eine führende Ursache für Tod und Behinderung weltweit. Die koronare Herzkrankheit ist die Hauptursache; MI ergibt sich aus Ischämie in Folge einer koronaren Ereignissen wie Okklusion. Wenn Reperfusion nicht innerhalb der ersten 6 Stunden durchgeführt, induziert Ischämie irreversible myocardial necrosis. Bei Patienten, stützt sich die Charakterisierung von MI auf verschiedene Diagnose - Tools, einschließlich der klinischen Symptome, der Elektrokardiographie, die Beurteilung der Plasmaspiegel von Biomarkern, Echokardiographie, MRT - Bildgebung und histologische Analysen 1. nach dem Zeitpunkt der myokardialen Nekrose relativ zu der Zeit der Koronarverschluss akuten und chronischen MI als zwei verschiedene Phasen Verletzungs eingestuft. Die akute Phase, während der ersten 7 Tage stattfindet, wird mit dem Verlust von Kardiomyozyten, ausgedehnte Entzündungen, und die Rekrutierung von Fibroblasten. Die subakuten Phase durch Heilung des Herzgewebes und die Bildung einer Narbe gekennzeichnet, auftrittzwischen 1 und 4 - 6 Wochen. Erweiterung des Infarkts, Ventrikel Wandverdünnung und Ventrikel Dilatation charakterisieren die chronische Phase. Umfangreiche Neugestaltung des linken Ventrikels führt schrittweise in schwerer Herzinsuffizienz 2. MI durch permanente linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) Ligatur stellt die Standard-Nagetiermodell von chronischem Myokardinfarkt induziert. Die koronare Ligatur ahmt die Koronarokklusion. Die Größe des Infarkts hängt von der Stelle der Ligatur. Charakterisierung von myokardialen ischämischen Verletzung in einem Nagetiermodell klassisch unter Verwendung von Biomarkern Plasmaspiegel, wie Troponin ausgeführt I und T 3, Echokardiographie, MRT und Histologie 4,5. Biomarkers Pegel werden mit dem Ausmaß der Kardiomyozyten Tod korreliert. Echokardiographie wertet die linke Beeinträchtigung der Ventrikelfunktion aus regionalen Wandbewegungsstörungen. Zusätzlich können nicht-invasive Bildgebungsverfahren, wie MRI oder hochauflösendeEchokardiographie, erlauben die Beurteilung der Verringerung der Wandbewegung, das Volumen des Narbenbereich mit reduzierten Perfusion und vitales Myokard und der Wandverdünnung. LV Abmessungen ermöglichen die genaue Auswertung der Infarktgröße. Schließlich kann die Quantifizierung der lebenden und toten Myokard durchgeführt werden post mortem spezifischen Flecken von histologischen Schnitten von geernteten Herzen verwendet und ermöglicht die Überprüfung der Infarktgröße (IS). Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die Auswertung des Infarkts Erweiterungsindex (EI) 6. Die EI wird mit dem transmuralen Infarkt und beginnt innerhalb der ersten 3 Tagen verbunden. Die EI wird durch eine progressive Verringerung der Wandstärke, einer Erhöhung in der LV Hohlraumgröße und folglich Veränderungen in LV Form charakterisiert. Um die therapeutische Wirksamkeit von neuartigen Behandlungen zu bewerten - insbesondere die regenerative Strategien basierend auf Zellen, Matrizen und Genübertragung-genaue Beurteilung von MI bei Nagetieren ist von größter Bedeutung.Wenn auf einem einzigen Querschnitt an der Papillarmuskel Ebene erhalten gemessen, kann die IS Größe kann aufgrund der großen Variabilität vorgespannt werden, die nach LAD-Ligation in die Infarktentwicklung vorhanden ist; der Scheitel Infarkt abgedeckt werden, könnten dann. Wichtig sind für Mäuse 7-9 oder Ratten beschrieben, genauere Methoden zu bestimmt MI Größe 10. Dennoch ist nicht ausreichend, um genau LV Umbau oder therapeutisch induzierten Reduktionen (oder Verhinderungen) der Umbau zu quantifizieren. Tatsächlich wird üblicherweise als Prozentsatz der gesamten LV Volumen auf Querschnitte des Herzens beurteilt ausgedrückt. Obwohl dieses Verfahren zur Behandlung von akuter MI gültig ist, bleibt die Ausdünnung der LV Wand während des Umbaus auftretenden 11,12 untersucht. Eine vollständige morphometrische Quantifizierung der Infarktgröße und strukturelle Änderungen sollten einige Parameter, wie endokardialen und epikardialen Längen und Durchmesser sowie Infarkt und gesunde Bereiche zu quantifizieren. Wir beschreiben eine methodische ca.oach genau zu beurteilen, MI und Umbau in einem chronischen Rattenmodell.

<table><tbody><tr><td>Rattenherzmatrix aus Acryl 2 mm</td><td>72-5015</td><td>Harvard Appartus</td><td></td></tr><tr><td>Inspira fortschrittliches volumengesteuertes Beatmungsgerät</td><td>Harvard Apparat</td><td>557058</td><td></td></tr><tr><td>Katheter Insyte 14 G</td><td>BD</td><td>381267</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T</td><td>. BDHA361603E</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>T8877-10G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Mayer Hämatoxylin</td><td>MHS32-1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Acid Fuchsin CI 42685</td><td>F8129-50G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau Xylidin CI 16150</td><td>P2395-25G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Orange G CI 16230</td><td>O3756-100G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Hellgrün CI 42095</td><td>L5382-25G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>P9333-500G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>10315083</td><td>HoneyWell</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>10303990</td><td>HoneyWell</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>M32631-1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Stereogisches Mikroskop</td><td>SM2800</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>99340</td><td>Reactolab</td><td></td></tr><tr><td>Einbettkassette</td><td>K113.1</td><td>Carl Roth</td><td></td></tr><tr><td>Bersoft Bildmesssoftware</td><td></td><td>Bersoft.com</td><td>Lizenzierte Software</td></tr></tbody></table>

die histologische quantifizierung der chronischen myokardinfarktes bei ratten

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myokardinfarkt ist definiert als Tod von Kardiomyozyten aufgrund einer anhaltenden Ischämie; eine Entzündungsreaktion und Narbenbildung (Fibrose) folgen der ischämischen Verletzung. Nach der anfänglichen akuten Phase verändert der chronische Umbau des linken Ventrikels (LV) die Struktur und Funktion des Herzens. Die permanente Koronarligatur bei Kleintieren wurde häufig als Referenzmodell für ein chronisches Modell des Myokardinfarkts verwendet. Die Ausdünnung der Infarktwand entwickelt sich progressiv zu einer transmuralen Fibrose. Die histologische Beurteilung der Infarktgröße wird häufig durchgeführt; Dennoch fehlt eine Standardisierung der Methoden zur Quantifizierung. Wichtige methodische Aspekte, wie die Anzahl der analysierten Abschnitte und die Probenahme- und Quantifizierungsmethoden, werden in der Regel nicht beschrieben und schließen daher einen Vergleich zwischen Untersuchungen aus. Zu oft wird die Quantifizierung an einem einzigen Schnitt durchgeführt, der auf Höhe der Papillarmuskulatur erhalten wird. Da neuartige Strategien zur Reduzierung der Infarktausdehnung und des Umbaus untersucht werden, besteht ein wichtiger Bedarf an der Standardisierung genauer Herzprobenahmeprotokolle. Wir beschreiben eine genaue Methode zur Quantifizierung der Infarktgröße anhand einer systematischen Probenahme von geernteten Rattenherzen und Bildanalysen von trichromatisch gefärbten histologischen Schnitten, die von der Basis bis zur Spitze entnommen wurden. Wir liefern auch den Nachweis, dass die Berechnung des Expansionsindex (EI) eine Beurteilung der Infarktgröße unter Berücksichtigung von Veränderungen des linken Ventrikels während des Umbaus ermöglichte.

Sechs Wochen nach der LAD-Ligation, Herzen wurden von Lewis-Ratten geerntet. 2-mm-Gewebeschnitte wurden von der Spitze zur Basis erhalten. Eine TTC - Färbung Verfahren wurde ausgeführt , um den Infarktbereich sichtbar zu machen, die in weiß erscheint, und das gesunde Myokard, die in rot (Abbildung 2) erscheint. Je nach der Stelle der Ligation der LAD variiert der Infarktgröße. Für große MI wurden transmurale Infarkte von der Spitze zur Basis (2A) beobach...

Die postmortale Beurteilung des Myokardinfarkts (MI) bei Nagetieren basiert auf der Quantifizierung des Infarkts an gefärbten Herzschnitten. Wir beschreiben eine genaue Methode zur Quantifizierung der Infarktgröße unter Verwendung systematischer Probenahmen von entnommenen Rattenherzen von der Basis bis zur Spitze und Bildanalysen von trichromgefärbten histologischen Schnitten.

Die histologische Quantifizierung der chronischen Myokardinfarktes bei Ratten

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Das übergeordnete Ziel dieses histologischen Verfahrens besteht darin, mithilfe eines Rattenmodells für Myokardinfarkt eine morphometrische Quantifizierung des Infarktexpansionsindex und der strukturellen Herzparameter durchzuführen, um die Infarktgröße und die Umbildung des linken Ventrikels zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im kardialen Forschungsbereich zu beantworten, beispielsweise die Wirkung regenerativer Therapien nach einem Myokardinfarkt oder neuartige Strategien zur Verringerung der Infarktexpansion. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der systematischen Stichprobenentnahme aus dem entnommenen Rattenherzen, um die Infarktgröße genau zu bestimmen und die Veränderungen am linken Ventrikel während der Remodeling-Prozesse zu berücksichtigen.Mit dieser Methode lässt sich die Infarctgröße im chronischen Rattenmodell des Myokardinfarkts untersuchen. Sie kann außerdem auf Mäuse oder andere ischämische Modelle angewendet werden, wie beispielsweise den akuten Myokardinfarkt oder die Ischämie-Reperfusion. Um dieses Verfahren zu beginnen, führen Sie eine Sternotomie an einem unter Anästhesie stehenden Tier mit Myokardinfarkt durch.Erstellen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt durch die Haut und die Muskulatur entlang des Brustbeins. Anschließend schneiden Sie die Rippen auf der linken und rechten Seite durch, um den Brustkorb zu entfernen. Danach entfernen Sie die Adhäsionen, die nach der LAD-Ligatur verblieben sind.Schneiden Sie die Aorta ab und entfernen Sie das Herz, dann geben Sie das Gewebe für weniger als eine Minute in PBS mit einem Mol Kaliumchlorid, bevor Sie es mit PBS waschen. Um das Gewebe zu erhalten, sollte PBS im Inneren der Ventrikel sorgfältig entfernt werden. Anschließend überführen Sie das infarzierte Herz in eine akrylische Rattenherzmatrix und positionieren es longitudinal.Danach bei minus 20 Grad Celsius eine Stunde lang lagern. Für eine systematische Probenahme schneiden Sie das Herz nach einer Stunde mithilfe eines Rasiermessers direkt in der Matrix. Stellen Sie sicher, dass jeder Schnitt zwei Millimeter dick ist.Als Nächstes wird die TTC-Färbung durchgeführt, indem die Schnitte für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in 1 % TTC inkubiert werden, gefolgt von einer Inkubation in 4 % PFA für 20 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur. Danach werden die Schnitte zwischen zwei Glasplatten mit 2-Millimeter-Abstandshaltern platziert, und Bilder mit einem stereologischen Mikroskop, das mit einer Kamera gekoppelt ist, bei 15-facher Vergrößerung aufgenommen. Mit dem TTC-Färbungsverfahren wurde der Infarktbereich sichtbar gemacht, der weiß erscheint, sowie das gesunde Myokard, das rot erscheint.Bei einem großen Myokardinfarkt wurden transmurale Infarkte von der Herzspitze bis zur Basis beobachtet. Kleinere Infarkte zeigten weißes nekrotisches Gewebe, das von der Spitze bis zum mittleren Bereich des Herzens sichtbar war. Bei kleinen, nicht transmuralen Infarkten wurde fibröses Gewebe nur in ein oder zwei Schnitten von der Herzspitze nachweisbar.Um die Schnitte einzufrieren, geben Sie jeden Schnitt in eine Kunststoffform mit Einbettmedium für die Kryotomie und positionieren Sie die Spitze nach unten in der Form. Einfrieren der Blöcke mit 2-Methylbutan-Dämpfen unter flüssigem Stickstoffkühlen für 10 bis 15 Minuten. Danach die Gewebe bei minus 80 Grad Celsius lagern.Um die Paraffinierung durchzuführen, legen Sie jeden Schnitt mit der Spitze nach unten in eine Einbettkassette und bewahren Sie die Kassetten 24 Stunden lang in 4 % PFA auf. Danach stellen Sie sie über Nacht in einen Gewebeprozessor. Sobald die Verarbeitung abgeschlossen ist, stellen Sie Blöcke her, indem Sie jeden Herzschnitt in Paraffin einbetten.Bei diesem Verfahren bereiten Sie 5 Mikrometer dicke Gewebeschnitte aus den Paraffinblöcken mit einem manuellen Mikrotom vor. Färben Sie danach einen Objektträger von jedem Herzpräparat für jede Ratte mit der Masson-Goldner-Dreifachfärbung. Zum Aufschmelzen der Paraffinschnitte erhitzen Sie die Gewebeproben im Ofen auf 60 Grad Celsius.Unter einem Abzug entparaffinieren Sie sie zweimal für jeweils zehn Minuten in Xylol. Anschließend werden sie für jeweils drei Minuten in 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol und dann in destilliertem Wasser rehydriert. Die entparaffinisierten Schnitte und die Kryoschnitte fixieren Sie über Nacht in Bouin-Lösung.Am folgenden Morgen waschen Sie sie mit fließendem Leitungswasser für 10 bis 15 Minuten ab und spülen Sie anschließend erneut mit destilliertem Wasser. Die Fixierung mit Bouin ist der wichtigste Schritt, um eine hervorragende Goldner-Färbung zu gewährleisten. Inkubieren Sie sie drei Minuten lang in Mayer’s Hämatoxylin.Nach drei Minuten die Objektträger entfernen und fünf Minuten lang in destilliertem Wasser belassen. Anschließend sie fünf Minuten lang in Ponceau-Sauffuchsin inkubieren, bevor sie eine Minute lang mit 1 %iger Essigsäure gespült werden. Danach die Schnitte eine Minute lang in Phosphormolybdänsäure-Orange G inkubieren und anschließend erneut eine Minute lang mit 1 %iger Essigsäure spülen.Inkubieren Sie die Schnitte zehn Minuten lang in grüner Färbeflüssigkeit und spülen Sie sie anschließend eine Minute lang in 1 %iger Essigsäure. Schließlich dehydrieren Sie die Schnitte nacheinander 30 Sekunden in 70 %igem Ethanol, 30 Sekunden in 95 %igem Ethanol und fünf Minuten in 100 %igem Ethanol. Geben Sie einen Tropfen harzartiges Eindeckmedium auf die Gewebeschnitte, decken Sie sie mit Deckgläsern ab und lassen Sie sie trocknen.In diesem Schritt wird jeweils ein Bild von jedem Objektträger mit einem an eine Kamera angeschlossenen Stereomikroskop bei 15facher Vergrößerung aufgenommen. Unter denselben Einstellungen wird ein Lineal fotografiert. Dünne fünf-Mikrometer-Schnitte von jeder Herzprobe wurden angefertigt und mit der Masson-Goldner-Trichrom-Färbung gefärbt.Gesundes Gewebe erschien rot und das Bindegewebe grün. Verwenden Sie als Nächstes die Bildanalyse-Software, um die Narbendicke in der Mitte des Infarkts, die Septumdicke, die Fläche des linken Ventrikels, die Infarktfläche und die LV-Gewebsfläche zu messen. Stellen Sie dazu den Maßstab mit dem Linealbild ein.Klicken Sie auf Messungen und wählen Sie Umrechnungsfaktor festlegen aus. Zeichnen Sie eine Linie auf den Kalibrierbalken. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und dann auf Kalibrierung beenden.Notieren Sie den Balkenwert und klicken Sie dann auf „OK“. Verwenden Sie das Mehrfachsegment-Werkzeug, um den LV-Punkt für Punkt auszuwählen, und klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste, um ihn an einer beliebigen Stelle einzufügen. Danach messen Sie die Narben- und Septikumdicke mithilfe des Einzelsegment-Messwerkzeugs. Anschließend erkennen Sie automatisch den LV-Hohlraum, den Infarkt und die LV-Flächen mit dem automatischen Flächenmesswerkzeug im RGB-Modus. Aktivieren Sie nur Ränder und angrenzende Bereiche im RGB-Modus. Klicken Sie anschließend innerhalb des interessierenden Bereichs, um diesen zu erkennen. Danach berechnen Sie die Infarktgröße als Verhältnis der Infarktfläche zur LV-Fläche.Dann berechnen Sie den Expansionsindex mithilfe dieser Formel. Abschließend berechnen Sie einen Mittelwert für jedes Herz unter Verwendung der dargestellten Formel. Der aus der Goldner-Färbung berechnete Expansionsindex ist ein geeigneter Parameter zur Beurteilung der Infarktentwicklung.Wie in der Abbildung gezeigt, korreliert es mit der Größe des Infarkts, ausgedrückt als Prozentsatz des linken Ventrikels, und mit der Ejektionsfraktion, gemessen mittels Echokardiographie. In den Diagrammen sind die lineare Regression und die 95 %‑Konfidenzintervalle dargestellt. Der Infarktexpansionsindex wurde wie in der hier angegebenen Formel beschrieben berechnet.Die gesamte LV-Fläche wurde als kombinierte LV-Hohlraum- und LV-Gewebsfläche gemessen. Der Prozentsatz des Infarkts wurde wie dargestellt berechnet. Die Funktion wurde sechs Wochen nach LAD-Ligatur mittels hochauflösender Echokardiographie beurteilt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine systematische Probennahme des Herzens durchführt und wie man die Infarktgröße anhand einer Bildanalyse von Färbungsschnitten beurteilt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Zahlreiche genetische Manipulationen und / oder intramyokardialen Injektionen von Genen, Proteinen, Zellen und / oder Biomaterialien basieren auf die Dimension der Zeit in Studien zur akuten Ischämie / Reperfusion und chronischer Umbau in Mäusen überlagert. Dieses Video zeigt die mikrochirurgische Verfahren für die Ischämie / Reperfusion, permanent koronare Ligation und intramyokardialen Injektion Studien.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Dieses Protokoll beschreibt die Schweine-Myokardinfarkt (MI)-Modell unter Verwendung eines 90 min geschlossener Brust koronare Ballon Okklusion der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD), gefolgt von der Reperfusion. Außerdem wird das Protokoll für mehrere Zielgrößen, wie Herzfunktion, Hämodynamik, mikrovaskuläre Widerstand und der Infarktgröße, sind ebenfalls dargestellt.

Myokardinfarkt und Functional Outcome Assessment in Schweine

Ein hochgradig reproduzierbares Modell für Myokardinfarkt bei Mäusen mit minimalinvasiven Manipulationen wird beschrieben. Das Modell kann einfach durchgeführt werden, was zu einer hohen Reproduzierbarkeit und Überlebensrate führt. Somit wird das beschriebene Modell die Anzahl der benötigten Tiere reduzieren, wie es das 3R-Prinzip (Replacement, Refinement and Reduction) verlangt.

Minimal-invasive chirurgische Verfahren zur Induktion Myokardinfarkt in Mice

Diese Methode beschreibt die Verwendung der Quanten-Mikro-Computertomographie (MicroCT) zur Beurteilung der kardialen Morphologie, Funktion, Durchblutung, des Stoffwechsels und der Lebensfähigkeit mit jodiertem Kontrastmittel bei Mäusen mit experimentell induzierter myokardialer Ischämie. Die Technik kann für die zerstörungsfreie longitudinale Hochdurchsatz-Bildgebung in vivo verschiedener Tiermodelle menschlicher Herzerkrankungen eingesetzt werden.

In Vivo quantitative Bewertung der myokardialen Struktur, Funktion, Perfusion und Lebensfähigkeit Mit Herz Micro-Computertomographie

Zuverlässige und genaue Erfolgskontrolle ist der Schlüssel für die Übersetzung der präklinischen Therapien in die klinische Behandlung. Das aktuelle Dokument beschreibt, wie in einem Schweine akutem Myokardinfarkt Modell drei klinisch relevanten primären Outcome-Parameter der Herzleistung und Schaden zu beurteilen.

Primärer Ergebnisbeurteilung in einem Schwein Modell eines akuten Myokardinfarkts

Hier zeigen wir ein Protokoll zur Stichprobenverfahren eine etablierte porcinen Modell der akuten Myokardinfarkt zu standardisieren, um der translationalen Wertsteigerung für das Verständnis der Pathophysiologie der myokardialen Ischämie/Reperfusion Verletzungen und neuartige Medikamenten-Kandidaten zu testen.

Verbesserung der einen geschlossenen Kasten porcinen Myokardinfarkt Modell durch Standardisierung der Gewebe und Blut Stichprobenverfahren

Hierin beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren, das zeigt, wie eine dauerhafte Ligation der links-vorderen absteigenden Herzkranzgefäße bei Mäusen erreicht werden kann. Dieses Modell ist von hoher Relevanz für die Untersuchung der Pathophysiologie des Myokardinfarkts und der damit einhergehenden biologischen Prozesse.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Unter angemessener Anästhesie wurde das Mäuseherz durch den Interkostalraum externalisiert, und der Myokardinfarkt wurde erfolgreich durch Ligatur der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) unter Verwendung von Materialien induziert, die in den meisten Labors leicht verfügbar sind.

Eine modifizierte einfache Methode zur Induktion von Myokardinfarkt bei Mäusen

Der aktuelle 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Test führt ein verfeinertes TTC-Färbungsprotokoll ein, das die Analyse der Myokardinschäden mit mikroskopischer Auflösung ermöglicht und hochwertige Bilder erzeugt, die eine genaue und zuverlässige Bewertung der Infarktgröße und der Lebensfähigkeit der Kardiomyozyten auf zellulärer Ebene ermöglichen.

Ein mikroskopischer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Test für eine genaue und zuverlässige Analyse der Myokardinverletzung

Das Rattenmodell der akuten Myokardinfarkt (AMI) ist nützlich, um die Folge eines MI auf die kardiale pathophysiologischen und physiologischen Funktion zu untersuchen.

Akuter Myokardinfarkt bei Ratten

Erfahren Sie die histologische Quantifizierung von Infarktgröße und Linksherzremodellierung bei Ratten mittels systematischer Probenahme und Bildanalyse. Diese Methode ermöglicht präzise morphometrische Bewertung für kardiologische Forschung.

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